專利名稱：一種人工透明帶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種人工透明帶。本發(fā)明還涉及所述人工透明帶的制備方法和用途。此外，本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)非人胚胎的方法、一種移植非人胚胎的方法、以及一種非人動(dòng)物手工克隆方法。
背景技術(shù)：
手工克隆技術(shù)是一項(xiàng)革新性克隆技術(shù),是由Gdibor Vajta教授及其同事創(chuàng)建于2001年,并在澳大利亞和南非成功得到了健康克隆牛后代(Vajta G, et al. Production ofa healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulation andcarbon dioxide incubators using handmade cloning (HMC) and submarine incubationsystem (SIS). Theriogenology 2004 ；8 :1465-72.),隨后被用在克隆豬的生產(chǎn)，之后在2007年，Y Du等又將該技術(shù)成功應(yīng)用到豬的體細(xì)胞克隆中(Y Du, et al. Piglets bornfrom handmade cloning, an innovative cloning method without micromanipulation.Theriogenology 2007;68:1104-10.)。手工克隆技術(shù)的主要步驟是1)卵母細(xì)胞體外成熟；2)成熟卵母細(xì)胞核去除；3)去核卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞融合成胚胎(重構(gòu)胚)；4)將重構(gòu)胚于體外培養(yǎng)，發(fā)育至囊胚；5)將囊胚移植于代孕母體。6)囊胚在代孕母體中繼續(xù)發(fā)育成完整個(gè)體。其中，在步驟2)中成熟卵母細(xì)胞核去除時(shí)，先采用pronase鏈酶蛋白酶進(jìn)行處理，以消化透明帶。透明帶(zona pellucid)是在哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生期間形成的、圍繞在卵子周圍的一層透明的膜狀保護(hù)層，其由濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞的分泌物形成，可啟動(dòng)頂體反應(yīng)，在受精中起重要作用。在傳統(tǒng)克隆技術(shù)中，由于有透明帶的保護(hù)，胚胎在一細(xì)胞期就可以移植到體內(nèi)，所以在體外培養(yǎng)的時(shí)間更短，發(fā)育能力會(huì)更強(qiáng)。但是傳統(tǒng)克隆主要依賴顯微操作儀，不但操作復(fù)雜，對(duì)操作人員要求非常高，而且顯微操作儀價(jià)格昂貴，效率低。與傳統(tǒng)的克隆技術(shù)相比，手工克隆技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)它擺脫了對(duì)顯微操作儀的依賴，所需儀器的成本僅僅是傳統(tǒng)克隆的十分之一；操作簡(jiǎn)單，快速，對(duì)操作人員的要求較低；克隆胚胎產(chǎn)出穩(wěn)定高效。由于操作簡(jiǎn)單且不依賴于復(fù)雜儀器，該技術(shù)擁有廣泛的產(chǎn)業(yè)化前景，是目前唯一可能實(shí)現(xiàn)克隆技術(shù)自動(dòng)化的手段。但是，手工克隆技術(shù)由于其固有特點(diǎn)——重構(gòu)胚(將成熟卵母細(xì)胞去核處理，與供體細(xì)胞進(jìn)行融合重新組成的胚胎)的透明帶在操作中被消化，失去了透明帶的保護(hù)，在后續(xù)體外培養(yǎng)時(shí)容易發(fā)生胚胎粘連現(xiàn)象。Gabor Vajta 教授發(fā)明的 WOW(Well of well) (Vajta G, et al. New method forculture of zona-included or zona-free embryos :the well of the well (WOff) system.Mol Reprod Dev 2000 ；55 =256-64.)方法解決了這一難題，使手工克隆胚能在體外發(fā)育到正常的囊胚階段。WOW方法是在培養(yǎng)盤孔中鑿小孔，然后將胚胎放入小孔中培養(yǎng)，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)透明帶的重構(gòu)胚不會(huì)發(fā)生粘連現(xiàn)象，能夠順利發(fā)育到囊胚階段。然而,與傳統(tǒng)克隆技術(shù)相比,使用WOW方法的手工克隆技術(shù)仍然存在不足。一是所打的孔壁沒(méi)有天然透明帶光滑，二是用這種方法只能移植第5-6天處于囊胚階段的胚胎(這是因?yàn)槭止た寺〖夹g(shù)生產(chǎn)的重構(gòu)胚一般都沒(méi)有透明帶，在發(fā)育早期如果相互接觸，彼此會(huì)發(fā)生粘連現(xiàn)像，長(zhǎng)成一團(tuán)，移到受體中不能發(fā)育成完整個(gè)體，用WOW方法可使其彼此隔開培養(yǎng)，直至在第5-6天發(fā)育成囊胚，這時(shí)彼此接觸才不會(huì)發(fā)生粘連現(xiàn)象，移至體內(nèi)才能繼續(xù)發(fā)育)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，環(huán)境非常重要，比如溫度，氧氣濃度，PH值，滲透壓等各種生長(zhǎng)因子都能影響胚胎的進(jìn)一步發(fā)育能力，而相比于體外培養(yǎng)，母體顯然能提供更全面的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和更適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，因此胚胎在體外停留的時(shí)間越短，對(duì)其發(fā)育越為有利。因此，WOW方法仍然不能很好地滿足手工克隆以及胚胎移植的需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明應(yīng)用瓊脂糖(agarose)制造出人工透明帶，克服了現(xiàn)有手工克隆技術(shù)的固有缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了能夠移植一細(xì)胞期的胚胎(例如重構(gòu)胚)的技術(shù)效果。由此提供了下述發(fā)明一種人工透明帶，其為分布有一個(gè)或多個(gè)空腔的瓊脂糖凝膠，所述空腔能 夠容納一細(xì)胞期的非人胚胎，并且所述空腔有開口，所述開口能夠移植入一細(xì)胞期的胚胎，即所述空腔的容積大于一細(xì)胞期的胚胎的體積，所述開口的內(nèi)徑大于一細(xì)胞期的胚胎的外徑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人胚胎為豬胚胎，具體地，為豬重構(gòu)胚。具體地，所述空腔的內(nèi)徑為30(^111-50(^111，更具體地，為35(^111-45(^111，進(jìn)一步具體地，為380μπι-420μπι。所述空腔的分布并不特別限定，優(yōu)選地，所述空腔以單層分布。所述開口的內(nèi)徑為20(^111-40(^111，更具體地，為25(^111-35(^111，進(jìn)一步具體地，為280 μ m-320 μ m0空腔和開口的形狀并不特別限定。其中，所述空腔的形狀可以是球形或近似球形，也可以是橢球形或近似橢球形，也可以是其它形狀；所述開口的形狀可以是十字形，也可以是其它形狀。所述瓊脂糖并不特別限定，高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)的都可以。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述瓊脂糖凝膠的濃度為適當(dāng)濃度，具體地，為1% -3% g/mL (瓊脂糖重量/凝膠體積,下同)，更具體地,為I. 5% -2. 5% g/mL,進(jìn)一步具體地，為1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、或2.5% g/mL ；在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，為2% g/mL。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將人工透明帶置于胚胎培養(yǎng)液中或者向所述空腔中注入胚胎培養(yǎng)液，并且在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡；具體地，在如下條件下平衡濕度90%-100%、溫度371-391、0)2 4% -6%, O2 5%-20%，平衡時(shí)間為 24-72 小時(shí)；優(yōu)選地，使人工透明帶的空腔中充滿胚胎培養(yǎng)液。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述人工透明帶在如下條件下平衡濕度98%-100%、溫度38. 5°C、C02 5%,O2 5%，平衡時(shí)間為48小時(shí)。所述胚胎培養(yǎng)液的加入量為大于空腔體積的50 %、60 %、70 %、或80 %，優(yōu)選地，胚胎培養(yǎng)液的加入量為大于空腔體積的90%，更優(yōu)選地，胚胎培養(yǎng)液的加入量為空腔體積的100%，SP充滿空腔。具體地，所述胚胎培養(yǎng)液可以是PZM-3、PZM-4、PZM-5、NCSU-23、或EBSS。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述人工透明帶還包括支持瓊脂糖凝膠的載體；具體地，所述載體為細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)皿，更具體地，所述細(xì)胞培養(yǎng)板是4孔板、6孔板、8孔板、10孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，是4孔板。本發(fā)明的人工透明帶可以在2°C_8°C存放，優(yōu)選在4°C存放。為了保持使人工透明帶不干燥，優(yōu)選將其浸泡在無(wú)菌緩沖溶液(例如Tio或PZM-3溶液)中。本發(fā)明的另一方面涉及一種制備人工透明帶的方法，包括下述步驟A.制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠溶液，并用所述的瓊脂糖凝膠溶液制作能夠容納一細(xì)胞期胚胎的氣泡；B.使步驟A中的氣泡冷卻，直至氣泡凝固；C.使步驟B中的凝固氣泡中的氣體逸出，形成具有開口的空腔；可任選地，還包括下述的步驟D，D.將步驟C中得到的具有空腔的瓊脂糖凝膠置于胚胎培養(yǎng)液中，或者向步驟C中所述的空腔中加入胚胎培養(yǎng)液；；
可任選地，還包括下述的步驟E，E.將經(jīng)步驟D處理后的人工透明帶在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡，具體地，在如下條件下平衡濕度90% -100%、溫度37°C -39°C、CO2 4% -6%, O2 5% -20%，平衡時(shí)間為24-72小時(shí)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制備人工透明帶的方法包括如下步驟I)制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠溶液，并用所述的瓊脂糖凝膠溶液制作能夠容納一細(xì)胞期胚胎的氣泡；2)將步驟I)中制得的氣泡平鋪于載體上，并且使氣泡以單層或多層排布；3)將步驟2)鋪在載體上的氣泡冷卻，直至氣泡凝固；4)用洗滌液覆蓋步驟3)中得到的凝固氣泡，所述洗滌液選自T10、T2、以及T20溶液中的一種或多種；5)使步驟4)中的凝固氣泡中的氣體逸出，形成具有開口的空腔；可任選地，還包括下述的步驟6)，6)將步驟5)中得到的具有空腔的瓊脂糖凝膠置于胚胎培養(yǎng)液中，或者將步驟5)中的空腔中的洗滌液吸出，加入胚胎培養(yǎng)液；可任選地，還包括下述的步驟7)，7)將經(jīng)步驟6)處理后的空腔在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡，具體地，在如下條件下平衡濕度90%-100%、溫度371-391、0)2 4% -6%,O2 5%-20%，平衡時(shí)間為 24-72小時(shí)。在本發(fā)明的制備人工透明帶的方法中，關(guān)于步驟A和步驟I)，具體地，制作濃度為1^-3% g/mL的瓊脂糖凝膠溶液；具體地，在瓊脂糖凝膠中產(chǎn)生直徑在300 μ m-500 μ m之間的氣泡。所述氣泡可以借助工具或設(shè)備產(chǎn)生，例如用移液槍反復(fù)吹打產(chǎn)生。所述氣泡可以以單層或多層分布，優(yōu)選的是單層分布。關(guān)于步驟2)，具體地，所述載體為細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)皿，更具體地，所述細(xì)胞培養(yǎng)板是4孔板、6孔板、8孔板、10孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，是4孔板。對(duì)于多層的氣泡，可以用移液槍對(duì)氣泡進(jìn)行剝離，如果氣泡重疊則可刺破。關(guān)于步驟B和步驟3)，所述冷卻可以在室溫下自然冷卻，但優(yōu)選在2°C_8°C (例如4 0C )冰箱中冷卻。
關(guān)于步驟4)，所述洗滌液的作用是使氣體在空腔被刺破時(shí)能夠逸出，并且具有清洗人工透明帶的作用。其中，TlO溶液為TCM-199-h印es緩沖液+10%小牛血清或胎牛血清，其中，TCM-199-h印es緩沖溶液的配方如下面的表I所示(也可以使用商購(gòu)獲得的TCM-199-hepes 緩沖溶液):表I :TCM-199_h印es緩沖溶液的配方
成分貨號(hào)每1000暈升溶液中的含量
NaHCO3S-4019O. 168g
Pyrovic Acid(Na-Salt)P-36620.22g
HEPES(Na-Salt)H-37843.615g·
HEPES(Acid)H-40342.63g
Sigma H2OW-1503IOOOmL
Medium 199 powderM-50179. 5g(All)
L-GlutamineG-85400.0461g也可以使用T2或T20替代T10，但是T2和T20的血清含量分別是2%和20%。由于TlO含有10%血清，可減少殘留液對(duì)后來(lái)加入的培養(yǎng)液影響(因?yàn)橐话愫宓呐囵B(yǎng)液血清含量為10% )，即不會(huì)影響到最終血清濃度，而血清濃度對(duì)培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)程度影響較大。因此優(yōu)選的是T10。關(guān)于步驟C和步驟5)，可以刺破凝固氣泡，刺破的角度并不特別限定，其中優(yōu)選以45度角刺破，以更有利于氣泡中的氣體(空氣)逸出。所述用于刺破凝固氣泡的工具并不特別限定，例如可以使用燒熔封口的操作細(xì)針。所述開口的內(nèi)徑為200 μ m-400 μ m,更具體地，為250 μ m-350 μ m，進(jìn)一步具體地，為280 μ m-320 μ m。所述開口的形狀可以是十字形，也可以是其它形狀。其中在步驟5)中，當(dāng)氣體逸出時(shí)，可看到氣泡上升，洗滌液進(jìn)入空腔。關(guān)于步驟D和步驟6)，優(yōu)選地，胚胎培養(yǎng)液的加入量為大于空腔體積的90 %，更優(yōu)選地，胚胎培養(yǎng)液的加入量為空腔體積的100%，即充滿空腔。在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，加入400 μ I胚胎培養(yǎng)液。具體地，所述胚胎培養(yǎng)液可以是PZM-3、PZM-4、ΡΖΜ-5、NCSU-23、或EBSS。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)(例如技術(shù)手冊(cè)或教科書)的教導(dǎo)配制這些胚胎培養(yǎng)液，也可以通過(guò)商購(gòu)?fù)緩将@得。關(guān)于步驟Ε)和步驟7)，平衡的目的是為了使培養(yǎng)液達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的，適合胚胎培養(yǎng)的狀態(tài)，比如使其PH值、溫度達(dá)到適合胚胎生長(zhǎng)的狀態(tài)。例如具體地，平衡時(shí)間為36-72小時(shí)，更具體地，為48_72小時(shí)，進(jìn)一步具體地，為48、52、56、60、64、68、或72小時(shí)，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，平衡時(shí)間為48小時(shí)；具體地，濕度為95 % -100 %，更具體地，為98 % -100 %，進(jìn)一步具體地，為98 %、99%、或100%，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，濕度為100% ；
具體地，溫度為37. 50C _39°C，更具體地，為38°C _39°C，進(jìn)一步具體地，為38°C、38. I0C >38. 2°C >38. 3°C >38. 4°C >38. 5°C >38. 6°C >38. 7°C >38. 8°C >38. 9°C、或 39°C，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，溫度為38. 50C ；具體地，CO2濃度為4. 5% -5.5%，具體地，為4. 8% -5. 2 %，進(jìn)一步具體地，為4.8%,4.9%,5%,5. 1%、或5.2%，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，為5% ；具體地，O2濃度為5% -15%，更具體地，為5% -10%，進(jìn)一步具體地，為5%、6%、7%、8%、9%、或10%，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，為5%。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，本發(fā)明的人工透明帶的制備方法的全部過(guò)程都是在無(wú)菌的條件下。此外，本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的制備方法制備的人工透明帶。 本發(fā)明還一方面涉及按照上述的本發(fā)明的制備方法制得的人工透明帶。本發(fā)明還一方面涉及一種培養(yǎng)非人胚胎的方法，包括使用本發(fā)明的人工透明帶的步驟；具體地，所述胚胎是重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎。具體的，所述培養(yǎng)胚胎的方法為體外培養(yǎng)胚胎的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人胚胎為豬胚胎，具體地，為豬重構(gòu)胚。本發(fā)明的還一方面涉及一種移植非人胚胎的方法，包括使用本發(fā)明的人工透明帶的步驟；具體地，所述胚胎是重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎。其中，術(shù)語(yǔ)“孤雌胚胎”是指沒(méi)有精子參與，由卵母細(xì)胞直接發(fā)育而成的胚胎。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人胚胎為豬胚胎，具體地，為豬重構(gòu)胚。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述移植非人胚胎的方法包括下述步驟I)將胚胎放入上述的任一種人工透明帶的空腔中，并在濕度98% -100%，溫度38. 5°C, CO2 5%, O2 5%的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)；2)將步驟I)含有胚胎的空腔切下；3)將步驟2)切下的含有胚胎的空腔進(jìn)行移植。本發(fā)明的還一方面涉及一種非人動(dòng)物手工克隆方法，包括本發(fā)明的人工透明帶的步驟；具體地，包括使用本發(fā)明的人工透明帶進(jìn)行重構(gòu)胚移植的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物是豬。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的人工透明帶在制備用于非人胚胎培養(yǎng)的輔助材料或者用于移植非人胚胎的輔助材料或者用于非人動(dòng)物手工克隆的輔助材料中的用途；具體地，所述胚胎是重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人胚胎為豬胚胎，具體地，為豬重構(gòu)胚。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人動(dòng)物是豬。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，本發(fā)明的人工透明帶是無(wú)菌的，并且其制備方法所涉及的試劑和材料都是無(wú)菌或經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理的。在本發(fā)明中，所述胚胎、重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎均是非人胚胎。具體的，所述非人胚胎是豬胚胎，更具體地，是豬重構(gòu)胚。發(fā)明的有益效果由于體內(nèi)環(huán)境比體外環(huán)境更有利于胚胎發(fā)育，因而胚胎在體外培養(yǎng)的時(shí)間越短越有利于其后期發(fā)育。本發(fā)明縮短了胚胎在體外培養(yǎng)的時(shí)間，能在整體上提高手工克隆技術(shù)效率，是對(duì)手工克隆技術(shù)的進(jìn)一步完善，從而更好地促進(jìn)手工克隆技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。此外，本發(fā)明還提高了胚胎特別是重構(gòu)胚的平均囊胚率。本發(fā)明具有良好的市場(chǎng)前景。


圖I :制備好的人造透明帶(備注關(guān)于空腔的開口，在顯微鏡可以看到，但由于攝像頭的原因，圖I中不能明顯看到)。圖2 :放入一細(xì)胞期的重構(gòu)胚的人工透明帶。圖3 :培養(yǎng)I天后，在人造透明帶中發(fā)育到二細(xì)胞期的胚胎。圖4 :培養(yǎng)6天后，在人造透明帶中發(fā)育到囊胚期的胚胎。圖5 :培養(yǎng)2天后，在WOW中發(fā)育到四細(xì)胞期的胚胎。圖6 :培養(yǎng)6天后，在WOW中發(fā)育到囊胚期的胚胎。
圖7 :移植4周后，B超儀成像方法檢測(cè)在人造透明帶中發(fā)育到一細(xì)胞期的胚胎在母豬子宮內(nèi)的胚胎發(fā)育情況。圖8 :移植4周后，B超儀成像方法檢測(cè)在人造透明帶中發(fā)育到一細(xì)胞期的胚胎在母豬子宮內(nèi)的胚胎發(fā)育情況。圖9 :移植4周后，B超儀成像方法檢測(cè)在WOW中發(fā)育到囊胚期的胚胎在母豬子宮內(nèi)的胚胎發(fā)育情況。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例I :人工誘明帶的制備材料2%瓊脂糖凝膠(O. Olg低熔點(diǎn)瓊脂糖+0. 5mL sigma水，80°C _100°C水浴溶解)；I. 5mL eppendorf管；4孔細(xì)胞培養(yǎng)板。方法I.瓊脂糖溶液裝放2mL eppendorf管中，用量程為1000 μ L eppendorf移液槍(調(diào)至200ul)反復(fù)吹打，直至產(chǎn)生直徑大部分處在300μπι-500μπι之間的氣泡。2.用印pendorf移液槍吸入少量氣泡，平鋪在四孔板中(保持單層，并將直徑較大的氣泡吸走)。3.將鋪好氣泡的四孔板迅速放入4°C冰箱，降溫3-4分鐘。4.將四孔板從冰箱拿出，用400 μ L TlO (TCM-199-hepes緩沖溶液+10%牛血清)
覆蓋住已經(jīng)凝固的氣泡。5.用燒熔封口的操作細(xì)針挑破氣泡，讓氣體逸出，形成空腔。6.將孔中TlO吸出(注意勿觸動(dòng)瓊脂糖膠體)，加入400 μ L胚胎培養(yǎng)液(ΡΖΜ-3溶液)。7.將四孔板放于最大濕度(98% —100% )，溫度38. 5。。，CO2 5%,O2 5%的培養(yǎng)箱中平衡48小時(shí)。得到的人工透明帶如圖I所示。
實(shí)施例2 :重構(gòu)胚的人工透明帶培養(yǎng)和WOW培養(yǎng)的比較實(shí)驗(yàn)將采用手工克隆技術(shù)得到的豬的一細(xì)胞期重構(gòu)胚(可以參考Y.Du P. M. KraghPiglets born from handmade cloning, an innovativecloning method withoutmicromanipulation. Theriogenology 68 (2007) 1104-1110),分別用實(shí)施例 I 中新制備的人工透明帶和WOW方法進(jìn)行培養(yǎng)，并且檢測(cè)后續(xù)發(fā)育能力。培養(yǎng)分組情況如表I所示。其中，使用人工透明帶的培養(yǎng)的步驟如下將重構(gòu)胚用口吸管放入實(shí)施例I中新制備的位于四孔板中的人工透明帶的空腔中(圖2)，然后在最大濕度(98%—100%)，溫度38.5°C，CO2 5%,O2 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天?！?br> 人工透明帶培養(yǎng)I天后，重構(gòu)胚在人造透明帶中發(fā)育城2細(xì)胞期的胚胎(圖3);·培養(yǎng)6天后，在人造透明帶中發(fā)育到囊胚期(圖4)。使用WOW方法進(jìn)行培養(yǎng)的步驟如下I)在四孔板中加入400 μ L胚胎培養(yǎng)液(ΡΖΜ-3溶液);2)將四孔板放于最大濕度(98% —100% )，溫度38. 5。。，CO2 5%,O2 5%的培養(yǎng)箱中平衡48小時(shí)；3)用打孔器在四孔板中打小孔(300 μ m—500 μ m)；4)將重構(gòu)胚放入小孔中，并在最大濕度(98% —100% )，溫度38. 5°C，C02 5%,O25%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。WOW方法培養(yǎng)2天后，重構(gòu)胚在發(fā)育到四細(xì)胞期(圖5);培養(yǎng)6天后，發(fā)育到囊胚期(圖6)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)在第6天觀察囊胚數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。囊胚率的計(jì)算方法囊胚率=囊胚數(shù)/培養(yǎng)胚胎數(shù)。胚胎數(shù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。表2 :重構(gòu)胚的人工透明帶培養(yǎng)和WOW培養(yǎng)的比較
權(quán)利要求
1.一種人工透明帶，其為分布有一個(gè)或多個(gè)空腔的瓊脂糖凝膠，所述空腔能夠容納一細(xì)胞期的非人胚胎，并且所述空腔有開口，所述開口能夠移植入一細(xì)胞期的胚胎。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人工透明帶，其中，所述空腔的內(nèi)徑為300μπι-500μπι，所述開口的內(nèi)徑為200μπι-400μπι，所述瓊脂糖凝膠的濃度為l-3g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要 求I所述的人工透明帶，其中，將人工透明帶置于胚胎培養(yǎng)液中或者向所述空腔中注入胚胎培養(yǎng)液，并且在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡；具體地，在如下條件下平衡濕度 90% -100%、溫度 37°C -39°C、CO2 4% -6%, O2 5% -20%，平衡時(shí)間為 24-72 小時(shí)；優(yōu)選地，使人工透明帶的空腔中充滿胚胎培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人工透明帶，其中，所述胚胎培養(yǎng)液選自PZM-3、PZM-4、PZM-5、NCSU-23、以及 EBSS 溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人工透明帶，其中，所述人工透明帶在適當(dāng)?shù)闹С州d體上。
6.一種制備人工透明帶的方法，包括下述步驟 A.制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠溶液，并用所述的瓊脂糖凝膠溶液制作能夠容納一細(xì)胞期胚胎的氣泡； B.使步驟A中的氣泡冷卻，直至氣泡凝固； C.使步驟B中的凝固氣泡中的氣體逸出，形成具有開口的空腔； 可任選地，還包括下述的步驟D， D.將步驟C中得到的具有空腔的瓊脂糖凝膠置于胚胎培養(yǎng)液中，或者向步驟C中所述的空腔中加入胚胎培養(yǎng)液； 可任選地，還包括下述的步驟E， E.將經(jīng)步驟D處理后的空腔在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡，具體地，在如下條件下平衡濕度 90% -100%、溫度 37°C -39°C、CO2 4% -6%, O2 5% -20%，平衡時(shí)間為 24-72 小時(shí)。
7.一種制備人工透明帶的方法，包括下述步驟 1)制備適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠溶液，并用所述的瓊脂糖凝膠溶液制作能夠容納一細(xì)胞期胚胎的氣泡； 2)將步驟I)中制得的氣泡平鋪于載體上，并且使氣泡以單層或多層排布； 3)將步驟2)鋪在載體上的氣泡冷卻，直至氣泡凝固； 4)用洗滌液覆蓋步驟3)中得到的凝固氣泡，所述洗滌液選自T10、T2、以及T20溶液中的一種或多種； 5)使步驟4)中的凝固氣泡中的氣體逸出，形成空腔； 可任選地，還包括下述的步驟6)， 6)將步驟5)中得到的具有空腔的瓊脂糖凝膠置于胚胎培養(yǎng)液中，或者將步驟5)中的空腔中的洗滌液吸出，加入胚胎培養(yǎng)液； 可任選地，還包括下述的步驟7)， 7)將經(jīng)步驟6)處理后的空腔在適于胚胎培養(yǎng)的條件下平衡；具體地，在如下條件下平衡濕度 90% -100%、溫度 37°C -39°C、CO2 4% -6%, O2 5% -20%，平衡時(shí)間為 24-72 小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，所述步驟I)為制作濃度為1^-3% g/mL的瓊脂糖凝膠溶液，并在瓊脂糖凝膠溶液中產(chǎn)生直徑在.300 μ m-500 μ m之間的氣泡。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其中，所述步驟7)為 將經(jīng)步驟6)處理后的空腔在如下條件下平衡濕度98% -100%、溫度38. 5°C、CO25%, O2 5%，平衡時(shí)間為48小時(shí)。
10.一種人工透明帶，其根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的制備方法制得。
11.一種培養(yǎng)非人胚胎的方法，包括使用權(quán)利要求1-5和權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的人工透明帶的步驟；具體地，所述胚胎是重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎。
12.—種移植非人胚胎的方法，包括使用權(quán)利要求1-5和權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的人工透明帶的步驟；具體地，所述胚胎是重構(gòu)胚、受精胚、或孤雌胚胎。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的移植非人胚胎的方法，其包括下述步驟 1)將胚胎放入權(quán)利要求1-5和權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的人工透明帶的空腔中，并在濕度98%-100%，溫度38.5°C，CO2 5%, O2 5%的條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)； 2)將步驟I)含有胚胎的空腔切下； 3)將步驟2)切下的含有胚胎的空腔進(jìn)行移植。
14.一種非人動(dòng)物手工克隆方法,包括使用權(quán)利要求1-5和權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的人工透明帶的步驟。
15.權(quán)利要求1-5和權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的人工透明帶在制備用于非人胚胎培養(yǎng)的輔助材料或者用于移植非人胚胎的輔助材料或者用于非人動(dòng)物手工克隆的輔助材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人工透明帶及其制備方法和用途。具體地，所述人工透明帶為分布有一個(gè)或多個(gè)空腔的瓊脂糖凝膠，所述空腔能夠容納一細(xì)胞期的胚胎，并且所述空腔有開口，所述開口能夠移植入一細(xì)胞期的胚胎。本發(fā)明還涉及一種移植非人胚胎的方法和一種非人動(dòng)物的手工克隆方法。本發(fā)明縮短了胚胎在體外培養(yǎng)的時(shí)間，能在整體上提高手工克隆技術(shù)效率，是對(duì)手工克隆技術(shù)的進(jìn)一步完善，從而更好地促進(jìn)手工克隆技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。此外，本發(fā)明還提高了胚胎特別是重構(gòu)胚的平均囊胚率。本發(fā)明具有良好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A61D19/04GK102899283SQ20111021028
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者林琳, 杜玉濤, 劉田賓 申請(qǐng)人:深圳華大方舟生物技術(shù)有限公司, 深圳華大基因科技有限公司