專利名稱：一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物領域，具體涉及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領域的應用。
背景技術：
腫瘤是一類嚴重威脅人類健康與生命的疾病，腫瘤的治療已經(jīng)成為日益迫切需要解決的重大公共衛(wèi)生問題。近年來盡管抗腫瘤藥物研究已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但仍存在著針對性差，對正常細胞也產(chǎn)生殺傷作用等缺陷，使之應用受到很大限制。因此，研制靶向性殺傷腫瘤細胞的基因工程藥物仍具有重大的社會效益與經(jīng)濟效益。1995年,Wiley SR等報道從人表達標簽序列文庫(EST, expressed sequence tag)中篩選到一種編碼抗腫瘤蛋白的基因，該基因編碼的蛋白稱為腫瘤壞死因子相關凋亡配體·(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL),又稱凋亡素 2配體(Apo2L),屬于腫瘤壞死因子超家族(Wiley SR, et al. , Immunity 3:673-682,1995)。TRAIL與DR4或DR5受體結合后，DR4和DR5的死亡結構域傳導凋亡的信號通過FADD和依賴caspase 8機制在細胞內(nèi)途徑和細胞外途徑實現(xiàn)的。TRAIL對于大多數(shù)惡性腫瘤有抑制細胞生長和細胞毒效應，而人體的正常細胞則對TRAIL誘導的凋亡耐受(Ashkenazi A, etal. ,J Clin Invest 104 :155_162，1999)。因其特異性地誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對正常細胞沒有顯著細胞毒性的特點，因此TRAIL在腫瘤治療中具有良好的前景，自發(fā)現(xiàn)以來一直被作為腫瘤治療研究的熱點。TRAIL雖然在體內(nèi)體外實驗以及臨床實驗中均顯示了很顯著的抑制腫瘤細胞生長的作用，但是半衰期比較短，人體內(nèi)半衰期僅有40分鐘，嚴重影響了 TRAIL蛋白在體內(nèi)的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種TRAIL融合蛋白，此種融合蛋白可以顯著的增加蛋白穩(wěn)定性以及延長在動物體內(nèi)半衰期，顯著的提高治療效果。本發(fā)明提供的TRAIL融合蛋白包括⑴人源亮氨酸拉鏈結構域；⑵人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。TRAIL(腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)是一種在本技術領域內(nèi)被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登錄號NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作為死亡受體DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)的配體，與其結合誘導凋亡或細胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示，其胞外區(qū)是從N端開始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 7所示.依照本發(fā)明，一種TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列(1)人源亮氨酸拉鏈序列；(2)根據(jù)情況可有一不多于10個氨基酸的連接區(qū)；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以與死亡受體DR4(TRAIL-RI)或者死亡受體 DR5 (TRAIL-RII)相結合?；诒景l(fā)明的目的，融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全長或者部分片段，長度足以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)和死亡受體DR5 (TRAIL-RII)結合。優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外區(qū)，包含天然人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段。更加優(yōu)選的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一種TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外區(qū)的全長或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。在一種實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID NO:·2所示氨基酸序列。作為優(yōu)選,其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域為人c-fos, c-jun, c-myc, max、mdxl或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結構域。在本發(fā)明的具體實施例中，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域含有如SEQ ID N01所示的氨基酸序列。在一種實施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。本發(fā)明也提供了包含3個融合蛋白分子的寡聚體，這種寡聚體的形成是通過亮氨酸拉鏈結構域進行加強的。本發(fā)明也涵蓋了編碼融合蛋白的DNA分子。在一種實施方案中，所述DNA分子含有SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)的表達盒以及重組了編碼所述融合蛋白DNA分子的表達載體。作為優(yōu)選，所述表達載體為質(zhì)?；虿《?。此外，本發(fā)明進一步提供了重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子以及表達所述的融合蛋白的細胞和轉(zhuǎn)基因動物。該細胞可以是哺乳動物細胞，昆蟲細胞，酵母或者細菌。轉(zhuǎn)基因動物可以是轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等。在本發(fā)明的實施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2011年6月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4953。另外，本發(fā)明也提供了所述融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟含有編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的細胞或轉(zhuǎn)基因動物，該細胞或轉(zhuǎn)基因動物表達所述融合蛋白以及分離所述融合蛋白。在又一個方面，本發(fā)明提供了所述的融合蛋白的應用，即生產(chǎn)用于治療一種疾病的藥物，例如，由不可控制的細胞生長導致的人類疾病如，腫瘤，銀屑病，自身免疫性疾病
坐寸ο動物試驗顯示，人源TRAIL蛋白對照組對腫瘤的抑制率為35. 8%，而本發(fā)明所述融合蛋白組腫瘤完全消失，且裸鼠狀態(tài)明顯好于給予人源TRAIL蛋白的陽性對照組，表明與TRAIL相比，本發(fā)明所述融合蛋白毒性更低。另外，本發(fā)明所述融合蛋白的體內(nèi)消除速度明顯低于TRAIL蛋白，說明融合蛋白與TRAIL相比半衰期明顯延長。生物保藏說明菌株LZ-TRAIL95CS，分類命名大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2011年6月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4953。


圖I顯示的是融合蛋白結構示意圖。A-人源亮氨酸拉鏈結構域B-連接區(qū)C-TRAIL 胞外區(qū)圖2顯示的是LZ-TRAIL蛋白的表達與純化的SDS-PAGE鑒定結果。泳道I :未誘導的細胞裂解物；泳道2 :0. 2mM IPTG誘導后的細胞裂解物；泳道3 :蛋白分子量標準；泳道4 :金屬親和層析純化后的LZ-TRAIL蛋白；泳道5 :離子交換層析純化后的LZ-TRAIL蛋白。箭頭所示為目標蛋白。圖3顯示的是純化后的LZ-TRAIL蛋白(未突變)的還原與非還原SDS-PAGE鑒定結果。泳道I :非還原SDS-PAGE鑒定結果；泳道2 :蛋白分子量標準；泳道3 :還原SDS-PAGE鑒定結果。箭頭所示為目標蛋白。圖4顯示的是純化后的LZ-TRAIL蛋白(突變后)的還原與非還原SDS-PAGE鑒定結果。泳道I :還原SDS-PAGE鑒定結果；泳道2 :蛋白分子量標準；泳道3 :非還原SDS-PAGE鑒定結果。箭頭所示為目標蛋白。圖5顯示乳腺癌細胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的腫瘤生長曲線。圖6顯示乳腺癌細胞MDA-MB231裸鼠荷瘤模型的體重變化曲線。圖7顯示的是融合蛋白和人源TRAIL蛋白給藥后小鼠體內(nèi)血藥濃度變化曲線。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白、編碼該融合蛋白的DNA、表達載體、細胞、轉(zhuǎn)基因動物及其制備方法和其在醫(yī)藥領域的應用。本領域技術人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。依照本發(fā)明，一種TRAIL融合蛋白從N端至C端具有如下序列(1)人源亮氨酸拉鏈序列；⑵人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以與死亡受體DR4 (TRAIL-RI)或者死亡受體DR5 (TRAIL-RII)相結合。亮氨酸拉鏈(leucine zipper)是一種可以自發(fā)形成多聚體的結構域，存在于多種天然蛋白中。此類結構一般呈卷曲螺旋結構，通過特征α-螺旋的相互作用自發(fā)形成多聚體。例如 Haudenschild 等人(Haudenschild DR, et al. , J Biol Chem 270 :23150-23154,1995)描述一種結締組織蛋白martrilin，又稱為軟骨基質(zhì)蛋白(CMP)，其三個蛋白分子在C端的亮氨酸拉鏈結構域的作用下，形成同源三聚體。亮氨酸拉鏈結構域可以進一步穩(wěn)定TRAIL三聚體的結構。本發(fā)明所述融合蛋白中的人源亮氨酸拉鏈結構域可以來源于任何人源蛋白。在本技術領域中已為人所熟知的是，在多種天然蛋白中發(fā)現(xiàn)有亮氨酸拉鏈結構域的存在。亮氨酸拉鏈結構域可以相互作用形成二體或者三體。因此，本發(fā)明所述融合蛋白中包含的亮氨酸拉鏈結構域可以促進融合蛋白的寡聚化因而能夠增加穩(wěn)定性，突變2個半胱氨酸后蛋白 的結構更加穩(wěn)定均一。優(yōu)選的是選擇可以促進融合蛋白形成三聚體的人源亮氨酸拉鏈。適合的人源亮氨酸拉鏈結構域例如人C-fos, C-jun, c-myc, max和mdxl蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結構域。優(yōu)選的是來自人matrilin蛋白的人源亮氨酸拉鏈結構域。在一個優(yōu)選實施方案中，融合蛋白中的人源亮氨酸拉鏈結構域含有如SEQ IDD NO :1所述的氨基酸序列。本發(fā)明所述融合蛋白的各部分氨基酸序列可以直接由肽鍵連接到一起。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDD NO 3所述的氨基酸序列。另外，本發(fā)明也提供了包含3個本發(fā)明所述的融合蛋白結合形成的寡聚體。寡聚體的形成是依賴人源TRAIL多肽的三聚化，以及通過亮氨酸拉鏈結構域的分子間相互作用。在寡聚體中的融合蛋白的穩(wěn)定性和半衰期都有所加強。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ ID NO :3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子。在一個優(yōu)選實施方案中，DNA分子含有如SEQ ID NO :4所述的核苷酸序列。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白和寡聚體，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達盒中，隨后表達盒被插入合適的表達載體。然后，這一表達載體被轉(zhuǎn)入宿主細胞或者動物用于重組蛋白表達。表達盒至少包括以下幾個內(nèi)容⑴轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，(2)編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進行的，以及(3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達的宿主細胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構建的序列，該序列適合于真核或者原核細胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類序列在本技術領域內(nèi)已為人所熟知。適當?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA片段與編碼融合蛋白的DNA片段相連接。這種連接方法在本技術領域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切以及連接。表達盒可以被整合插入表達載體，隨后這一表達載體被轉(zhuǎn)入宿主細胞或者動物。一般情況下，表達載體還要包括復制起始序列，以及篩選標記，例如，對于細菌的蛋白表達，質(zhì)粒是一種很有用途的載體。本技術領域內(nèi)有很多種為人所熟知的可以用于此目的的質(zhì)粒載體，包括，但是不僅限于，pET25b，pET15b等等。如果通過酵母細胞來重組表達融合蛋白，酵母表達載體，比如PPIC9，pA0815, pPICZ等等，可以作為表達載體。如果通過哺乳動物細胞來進行蛋白表達，也有很多合適的重組蛋白表達載體。用于哺乳動物細胞表達蛋白的表達載體包含的DNA序列，需要適合以同源重組方式整合插入宿主細胞染色體。哺乳動物細胞表達載體，比如pcDNA3. I, pSI等等。對于通過動物來表達融合蛋白，用于生產(chǎn)含有表達盒的轉(zhuǎn)基因動物(轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等)的技術手段，在本技術領域內(nèi)已為人所熟知。比如pBLG等等，可以作為轉(zhuǎn)基因動物表達的載體。獲得轉(zhuǎn)化的宿主細胞或者轉(zhuǎn)基因動物后，可在適合表達本發(fā)明融合蛋白的條件下表達出融合蛋白。通過其理化性質(zhì)和其它特性的差別運用各種分離方法分離純化融合蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的，例如常規(guī)的變性復性處理、離心、超聲破碎、超濾膜過濾、金屬親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、透析、高效液相層析等常規(guī)純化方法及這些方法的結合。
下面將結合最佳實施例的詳細描述和附圖，進一步說明本發(fā)明前述的和其他的優(yōu)點和特點。實施例I :發(fā)明人經(jīng)過大量實驗發(fā)現(xiàn)，構建的融合蛋白LZ-TRAIL95治療腫瘤可達到完全消失的效果，且裸鼠狀態(tài)明顯好于給予人源TRAIL蛋白的陽性對照組，表明與TRAIL相比，融合蛋白LZ-TRAIL95毒性更低。另外，融合蛋白的體內(nèi)半衰期為218分鐘，顯著高于人源TRAIL蛋白。融合蛋白LZ-TRAIL95含有3部分交聯(lián)區(qū)、LZ (亮氨酸拉鏈)和TRAIL胞外區(qū)。其中交聯(lián)區(qū)含有2個半胱氨酸，在活性形式三聚體結構中，兩兩形成分子間二硫鍵，起到加固TRAIL三聚體的作用，其序列如下MEEDPCACESLVKFQAKVEGLLQALTRKLEAVSKRLAILENTVVGSTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGLZ-TRAIL95蛋白遇到的最大問題是二硫鍵錯配，在非還原電泳表現(xiàn)為不均一條帶。經(jīng)Western blotting以及肽圖證明各條帶均為LZ-TRAIL95蛋白。添加多種藥用輔料抗氧劑均不能解決這一問題。為了解決LZ-TRAIL95 二硫鍵錯配的問題，將LZ片段N端兩個Cys突變?yōu)镾er，構建LZ-TRAIL95CS蛋白的表達載體，其表達的LZ-TRAIL95CS蛋白序列如SEQ ID No. 3所示，結果表明突變可以大大緩解LZ-TRAIL95的不均一化問題。完全去除DTT前后，C18反相色譜柱檢測圖譜如下，純度90%。與LZ-TRAIL95相t匕，蛋白均一程度明顯改善。分子篩鑒定表明，LZ-TRAIL95CS蛋白在分子篩中的保留時間要比BSA單體(68KD)保留時間短，見表1，說明LZ-TRAIL95CS的分子量大于68KD，是以活
性形式三聚體存在。表I :LZ-TRAIL95CS與BSA在SEC-HPLC保留時間對比結果
蛋白名稱出峰時間(min)
權利要求
1.一種融合蛋白，包括(1)人源亮氨酸拉鏈結構域；(2)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段。
2.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包含由不多于10個氨基酸組成的連接區(qū)。
3.如權利要求I或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域為人c-fos, c-jun, c-myc, max、mdxl或人matrilin蛋白含有的亮氨酸拉鏈結構域。
4.如權利要求I或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源亮氨酸拉鏈結構域含有如SEQ ID NO 1所不的氣基酸序列。
5.如權利要求I或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
6.如權利要求I或2所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如SEQIDNO 3的氨基酸序列。
7.一種寡聚體，其特征在于，該寡聚體是由三個權利要求1-6任一項所述融合蛋白形成。
8.編碼權利要求1-6任一項所述融合蛋白的DNA序列。
9.根據(jù)權利要求8所述的DNA序列，其特征在于，含有如SEQID NO 4所示的核苷酸序列。
10.一種表達盒，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼權利要求1-6任一項所述融合蛋白的DNA分子；以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。
11.重組了編碼權利要求1-6任一項所述融合蛋白DNA分子的表達載體。
12.如權利要求11所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為質(zhì)粒或病毒。
13.重組了編碼權利要求1-6任一項所述融合蛋白的DNA分子的細胞。
14.如權利要求13所述的細胞，其特征在于，所述細胞為哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母菌或細菌。
15.根據(jù)權利要求14所述的細胞，其特征在于，所述細胞屬大腸桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4953。
16.一種轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于，轉(zhuǎn)染了編碼權利要求1-6任一項所述融合蛋白的DNA分子且表達所述融合蛋白。
17.權利要求1-6任一項所述融合蛋白的制備方法,包括 提供權利要求13-16任一項所述細胞或權利要求16所述轉(zhuǎn)基因動物； 使細胞或者轉(zhuǎn)基因動物表達所述融合蛋白；以及 分離所述融合蛋白。
18.如權利要求1-6任一項所述融合蛋白在制造治療細胞過度增生導致的疾病或免疫系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。
19.如權利要求18所述的用途，其特征在于，所述疾病為癌癥或自身免疫性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，提供了一種腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體融合蛋白、編碼該融合蛋白的DNA序列、含有該DNA序列的載體、含該載體的宿主細胞或者轉(zhuǎn)基因動物、該融合蛋白的制備方法以及該融合蛋白的應用。本發(fā)明所述TRAIL融合蛋白從N端至C端包括人源亮氨酸拉鏈序列以及人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外區(qū)或人源TRAIL蛋白胞外區(qū)的片段，可以顯著增加穩(wěn)定性以及延長在動物體內(nèi)半衰期，顯著的提高治療效果，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A01K67/033GK102898526SQ20111021394
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月28日 優(yōu)先權日2011年7月28日
發(fā)明者周兵, 周宇, 姜靜 申請人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司, 江蘇先聲藥物研究有限公司