專利名稱：一種快速獲得辣椒轉基因植株的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域中轉基因植株的獲取方法，尤其涉及一種通過農桿 菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。
背景技術：
轉基因技術是利用重組DNA、細胞組織培養(yǎng)或種質系統(tǒng)轉化等技術，將外源基因導入植物細胞或組織，使之定向重組遺傳物質，改良植物性狀，培育優(yōu)質高產作物新品種。自 1983年首例轉基因植株誕生，天然植物基因工程開始在人工控制下定向改良植物的遺傳性狀。與常規(guī)育種方法相比，它具有以下一些特點1)不受親緣關系的限制，可實現動物、植物和微生物間遺傳物質的交流，從而充分利用自然界存在的各種遺傳資源；2)有效地打破有利基因和不利基因的連鎖，充分利用有用基因；3)加快育種進程，縮短育種年限。自第一例轉基因煙草問世以來，植物轉基因研究和應用發(fā)展迅速。到1997年為止，全世界轉基因植物涉及到至少35科的200多個種。目前，植株轉基因已成為植物分子生物學研究的強有力的實驗手段；更是基因克隆、功能基因組研究必不可少的實驗工具。近年來，遺傳轉化方法不斷創(chuàng)新，已發(fā)表的植物轉基因操作體系有近10種，以轉化系統(tǒng)的原理大致可分為三類1)農桿菌介導的基因轉移；2)以原生質體、細胞或組織為受體的直接轉移，如電激、微注射、PEG介導法；3)種質系統(tǒng)的基因轉移，如利用子房注射、種胚、體細胞胚及花粉。目前應用最多的是根癌農桿菌介導的轉基因方法，迄今所獲得的200多種轉基因植物中，80%以上是利用該方法獲得的。截至1999年，至少30個國家進行了總計3萬次以上的轉基因作物的田間試驗，改良的經濟性狀有10多個；已有大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、馬鈴薯、煙草、西葫蘆和蕃木瓜等9種作物的轉基因品種投入了商業(yè)化生產，取得了良好的社會效益和經濟效益。辣椒為茄科辣椒屬蔬菜作物，是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一。自從首次開展辣椒組織培養(yǎng)工作以來，國內外相繼出現采用不同的辣椒外植體，如子葉、莖尖、莖段、葉片、下胚軸、子葉柄、花藥及其原生質體等進行組織培養(yǎng)的報道。但辣椒組織培養(yǎng)具有很強的基因型特異性，再生效率不理想，在多數試驗中植株的再生周期長或分化頻率低，其不定芽的生長能力較差，有的甚至停留在芽誘導階段而不能進一步生長，這在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究進展。目前，關于辣椒轉基因工作研究主要集中遺傳轉化體系的建立上，但遺傳轉化過程仍存在一些主要問題限制了辣椒轉基因技術在實際育種中的應用， 如培養(yǎng)周期長、植株再生困難和遺傳轉化率低等。因此，如何建立成熟的遺傳轉化體系、提高遺傳轉化率是辣椒轉基因工作中急需解決的一個難題。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的是提供一種通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。該方法可用于新基因功能的驗證以及優(yōu)良轉基因育種材料的獲得，也為其他作物的轉基因研究提供參考。
技術方案本發(fā)明提供了一種通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。其過程是對辣椒未成熟胚先進行農桿菌侵染，再進行培養(yǎng)，然后對獲得的再生植株進行PCR鑒定，在短期內獲得轉基因植株。具體步驟如下
1)取樣在果實采摘期晴天從健壯植株上取自然成熟的紅果(授粉后4(Γ50天)。2)農桿菌活化和侵染將含有目的基因(掌葉半夏凝集素基因ΡΡΑ，基因全長 777bp)的農桿菌LBA4404接種于含有45mg/L卡那霉素及50mg/L利福平的YEB的固體培養(yǎng)基上，27 °C暗培養(yǎng)2d后，挑單菌落接種至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，27°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl值為0. 4、6，將菌液轉入50mL離心管中，4000rpm 離心菌液后，用等體積的無菌水懸浮菌液后備用。取1)中果實的種子，用解剖刀將其一分為二，隨后取出未成熟胚轉移至已準備好的農桿菌菌液中，浸沒5分鐘。3)再生培養(yǎng)基(R培養(yǎng)基)和篩選培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基)制備R和S培養(yǎng)基所用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，所用碳源為蔗糖，凝固劑為瓊脂。R培養(yǎng)基的組成成分為MS+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0. 8%瓊脂，S培養(yǎng)基的組成成分為MS+2mg/L 6_BA+3%蔗糖+0. 8%瓊脂+60mg/ L卡那霉素。4)未成熟胚接種和培養(yǎng)將2)中侵染的未成熟胚在滅菌濾紙上浙干菌液后，置于 3)中R培養(yǎng)基上培養(yǎng)先在27°C黑暗條件下培養(yǎng)3天后用無菌水沖洗數次外植體，轉移到篩選培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)1周，后于光照度20001χ、光照時間12h、室溫27°C下繼續(xù)培養(yǎng)，每三角瓶放30個未成熟胚。5)不定芽形成和植株再生接種后一周，可觀察到未成熟胚膨大。繼續(xù)培養(yǎng)三周后，可陸續(xù)觀察到不定芽的出現，隨后形成根、芽、葉俱全的完整植株。 6)轉基因植株的PCR鑒定以再生植株的葉片為材料提取基因組DNA，利用所轉化基因的序列設計特異引物對DNA進行擴增，以質粒和水為對照。擴展條帶的有無表示轉基因侵染成功與否。有益效果
1)首次在辣椒轉基因研究中利用未成熟胚為試材快速獲得轉基因再生植株。該發(fā)明縮短了轉基因接種再生培養(yǎng)時間，提高了轉化效率，獲得的轉基因植株可用于新基因的功能驗證。同時，獲得的轉基因植株可作為優(yōu)異育種材料運用于育種實踐。2)辣椒annuum L.)屬茄科辣椒屬，是一種被廣泛種植的重要蔬菜作物。然而，由于辣椒遺傳基礎狹窄，種質資源有限，僅采用常規(guī)育種手段選育新品種不僅耗時耗力、效率低，且難以使新品種在抗性和品質等方面有顯著提高。而利用本發(fā)明方法可快速轉基因植株，不僅可以縮短轉基因過程中遺傳轉化的培養(yǎng)時間，提高轉化效率，短期內就可以進行完成目的基因的功能驗證，而且可以提供新的種質資源，使新株系在特定性狀(抗性和品質)等方面得到顯著提高。應用本發(fā)明獲得的轉基因植株可作為育種材料直接用于新品種的培育。3)本發(fā)明是建立在以辣椒未成熟胚為試材進行轉基因培養(yǎng)包括基因型、取材時期、接種菌液濃度和時間以及培養(yǎng)基成分等系統(tǒng)研究工作基礎上的。通過農桿菌侵染未成熟胚獲得轉基因再生植株可以縮短培養(yǎng)時間、提高轉化效率。本發(fā)明從農桿菌侵染未成熟胚到再生植株的獲得一般需要7周時間，培養(yǎng)過程中再生植株形成率最高可達50%，轉基因植株陽性率高達80%。而未成熟胚具有取材方面、結構簡單、基因型豐富等優(yōu)點，對未成熟胚進行離體培養(yǎng)可以準確地研究植株再生條件，以及可以快速獲得多種基因型的轉基因育種材料。同時，通過農桿菌侵染未成熟胚培養(yǎng)可以進行優(yōu)良辣椒無性系變異材料的篩選，創(chuàng)制新的種質資源，擴大辣椒基因池?？傊?，本方法具有堅實的理論依據，科學性強、方法簡便， 易于操作和實際應用。


圖1利用未成熟胚進行辣椒轉基因研究流程圖
圖2實施例農桿菌侵染未成熟胚獲得轉基因植株。A.剛接種的辣椒未成熟胚；B. 膨大的辣椒未成熟胚；C.不定芽形成；D.根芽葉俱全的轉基因再生植株；
圖3實施例轉基因植株PCR驗證結果，750bp附近處有目的條帶表示為轉基因植株。
具體實施例方式植物轉基因技術在改善生物的抗性、提高生物品質、創(chuàng)造新種質或品種、人類保健和醫(yī)藥等方面具有較大應用前景。生物技術作為輔助手段可以解決一些常規(guī)技術難以解決的問題，使農業(yè)出現一次新的產業(yè)革命。轉基因技術不受作物種間限制，將控制某生物性狀的目的具有從生物中取出，通過基因操作，將其導入待改良的寄主細胞內并表達，從而培育出新品種。這一技術可大大提高育種效果，加速育種進程，豐富農作物的營養(yǎng)和功能，延長保質期，去除過敏成分，提高作物耐高溫、鹽堿、病害等抗逆性。植株組織培養(yǎng)再生體系的建立是進行基因遺傳轉化的基礎。自從首次開展辣椒組織培養(yǎng)工作以來，國內外相繼出現采用不同的辣椒外植體，如子葉、莖尖、莖段、葉片、下胚軸、子葉柄、花藥及其原生質體等進行組織培養(yǎng)的報道。但辣椒組織培養(yǎng)具有很強的基因型特異性，再生效率不理想，在多數試驗中植株的再生周期長或分化頻率低，其不定芽的生長能力較差，有的甚至停留在芽誘導階段而不能進一步生長，這在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究進展。而利用未成熟胚作為轉基因受體材料具有再生能力強、取材方便、基因型豐富、群體數量大等優(yōu)點，因此對未成熟胚進行離體培養(yǎng)可以更好地控制遺傳轉化和植株再生條件，快速獲得多種基因型的轉基因材料，以及容易獲得體細胞無性系變異材料。我們應用本發(fā)明的方法，通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚可在短時間內獲得了轉基因再生植株。本實例就以辣椒未成熟為材料，采用本發(fā)明方法通過農桿菌侵染未成熟胚在50 天之內獲得轉基因再生植株。含有目的基因掌葉半夏凝集素基因PPA的農桿菌LBA4404 可以從市面購得或采用經典分子生物學操作方法獲取(參見Sambrook J, Fristsh E F, Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed.NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。實施過程如下
1)取樣在果實采摘期晴天從健壯植株上取自然成熟的紅果，授粉后4(Γ50天；
2)農桿菌活化和侵染將含有目的基因(掌葉半夏凝集素基因ΡΡΑ，基因全長777bp)的農桿菌LBA4404接種于含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB的固體培養(yǎng)基上，27 °C 暗培養(yǎng)2天后，挑單菌落接種至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，27°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至0D_值為0. 4 06，將菌液轉入50mL離心管中，4000rpm離心菌液后，用等體積的無菌水懸浮菌液后備用。取1)中果實的種子，用解剖 刀將其一分為二，隨后取出未成熟胚轉移至已準備好的農桿菌菌液中，浸沒5分鐘；
3)再生培養(yǎng)基(R培養(yǎng)基)和篩選培養(yǎng)基(S培養(yǎng)基)制備R和S培養(yǎng)基所用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，所用碳源為蔗糖，凝固劑為瓊脂。R培養(yǎng)基的組成成分為MS+2mg/L 6-BA+3%wt 蔗糖+0. 8%wt瓊脂，S培養(yǎng)基的組成成分為MS+2mg/L 6-BA+3%wt蔗糖+0. 8%wt瓊脂+60mg/ L卡那霉素；
4)未成熟胚接種和培養(yǎng)將2)中侵染的未成熟胚在滅菌濾紙上浙干菌液后，置于3)中 R培養(yǎng)基上培養(yǎng)先在27°C黑暗條件下培養(yǎng)3天后用無菌水沖洗數次外植體，轉移到篩選培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)1周，后于光照度20001χ、光照時間12h、室溫27°C下繼續(xù)培養(yǎng)，每三角瓶放30個未成熟胚；
5)不定芽形成和植株再生接種后一周，可觀察到未成熟胚膨大。繼續(xù)培養(yǎng)三周后，可陸續(xù)觀察到不定芽的出現，隨后形成根、芽、葉俱全的完整植株；
6)轉基因植株的PCR鑒定以再生植株的葉片為材料提取基因組DNA，利用所轉化基因的序列設計特異引物對DNA進行擴增，以質粒和水為對照。
權利要求
1.一種快速獲得辣椒轉基因植株的方法，其特征在于包含下列步驟1)取樣在果實采摘期晴天從健壯植株上取自然成熟的紅果；2)農桿菌活化和侵染將含有目的基因的農桿菌LBA4404接種于含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB的固體培養(yǎng)基上，27°C暗培養(yǎng)2天后，挑單菌落接種至含有 45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，27°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至0D_值為0. 4 06，將菌液轉入50mL離心管中，4000rpm離心菌液后，用等體積的無菌水懸浮菌液后備用；取1)中果實的種子，取出未成熟胚轉移至已準備好的農桿菌菌液中，浸沒5分鐘；3)再生培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基制備再生和篩選培養(yǎng)基所用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基， 所用碳源為蔗糖，凝固劑為瓊脂；再生培養(yǎng)基的組成成分為MS+f5mg/L 6-BA+3%wt蔗糖 +0. 8%wt瓊脂，篩選培養(yǎng)基的組成成分為MS+l 5mg/L 6-BA +3%wt蔗糖+0. 8%wt瓊脂+60mg/ L卡那霉素；4)未成熟胚接種和培養(yǎng)將2)中侵染的未成熟胚在滅菌濾紙上浙干菌液后，置于3)中再生培養(yǎng)基上，在27°C黑暗條件下培養(yǎng)后用無菌水沖洗外植體，轉移到篩選培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)，然后于光照度20001x、光照時間12h、室溫27°C下繼續(xù)培養(yǎng)，每三角瓶放30個未成熟胚；5)不定芽形成和植株再生接種后四周形成完整植株。
2.根據權利要求1所述的獲取辣椒轉基因植株的方法，其特征在于再生培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基制備過程中，再生和篩選培養(yǎng)基組成中BA的濃度為2mg/L。
3.根據權利要求1所述的獲取辣椒轉基因植株的方法，其特征在于未成熟胚接種和培養(yǎng)過程中，將2)中侵染的未成熟胚在滅菌濾紙上浙干菌液后，置于3)中再生培養(yǎng)基上，先在27°C黑暗條件下培養(yǎng)廣5天后用無菌水沖洗外植體，轉移到篩選培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)5 10 天。
全文摘要
一種快速獲得辣椒轉基因植株的方法，該方法包括取樣；農桿菌活化和侵染；再生培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基制備；未成熟胚接種和培養(yǎng)；不定芽形成和植株再。在短時間內即可高效地獲得辣椒轉基因再生植株。本發(fā)明從農桿菌侵染未成熟胚到再生植株的獲得一般需要7周時間，培養(yǎng)過程中再生植株形成率最高可達50%，轉基因植株陽性率高達80%。該發(fā)明中以未成熟胚為受體材料進行農桿菌侵染、接種培養(yǎng)后直接形成再生植株，縮短了培養(yǎng)周期、提高了培養(yǎng)效果和遺傳轉化效率，本發(fā)明若應用于基因功能驗證和育種實踐，必將大大加快辣椒基因功能組學的研究和育種實踐進展。
文檔編號A01H5/00GK102286526SQ20111023105
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權日2011年8月12日
發(fā)明者刁衛(wèi)平, 劉金兵, 戈偉, 潘寶貴, 王述彬 申請人:江蘇省農業(yè)科學院