專利名稱：ATPase蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種ATPase蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
南極魚是已知的最耐寒的魚類，其細胞可以在_1°C -2°C的低溫中完成包括個體發(fā)育在內(nèi)的所有生命活動，寒冷環(huán)境下進化形成的基因組編碼了低溫下生存所需的所有功能分子，是重要的基因資源。生活在南極的魚類表現(xiàn)出了一系列與抗寒相關(guān)的生理和生化性狀，如抗凍蛋白的進化、熱休克應(yīng)答(the heat-shock response, HSR)的缺失,血液中紅血球大量減少甚至消失，肌纖維的數(shù)目減少，直徑卻增大等等。因此，對生活在不同溫度環(huán)境下的南極魚類基因組的比較分析，以及相關(guān)基因的克隆鑒定、功能分 析及其作用機制研究，有助于理解南極魚類在0°C以下這樣極端的低溫環(huán)境下生存的機制。冷暖空氣的活動是天氣變化的基本原因之一。在特定的天氣形勢下，聚積在高緯度地區(qū)的強冷空氣迅速南下，入侵我國，造成大范圍的劇烈降溫，并伴有大風、雨雪、凍害等現(xiàn)象，這類天氣過程稱為寒潮或強冷空氣，由此所造成的損失稱為寒潮與冷凍災(zāi)害。寒冷的氣候會造成農(nóng)作物的大量減產(chǎn)，在美國，每年由于寒冷而導(dǎo)致農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失達幾十億美元，例如1998年12月份，加利福尼亞州由于冰凍災(zāi)害而柑橘大面積死亡，直接經(jīng)濟損失達5億9千萬美元。在中國每年平均有6-7億畝農(nóng)田蒙受寒冷的氣候的危害，糧食減收200億公斤(中國可持續(xù)發(fā)展信息網(wǎng)2003. 10. 13)。因此，如何能使農(nóng)作物免受寒冷的災(zāi)害成為研究的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，是將ATPase蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述ATPase蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述ATPase蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。所述ATPase蛋白的編碼基因通過如下重組載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述重組載體為如下A或B : A所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pCPAE2載體中，表達所述編碼基因的重組載體；B所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pHQSN載體中，表達所述編碼基因的重組載體。所述耐逆性為耐寒性。所述轉(zhuǎn)ATPase基因植株耐寒性通過增加株高、提高存活率和/或降低細胞質(zhì)膜相對透性來體現(xiàn)，主要通過降低細胞質(zhì)膜相對透性來體現(xiàn)。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為煙草或擬南芥。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組載體。
本發(fā)明提供的重組載體，為如下A或B :A所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pCPAE2載體中，表達所述編碼基因的重組載體；B所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pHQSN載體中，表達所述編碼基因的重組載體。所述A所示的重組載體為將所述基因插入pCPAE2載體MluI和EcoRI酶切位點間，表達所述基因的重組載體；所述B所示的重組載體為將所述基因插入pHQSN載體中MluI和EcoRI酶切位點間，表達所述基因的重組載體。所述ATPase蛋白、所述ATPase蛋白的編碼基因和/或所述重組載體在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。所述耐逆性為耐寒性；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為煙草或擬南芥。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明以南極魚Dissostichus mawsoni這個特殊的物種為研究材料，利用cDNA文庫的構(gòu)建和測序的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了可能具有抗寒功能的ATPase基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植物在低溫下確實具有抗寒的功能，比野生型植物耐寒性聞，證實該基因為與耐寒相關(guān)的基因。


圖I為改造后的pCAPE2煙草表達載體圖2為擬南芥表達載體載體pHQSN圖3為轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR圖4為轉(zhuǎn)基因煙草的表型圖5為轉(zhuǎn)基因煙草膜透性圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性篩選圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR圖8為轉(zhuǎn)基因擬南介的表型圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥膜透性
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實驗儀器、各種試劑及試劑盒實驗儀器_200C >4 0C 冰箱(Haier，AUCMA)「80 °C ULT Freezer (ThermoForma) ；PTC-200 PCR 儀(MJ Reaserch) ；TP-600 PCR 儀(TakaRa) ;5417R、5810R 和5417D 高速冷凍臺式離心機(Eppendorf) ； Sub-Ce 11 GT Agarose Gel ElectrophoresisSystems (Bio-Rad) ;YLN_2000凝膠成像系統(tǒng)(北京亞力恩機電技術(shù)研究所)；DH4000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)；GXZ智能型光照培養(yǎng)箱(江南儀器)；BIO-RAD電泳儀(北京伯樂)；超凈無菌操作臺；PB-21PH計；勻漿器；制冰機；高壓滅菌鍋；水浴鍋；烤箱；微波爐；可調(diào)微量移液槍(Eppendorf) ;25°C常溫培養(yǎng)室；4°C低溫培養(yǎng)室；研缽；研磨器；搖床；離心管。試劑限制性內(nèi)切酶、RNase A等購自大連寶生物工程公司；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購自NEB公司，TRIzol 試劑購自Invitrogen生物公司；胰蛋白胨,酵母提取物，瓊脂粉，抗生素，購自鼎國公司和Takara公司；試劑盒QIAquickGel Extraction Kit (QIAGEN, Cat. No. 28704) ；Plasmid minikit(OMEGA，Cat.D6944-01) ；RNA Isolation Kit(TIANZE)樣品南極魚(Dissostichusmawsoni ；Aspects of body size and gonadalhistology in the Antarctic toothfish，Dissostichus mawsoni, from McMurdo Sound，Antarctica. Eastman JT, DeVries AL. Polar Biol. (2000) 23 :189-195.，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)·菌株大腸桿菌XLlO-Gold(購自 Stratagene 公司，Cat. NO. 200315);農(nóng)桿菌GV3103 (中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中心,Biovector Science Lab. Inc, BV93526)；農(nóng)桿菌EHA105 (中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中心，Biovector Science Lab. Inc,BV93526)。質(zhì)粒煙草表達載體PEBV-VIGS載體系統(tǒng)，由兩個T-DNA質(zhì)粒(pCAPEl，pCAPE2 (pCAPE2結(jié)構(gòu)示意圖如圖I所示))組成；PCAPEI, pCAPE2 均記載在 Constantin, G. D. , B. N. Krath, S. A. MacFarlane,M. Nicolaisen, I.Ε.Johansen, and 0.S. Lund. 2004. Virus-induced gene silencing as atool for functional genomics in a legume species. Plant J 40 :622_631,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。)。擬南芥表達載體載體pHQSN (載體pHQSN是由表達載體pCAMBIA1390改造而來的，該載體由華南師范大學(xué)李洪清教授改造而來，載體PHQSN的文章詳細出處Improvement of Torenia fournieri salinity tolerance by expression ofArabidopsis AtNHX5. Le-Yi Shi,Hong-Qing Li,Xiao-Ping Pan,Guo-Jiang Wu and Mei-RuLi. Functional Plant Biology, 2008-CSIR0.，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。原表達載體PCAMBIA1390的詳細出處為The small, versatile pPZP familyof Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Hajdukiewicz,P. ,Svab,Z. and Maliga，P. Plant Mol. Biol. 25 (6)，989-994 (1994) ·具有 35S 啟動子和 NOS 終止子，如圖2所示。煙草(本塞姆氏煙草，Nicotiana Benthamiana),購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。以下簡稱野生型煙草；擬南芥(Arabidopsisthaliana(L. )Heynh, Columbia(Col)),以下簡稱野生型擬南芥。實施例I、ATPase基因的獲得
I、ATPase基因全長序列的獲取根據(jù)文庫EST測序的結(jié)果設(shè)計PCR引物Gene_ATPase MluI/EcoRI (供煙草表達載體 pCAPE2)ATPase 1_F :5_AT ACGCGT ATGTCGGCCGAAAGTC-3 (序列 3)ATPase 1_R :5_CGG GAATTC TTATTTCGTGGAGAGGA-3 (序列 4)Gene_ATPase XbaI/BamHI (供擬南芥表達載體 pHQSN)ATPase2_F :5_AT TCTAGA ATGTCGGCCGAAAGTCCCGA-3 (序列 5)
ATPase2_R :5_AT GGATCC TTATTTCGTGGAGAGGATCAG-3 (序列 6)提取南極魚Dissostichus mawsoni的肝臟的RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板,分別用引物對ATPase l_F、ATPase 1_1 和引物對ATPase 2_F、ATPase 2_1 進行擴增，得到PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物2。將PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物2送去測序，結(jié)果為PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物2均具有序列表中序列I所示的核苷酸，該PCR產(chǎn)物的基因命名為ATPase，其編碼區(qū)為序列表中的序列I自5’末端第1-462位核苷酸。該基因編碼的蛋白命名為ATPase，其氨基酸序列為序列表中的序列2。序列I由462個核苷酸組成，序列2由153個氨基酸組成。也可人工合成序列I，分別以引物對ATPase l_F、ATPase 1_1 和引物對ATPase 2_F、ATPase 2_R進行擴增，得到PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物2。2、重組載體的獲得用MluI和EcoRI酶切PCR產(chǎn)物1，得到的目的片段與經(jīng)過同樣酶切的載體pCPAE2連接，得到連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入PCPAE2的MluI和EcoRI酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為 pCPAE2-ATPase。用XbaI和BamHI酶切PCR產(chǎn)物2，得到的目的片段與經(jīng)過同樣酶切的載體pHQSN連接，得到連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中的序列I插入PHQSN的XbaI和BamHI酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為 pHQSN-ATPase。實施例2、轉(zhuǎn)ATPase植物的功能研究一、轉(zhuǎn)ATPase煙草的獲得及功能研究I、轉(zhuǎn)ATPase煙草的獲得及鑒定I)煙草材料的準備25°C培養(yǎng)間內(nèi)，16小時光照，8小時黑暗，蛭石中生長的野生型煙草苗，長到5-6片展開葉即為受體煙草。2)重組農(nóng)桿菌的制備將由實施例I得到的重組載體pCPAE2_ATPase轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3103中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pCPAE2-ATPase,含有該質(zhì)粒的重組菌命名為 GV3103/pCPAE2-ATPase。3)轉(zhuǎn)ATPase煙草的獲得(I)挑取 Gv3IoVpCPAE2-ATPase 劃線 28°C培養(yǎng)過夜；(2)挑取上述過夜菌接種到5ml LB (Rif終濃度50mg/l，Kana終濃度50mg/l)，)Rif 中28 °C培養(yǎng)過夜；(3)將上述過夜的菌液轉(zhuǎn)接到 5Oml LB (IOmM MES+20 μ M Acetosyringone+Kana)中，28 °C培養(yǎng)過夜；(4)離心收集上述菌液，然后重懸在LB(10mM MgCl2+10mM MES+200 μ MAcetosyringone)中，調(diào) OD600 = 2. O,在室溫(25°C )下靜置 3 小時；(5)將pCAPEl和pCAPE2兩個載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，挑取陽性克隆搖菌，將取搖好的含有PCAPEl和pCAPE2表達載體的菌液以I : I的比例混合注射受體煙草，注射時要注射近軸端的嫩葉，得到8株TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草。4)、轉(zhuǎn) ATPase 煙草 RT-PCR 鑒定提取TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，以ATPase 1_F、ATPase 1_R為引物，進行RT-PCR，以野生型煙草作為陰性對照，結(jié)果如圖3所示，其中，I為DL2000Marker, 2為陽性對照pCPAE2_ATPase，3為TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草，4為陰性對照(野生型煙草)，5為未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的TO代煙草RNA為模板的PCR產(chǎn)物，6為水為模板的PCR產(chǎn)物，可以看出，得到462bp的為陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草。采用同樣的方法，將空載體pCPAE2轉(zhuǎn)入野生型煙草中，得到TO代轉(zhuǎn)空載體煙草，提取TO代轉(zhuǎn)空載體煙草葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，以ATPase 1_F、ATPase 1_R為引物，沒有得到目的片段，說明得到TO代轉(zhuǎn)空載體煙草。2、轉(zhuǎn)ATPase煙草的功能研究I)表型分析將3周苗齡的陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草正常條件下23°C，16h光照/8h黑暗，生長14天后，置于4°C，16h光照/8h黑暗，生長20天后，再置于23°C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長15天，以TO代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草為對照。觀察表型，結(jié)果如圖4所示，其中，A為陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)和野生型煙草(GFP)在正常條件下23°C，16h光照/8h黑暗，生長14天的結(jié)果，B為陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)和野生型煙草(GFP)在4°C，16h光照/8h黑暗，生長20天的結(jié)果，C為陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)和野生型煙草(GFP)再置于23°C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長15天的結(jié)果，可以看出，A中，在正常條件下，陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)和野生型煙草(GFP)生長無顯著差異，B中，野生型煙草(GFP)有明顯的冷傷害的表型，植株莖干彎曲，植株矮小，而陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)則在4°C低溫處理后生長依舊良好，低溫處理并沒有導(dǎo)致其有不良反應(yīng)。C中，恢復(fù)培養(yǎng)后，野生型煙草(GFP)在冷處理受到低溫傷害后再置于正常溫度下培養(yǎng)，依舊不能恢復(fù)到正常的生長狀態(tài)，說明4°C的低溫處理對煙草的傷害是可見的，而陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(ATPase)，4°C冷處理20天后，置于23°C恢復(fù)生長15天后，植株能夠繼續(xù)正常生長發(fā)育，沒有表現(xiàn)出任何低溫所造成的傷害性狀。在4°C處理20天后，每個株系取3株測其株高，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值，統(tǒng)計分析使用SPSS-Oneway(Duncan)方法，TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草株高平均值為36cm,標準誤為36±0. 30551，而野生型煙草(GFP)株高平均值為28cm，標準誤為28±0. 34641。TO代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。2)煙草生理指標的測定
為了進一步證實轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力，測定了轉(zhuǎn)基因植株細胞質(zhì)膜相對透性(膜透性)生理指標。植物組織受到逆境傷害時，由于膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，而使其透性增大，細胞內(nèi)各 種水溶性物質(zhì)包括電解質(zhì)將有不同程度的外滲，將植物組織浸入無離子水中，水的電導(dǎo)將因電解質(zhì)的外滲而加大，傷害愈重，外滲愈多，電導(dǎo)度的增加也愈大。所以說膜透性越高，說明植物受傷害越重，反之，受傷害越輕。細胞質(zhì)膜相對透性的測定參考李錦樹的方法(李錦樹；王洪春；王文英；朱亞芳Effect of drought on the permeability and membrane lipid composition from maize leaves植物生理學(xué)報1983年第09期)，用DDS-IlC電導(dǎo)儀型電導(dǎo)儀測定取第二片成熟葉，先用蒸餾水洗TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草葉片，在用去離子水沖洗，然后用直徑0. 5cm的打孔器取圓片5片，后置于盛IOml雙蒸水的試管中，室溫下靜置2h，然后用電導(dǎo)儀測滲出液電導(dǎo)值SI，然后將試管置于沸水浴20min，殺死組織，冷卻至室溫后再用上述方法測其電導(dǎo)值S2，以相對電導(dǎo)率(％ )表示葉片細胞質(zhì)膜相對透性(S1/S2)，測定重復(fù)5次。以TO代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草為對照。每個株系3株，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖5所示，其中，ATPaselI為陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草，GFP為TO代轉(zhuǎn)空載體煙草，從圖中看出，4°C處理前，ATPasell的膜透性的值為23. 54% ；GFP的膜透性值為25. 25%。4°C處理20天后，ATPase 11的膜透性的值為53. 98%；GFP的膜透性值為66. 59%。4°C處理后恢復(fù)7天后，ATPasell的膜透性的值為44. 58 % ；GFP的膜透性值為62. 99%。從圖中看出，TO代轉(zhuǎn)空載體煙草的膜透性在冷處理前和陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(T0代轉(zhuǎn)ATPase煙草)基本上是一樣的，而且隨著冷凍時間的加長，TO代轉(zhuǎn)空載體煙草和陽性TO代轉(zhuǎn)ATPase煙草(T0代轉(zhuǎn)ATPase煙草)的膜透性開始有明顯的差別，而且隨著冷處理時間的加長，兩組煙草的差別越大，這個說明實驗組轉(zhuǎn)ATPase的煙草植株對低溫的抗性比空載體煙草組效果好。TO代轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。由此可以確定，在南極魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的ATPase這個新基因確實具有一定的抵御寒冷的功能。二、轉(zhuǎn)ATPase擬南芥的獲得及功能研究I、轉(zhuǎn)ATPase擬南芥的獲得及鑒定I)擬南芥材料的準備將野生型擬南芥在(白天溫度為22 24°C，夜溫比日溫低2°C，濕度為60% 70%，光強為150μπιο1 ·8/πΓ2)生型WEI潮霉素抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，凡是有20-30個花序并且還有一些成熟的果莢，轉(zhuǎn)化前剪掉成熟的果莢和已經(jīng)開了的花序，僅露露白的花苞，即為用于轉(zhuǎn)化的擬南芥。2)重組農(nóng)桿菌的制備將由實施例I得到的重組載體pHQSN-ATPase轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，得到重組菌，提取重組菌的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為pHQSN-ATPase,含有該質(zhì)粒的重組菌命名為EHA105/pHQSN-ATPase。
3)轉(zhuǎn)ATPase擬南芥的獲得(I)取 EHA105/pHQSN-ATPase 菌液 IOOul 于 5ml 含有卡那霉素(75mg/L)和利福平(60mg/L)抗生素的LB液體培養(yǎng)基試管中，200rpm，28°C活化2天。(2)在懸浮好的菌液中加入Silwet-77，濃度為O. 02% (vol/vol)。把用于轉(zhuǎn)化的擬南芥倒浸入盛有菌液的燒杯中2min，之后套上保鮮膜，然后倒伏，遮光一天后恢復(fù)正常培養(yǎng)(白天溫度為22 24°C，夜溫比日溫低2°C，濕度為60% 70%，光強為150μπιο1 · s/m_2)，得到20株Tl代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥。3)轉(zhuǎn)ATPase擬南芥抗性篩選潮霉素抗生素篩選陽性植株由于表達載體pHQSN在植物中具有潮霉素抗性，所 以陽性轉(zhuǎn)基因植株在添加潮霉素抗生素的培養(yǎng)基上可以正常生長，野生性植株則不能正常生長。轉(zhuǎn)化的當代植株記為TO代，收獲TO代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥的種子，得到TI代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥種子，播種在加有潮霉素抗生素的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基購自廣州齊云生物有限公司，使用的潮霉素終濃度為50mg/l。)上培養(yǎng)，長有真葉并且根比較長的綠苗都是陽性植株，黃化苗及死苗都是野生型植株。從Tl代植株上單株收獲的種子記為T2代。一般認為目標基因在Tl代轉(zhuǎn)基因植株中是雜合的，T2代植株應(yīng)該出現(xiàn)3 I分離現(xiàn)象。因此T2代幼苗同樣要在加有潮霉素抗生素的培養(yǎng)基上篩選，綠苗中帶純合基因的植株和雜合植株的比例應(yīng)該是I : I。從T2代綠苗上單株收獲的種子記為T3代，T3代植株在加有潮霉素抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，凡是沒有出現(xiàn)分離的則為純合陽性植株，出現(xiàn)分離的則為雜合陽性植株?；焓占兒现仓甑姆N子，記為T4代純合株系，得到了兩個超表達陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥株系，分別為ATP8和ATPaselI。具體結(jié)果如圖6所示，其中，a為Tl代幼苗在添加潮霉素抗生素的MS培養(yǎng)基上的生長情況，bl，b2為T2代幼苗在添加潮霉素抗生素的MS培養(yǎng)基上的生長情況，分離比為3 1，cl，c2為T3代幼苗在添加潮霉素抗生素的MS培養(yǎng)基上的生長情況，得到兩個純合體株系，col為哥倫比亞野生型擬南芥，ATPase為轉(zhuǎn)ATPase擬南芥，從圖中看出，T3代植株在加有潮霉素抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，沒有出現(xiàn)分離的則為純合陽性植株超表達株系，即得到了兩個超表達陽性T3代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥株系，分別為ATP8和ATPasell。5)轉(zhuǎn)ATPase擬南芥半定量RT-PCR鑒定分別提取野生型(col)和編號為ATP8和ATPasell的陽性T3代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥純合體(以在MS培養(yǎng)基上生長7天的野生型和兩個純合株系的整個植株為材料，分別稱取O. 15g提取RNA)的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，以ATPase 2_F、ATPase 2_R為引物，以擬南芥的actin為內(nèi)參，內(nèi)參引物為ActinF CTACGAGCAGGAACTCGAGA ；ActinRGATGGACCTGACTCGTCATAC，進行RT-PCR，以野生型擬南芥作為陰性對照，結(jié)果如圖7所示，其中，col為野生型擬南芥，可以看出，編號為ATP8和ATPasell的陽性T3代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥中均有462bp的片段，進一步證明，ATPase得到表達，得到的為陽性的T3代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥。采用同樣的方法，將空載體pCPAE2轉(zhuǎn)入野生型煙草中，得到TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥，提取TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，以ATPase 2_F、ATPase2_尺為引物，沒有得到目的片段，說明得到TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥，收獲TO代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子，播種，繼續(xù)傳代，得到T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥。2、轉(zhuǎn)ATPase擬南芥的功能研究I)表型分析將3周苗齡編號為ATP8和ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (純合體)以及野生型擬南芥在22°C，16h/8h正常培養(yǎng)條件下生長3周后，置于4°C，16h光照/8h黑暗條件，生長28天后，再置于22°C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長7天，以T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥為對照。觀察表型，結(jié)果如圖8所示，其中，A為ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)在正常條件下22°C，16h/8h光照條件下生長3周的結(jié)果，B為ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)在4°C，16h光照/8h黑暗條件生長3天的結(jié)果， C為ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)在4°C，16h光照/8h黑暗條件生長7天的結(jié)果，D為ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合撈系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)在4°C，16h光照/8h黑暗條件生長14天的結(jié)果，E為ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)再置于22°C，16h光照/8h黑暗，恢復(fù)生長7天的結(jié)果，可以看出，A中，在正常條件下，ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系11)擬南芥(ATP)和野生型擬南芥(col)生長無顯著差異，B中，野生型擬南芥(col)和超表達株系在低溫處理3天后差異不太顯著，但野生型較超表達株系矮小。C和D中，野生型擬南芥(col)隨著冷處理時間增長，冷傷害的表型也加劇，葉片萎靡，植株矮小，而ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系)擬南芥(ATP)則在4°C低溫處理后生長依舊良好。E中，恢復(fù)培養(yǎng)后，野生型擬南芥(col)在冷處理受到低溫傷害后再置于正常溫度下培養(yǎng)，依舊不能恢復(fù)到正常的生長狀態(tài)，說明4°C的低溫處理對煙草的傷害是可見的，而ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系)擬南芥(ATP)恢復(fù)生長后，植株能夠繼續(xù)正常生長發(fā)育，沒有表現(xiàn)出任何低溫所造成的傷害性狀。4°C處理7天后，每個株系取20株測其存活率，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值，統(tǒng)計分析使用SPSS-Oneway(Duncan)方法，ATPase超表達純合株系11存活率為72%，標準誤為
O.72±0. 009866，而野生型擬南芥(col)的存活率為15%，標準誤為O. 15±0. 006083。T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的結(jié)果無顯著差異。2)擬南芥生理指標的測定為了進一步證實轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力，測定了轉(zhuǎn)基因植株細胞質(zhì)膜相對透性生理指標。檢測ATPase 11的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase (ATPase超表達純合株系)擬南芥(ATP)膜透性，以野生型擬南芥和T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥為對照。每個株系10株，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值。細胞質(zhì)膜相對透性的測定參考李錦樹的方法(李錦樹；王洪春；王文英；朱亞芳Effect of drought on the permeability and membrane lipid composition from maize leaves植物生理學(xué)報1983年第09期)，用DDS-IlC電導(dǎo)儀型電導(dǎo)儀測定取第二片成熟葉，先用蒸餾水洗葉片，在用去離子水沖洗，然后用直徑O. cm的打孔器取圓片5片，后置于盛IOml雙蒸水的試管中，室溫下靜置2h，然后用電導(dǎo)儀測滲出液電導(dǎo)值SI，然后將試管置于沸水浴20min，殺死組織，冷卻至室溫后再用上述方法測其電導(dǎo)值S2，以相對電導(dǎo)率(％ )表示葉片細胞質(zhì)膜相對透性(S1/S2)，測定重復(fù)5次。結(jié)果如圖9所示，4°C處理前，ATPase11的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(ATP) (ATPase超表達純合株系)的膜透性的值為12. 27%，野生型擬南芥的膜透性的值為13. 66%
4°C處理28天后，ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(ATP) (ATPase超表達純合株系)膜透性的值為38. 19%，野生型擬南芥膜透性的值為62. 08%4°C處理后恢復(fù)7天后，ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(ATP) (ATPase超表達純合株系)的膜透性的值為25. 78%,T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的膜透性的值為55. 42%。從圖中看出，野生型擬南芥的膜透性在冷處理前和ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(ATPase超表達純合株系)基本上是一樣的，而且隨著冷凍時間的加長，野生型擬南芥和ATPase11的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(超表達純合株系)的膜透性開始有明顯的差別，而且隨著冷處理時間的加長，兩組擬南芥的差別越大，這個說明實驗組ATPasell的陽性T4代轉(zhuǎn)ATPase擬南芥(超表達純合株系)植株對低溫的抗性比野生型擬南芥效果好。野生型擬南芥和T4代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無顯著差異。由此可以確定，在南極魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的ATPase這個新基因確實具有一定的抵御寒冷的功能，而且對改善植物的耐寒品質(zhì)，提高其抵抗自然低溫災(zāi)害的方面有著重要的現(xiàn)實意義。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將ATPase蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物； 所述ATPase蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 所述ATPase蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述ATPase蛋白的編碼基因通過如下重組載體導(dǎo)入所述目的植物中； 所述重組載體為如下A或B : A所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pCPAE2載體中，表達所述編碼基因的重組載體； B所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pHQSN載體中，表達所述編碼基因的重組載體。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐寒性。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)ATPase基因植株耐寒性通過增加株高、提高存活率和/或降低細胞質(zhì)膜相對透性來體現(xiàn)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
7.一種重組載體，為如下A或B: A所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pCPAE2載體中，表達所述編碼基因的重組載體； B所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pHQSN載體中，表達所述編碼基因的重組載體。
8.如權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于 所述A所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pCPAE2載體的多克隆位點間得到的表達所述編碼基因的重組載體； 所述B所示的重組載體為將所述ATPase蛋白的編碼基因插入pHQSN載體的多克隆位點間得到的表達所述編碼基因的重組載體。
9.所述ATPase蛋白、所述ATPase蛋白的編碼基因和/或權(quán)利要求7或8所述重組載體在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐逆性為耐寒性；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ATPase蛋白在植物耐逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將ATPase蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫侥湍嫘愿哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物；所述ATPase蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明以南極魚Dissostichus mawsoni這個特殊的物種為研究材料，利用cDNA文庫的構(gòu)建和測序的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了可能具有抗寒功能的ATPase基因，并將其轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植物在低溫下確實具有抗寒的功能，比野生型植物耐寒性高，證實該基因為與耐寒相關(guān)的基因。
文檔編號A01H5/00GK102952816SQ20111024291
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者陳良標, 彭長連 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所