專利名稱：一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應(yīng)用的制作方法
一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應(yīng)用
背景技術(shù)：
隨著人類對(duì)環(huán)境保護(hù)和自身健康的日益關(guān)注，大力推廣生物農(nóng)藥已成為全球農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。白僵菌作為一種廣譜性病原真菌，因其具有易于生產(chǎn)、寄主范圍廣、侵染期長(zhǎng)、不傷害人和其他脊椎動(dòng)物及可貴的流行潛力等優(yōu)點(diǎn)而成為目前世界上研究和應(yīng)用最多的為微生物農(nóng)藥之一。本發(fā)明中所用的菌株(球孢白僵菌CCTCC No :M209238)對(duì)目前茶樹頭號(hào)害蟲—— “假眼單胞小綠葉蟬”有顯著防治效果。然而，白僵菌孢子制劑在制備、保藏和使用過程中， 都會(huì)因受到熱損傷而導(dǎo)致孢子活性降低甚至死亡。其中，制備過程中的熱來自干燥，保藏過程中的熱來自保藏環(huán)境，使用(田間應(yīng)用)過程中的熱來自陽光照射或寄主的行為發(fā)熱。因此，提高白僵菌孢子的抗熱性，對(duì)提高其殺蟲率和生物防治效果至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法。為解決上述技術(shù)問題，提供如下技術(shù)方案將0. 1-0. 65g/mL甘露醇添加于球孢白僵菌的孢子懸浮液。所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No :M209238，該菌株信息已在中國專利200910264664. 8中公開，公布日2010年 6 月 9 日，公布號(hào) CN101724571A。優(yōu)選添加甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物于球孢白僵菌的孢子懸液，其中 0. 15-0. 35g/mL 甘露醇、0. 15-0. 35g/mL 葡萄糖和 0. 15-0. 35g/mL 乳糖。甘露醇及含甘露醇的混合物添加方法為取適量的甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物于25mL試管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐溫-80溶液，沸水浴并攪拌至糖類完全溶解，冰水浴冷卻后，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子懸浮液，并用振蕩器將其混勻。孢子抗熱性的檢測(cè)方法1)將添加了甘露醇或甘露醇混合物的孢子懸浮液均勻混合液置于45°c恒溫水浴鍋中，水浴10min(同時(shí)震蕩)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷卻；2)將冷卻后的混合液轉(zhuǎn)移到250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液，混勻，置于25°C，180r/min搖床中培養(yǎng)12h ；3)用膠頭吸管吸取一滴培養(yǎng)液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，并于電子顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算其孢子萌發(fā)率(當(dāng)芽管長(zhǎng)度不小于孢子直徑時(shí)，該孢子視為已萌發(fā))。本發(fā)明還提供了一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性方法的應(yīng)用，是將甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子懸液后進(jìn)行干燥處理或田間噴灑，有利于提高白僵菌孢子的存活率或殺蟲率。本發(fā)明的有益效果如下球孢白僵菌孢子可用于防治茶葉小綠葉 蟬，其孢子抗熱性的提高，降低了孢子在制劑制備和保藏過程中的熱損傷，也增加了球孢白僵菌孢子在田間應(yīng)用時(shí)對(duì)環(huán)境中高溫的抵抗能力，從而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，進(jìn)而提高其生物防治的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 孢子懸浮液以及營(yíng)養(yǎng)液的制備孢子懸浮液的制備1)洗脫。本發(fā)明所用的菌種為球孢白僵菌Beauveria bassiana(保藏編號(hào)為 CCTCC No :M209238)，取適量新鮮發(fā)酵培養(yǎng)物于250mL的三角瓶中，加入適量0. 05%的吐溫-80溶液和適量玻璃珠，用玻璃棒將培養(yǎng)物搗碎，用振蕩器高速振蕩至少lOmin。2)過濾。振蕩后，用2-4層紗布過濾，收集濾液。3)離心。將濾液離心，條件為8000r/min、5min、4°C，棄去上清。4)復(fù)溶。將離心后的沉淀物轉(zhuǎn)移到一 50mL離心管中，加入20-40mL 0.05%的吐溫-80溶液和10顆玻璃珠，用振蕩器高速震蕩至少20min。5)計(jì)數(shù)。取ImL上述復(fù)溶后的孢子懸浮液，用0. 05%的吐溫-80溶液稀釋50-100 倍后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。6)稀釋。計(jì)數(shù)后，將原孢子懸浮液用0. 05%的吐溫-80溶液稀釋到2 X 109孢子 /mL，待用。麩皮浸出液(營(yíng)養(yǎng)液)的制備稱取25g麩皮于鍋中，添加IOOOmL蒸餾水中，煮沸并攪拌，維持沸騰30min(以上)，冷卻后用2-4層紗布過濾，收集濾液，再用蒸餾水將濾液補(bǔ)足至IOOOmL,所得溶液即為濃度為2. 5%的麩皮浸出液，也是培養(yǎng)孢子懸浮液所用的營(yíng)養(yǎng)液。115°C，15min滅菌，待用。對(duì)比例對(duì)照1 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2.5%麩皮浸出液，混勻，置于251，180171^11搖床中培養(yǎng)12h ；用膠頭吸管吸取一滴培養(yǎng)液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，并于電子顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算其孢子萌發(fā)率(當(dāng)芽管長(zhǎng)度不小于孢子直徑時(shí)，該孢子視為已萌發(fā))。對(duì)照2 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液并將3g甘露醇溶解于混合液中，混勻，置于25°C，180r/min搖床中培養(yǎng) 12h;用膠頭吸管吸取一滴培養(yǎng)液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，并于電子顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算其孢子萌發(fā)率(當(dāng)芽管長(zhǎng)度不小于孢子直徑時(shí)，該孢子視為已萌發(fā))。對(duì)照3 將IOmL 1 X IO8孢子/mL孢子懸浮液置于250mL三角瓶中，再加入40mL 2. 5%麩皮浸出液并將1. 5g甘露醇、1. 5g葡萄糖和1. 5g乳糖溶解于混合液中，混勻，置于 25°C，180r/min搖床中培養(yǎng)12h ；用膠頭吸管吸取一滴培養(yǎng)液，滴到血球計(jì)數(shù)板上，并于電子顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算其孢子萌發(fā)率(當(dāng)芽管長(zhǎng)度不小于孢子直徑時(shí)，該孢子視為已萌發(fā))。結(jié)果見表1
表 權(quán)利要求
1.一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法，其特征在于，將ο. 1-0. 65g/mL甘露醇添加于球孢白僵菌的孢子懸浮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，將0.15-0. 35g/mL甘露醇、0. 15-0. 35g/mL 葡萄糖和0. 15-0. 35g/mL乳糖添加于球孢白僵菌的孢子懸浮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，具體添加方法如下取適量的甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖組成的混合物于25mL試管中，加入9. 5mL 0. 05%的吐溫-80溶液， 沸水浴并攪拌至糖類完全溶解，冰水浴冷卻后，加入0. 5mL 2 X IO9孢子/mL的孢子懸浮液， 并用振蕩器將其混勻。
4.權(quán)利要求1所述方法的應(yīng)用，是將甘露醇或甘露醇、葡萄糖、乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子懸液后直接田間噴灑或干燥處理后應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高球孢白僵菌孢子抗熱性的方法及其應(yīng)用，可用于白僵菌孢子制劑制備、保藏和田間應(yīng)用等領(lǐng)域，是將甘露醇或甘露醇與葡萄糖和乳糖的混合物添加于球孢白僵菌的孢子懸浮液。球孢白僵菌孢子可用于防治茶葉小綠葉蟬，其孢子抗熱性的提高，降低了孢子在制劑制備和保藏過程中的熱損傷，也增加了球孢白僵菌孢子在田間應(yīng)用時(shí)對(duì)環(huán)境中高溫的抵抗能力，從而提高了白僵菌孢子的存活率和侵染率，進(jìn)而提高其生物防治的效果。
文檔編號(hào)A01P7/04GK102304478SQ201110252908
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者劉龍, 堵國成, 李華祥, 李江華, 楊海泉, 陳堅(jiān) 申請(qǐng)人:江南大學(xué)