專利名稱：中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法。
背景技術(shù)：
中國地生蘭花種子極細(xì)，細(xì)如塵埃，種子內(nèi)僅有一個發(fā)育不完全的胚， 沒有胚芽和胚乳，不具備種子的基本結(jié)構(gòu)，沒有供其萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)，還不能稱其為種子， 只能稱其為原生細(xì)胞胚，加之有一層翅羽狀種皮，種皮不易吸收水分，如蓮瓣蘭種子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的營養(yǎng)物質(zhì)，在自然界中必須靠某種真菌菌絲穿透其種皮為其提供營養(yǎng)才能誘發(fā)根狀莖龍根，不同的蘭花所需的真菌各不相同，人們至今未能分離到能作用于中國蘭花的真菌，各科研機(jī)構(gòu)經(jīng)過多年研究，僅僅分離到可供腐生蘭天麻萌發(fā)的小菇真菌，和供其生長所需的密環(huán)菌。所以，人工繁殖天麻得以成功，其他蘭花還不能自然繁殖。用常規(guī)方法播種不能萌發(fā)，故需要人工突破種皮后再由培養(yǎng)基來供給養(yǎng)份才能使原生細(xì)胞胚萌發(fā)，突破種皮現(xiàn)有技術(shù)是用氫氧化鈉溶液或酸溶液來浸泡腐蝕種皮，破皮后氫氧化鈉溶液或酸溶液同時也腐蝕了細(xì)胞胚，使其失活，難以控制得恰到好處， 成功率極低，在加上中國地生蘭花不能誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，而是在未知真菌作用下偶然產(chǎn)生根狀莖龍根，龍根在底下潛伏生長多年后形成龍根蛋或龍根球后，才分化出蘭花實(shí)生苗，人工誘導(dǎo)根狀莖龍根目前是個技術(shù)難題，此技術(shù)以前一直以日本、臺灣領(lǐng)先，經(jīng)數(shù)十年研究， 國內(nèi)外有個別成功啟動的報道但很難實(shí)現(xiàn)重復(fù)成功啟動，再加上啟動根狀莖龍根成功率極低，一直以來未能達(dá)到批量生產(chǎn)目的，洋蘭(如大花蕙蘭和蝴蝶蘭)不產(chǎn)生根狀莖，直接由莖尖組織或種子產(chǎn)生原球莖，即可分化出從生芽，培養(yǎng)比較簡單所以日本、臺灣早已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，出口至世界各地賺取了大量外匯，而幽香高潔、號稱“王者之香”的中國地生蘭花至今不能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此在物以稀為貴的原因下，前幾年有人將國蘭炒到了幾十萬、甚至幾百萬一苗的天價，損害蘭花愛好者的利益。本發(fā)明旨在突破國蘭產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)瓶頸，并取得了成功。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，該方法能夠有效破解中國地生蘭花果實(shí)中細(xì)胞胚的種皮，同時又不損傷細(xì)胞胚本身，使細(xì)胞胚能吸收到周圍營養(yǎng)和水分，細(xì)胞能分化發(fā)育成種苗，并且有高的細(xì)胞胚啟動率，以此解決現(xiàn)有技術(shù)的難題。本發(fā)明提出的這種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟(1)蝸牛酶消化酶的提取從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天后用水沖洗干凈，輕輕敲碎，并小心剝?nèi)ネ鈿?，順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機(jī)以離心分層后，留上清液，棄掉沉淀物，用無菌濾膜注射器過濾純凈上清液待用；(2)細(xì)胞胚預(yù)處理選用尚未開裂的蘭花果實(shí)，表面用75%的酒精滅菌后，用10% 次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子， 將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分鐘，用滴管吸取少量含有細(xì)胞胚粉粒的液體在相差顯微鏡下觀察，在顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮開始降解時，立即停止浸泡并用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細(xì)胞胚粉粒；
(3)稀釋將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體營養(yǎng)液中稀釋；(4)接種將第C3)步含有細(xì)胞胚粉粒的液體培養(yǎng)液接種于試管中的基礎(chǔ)固體營
養(yǎng)基上；(5)暗培養(yǎng)接種好的試管在25°C恒溫狀態(tài)下在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)，直到可觀察到細(xì)胞胚粉粒開始膨大，細(xì)胞胚有絲分離開始；(6)光照培養(yǎng)此時轉(zhuǎn)為在1300LX光強(qiáng)下每天照射12h光照培養(yǎng)，恒溫25°C條件下靜置培養(yǎng)，直到可觀察到白色細(xì)胞團(tuán)膨大至l_3mm，顏色轉(zhuǎn)綠，在下部長出白色生長點(diǎn) 1-6個，逐漸向下鉆入固體營養(yǎng)基，此時已完成了試管內(nèi)蘭花根狀莖(又名“龍根”)啟動過程；(7)分化將根狀莖轉(zhuǎn)接于分化固體營養(yǎng)基中生長點(diǎn)朝下插入營養(yǎng)基，25°C光強(qiáng) 2000LX條件下，培養(yǎng)60d左右生長點(diǎn)開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉(zhuǎn)向折頭向上生長，直至鉆出固體營養(yǎng)基表面，這時生長點(diǎn)分化為芽點(diǎn)并長出子葉；(8)生根將根狀莖轉(zhuǎn)接于壯苗生根固體營養(yǎng)基上，芽點(diǎn)朝上根狀莖朝下，25°C光強(qiáng)2500LX條件下培養(yǎng)60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質(zhì)氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；(9)煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養(yǎng)基，用 1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發(fā)白時，移栽至經(jīng)高溫消毒的腐質(zhì)基質(zhì)中。第(1)步的消化酶上清液，現(xiàn)取現(xiàn)用，間隔不超過一天，以保持其活性。第⑵步有消化酶溶液配比組成是蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值調(diào)至5. 8，無菌水稀釋至100ml。第(3)步的啟動有絲分離液體培養(yǎng)基配方是N6+蔗糖20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液IOOml+活性碳2g。第⑷步的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基配方是1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300 的瓊脂粉3. 2g。第(7)步的分化固體營養(yǎng)基配方是1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+ 活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3. 7g。第(8)步的壯苗生根固體營養(yǎng)基配方1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥 IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3. 7g。第(5)步暗培養(yǎng)的時間為70-90天，一般以80天為宜。第(6)步的培養(yǎng)天數(shù)為40-60天，以50天為宜。本發(fā)明采用大蝸牛的消化酶，作用于地生蘭花原生細(xì)胞胚翅羽狀種皮，在不使用腐蝕性液體的條件下通過酶的作用降解了蘭花種皮，同時對中國地生蘭花原生細(xì)胞胚幾乎沒有損傷，極大提高了培養(yǎng)的成功率，甚至可實(shí)現(xiàn)有菌自然播種。發(fā)明人用此方法，實(shí)現(xiàn)了所有蘭科植物的原生細(xì)胞胚啟動根狀莖的無菌培養(yǎng)，甚至連豆瓣系蘭花這樣的被日本臺灣科學(xué)家稱為“單向基因，不太可能組培”的植物原生細(xì)胞胚啟動根狀莖的無菌培養(yǎng)成功率達(dá)到100%，其中蓮瓣蘭，豆瓣蘭，兜蘭，春蘭，寒蘭，綠蘭，秋枝，墨蘭，劍葉蘭等品系中，共實(shí)驗(yàn) 91個品種，所有受試品種達(dá)到驚人的100%培養(yǎng)成功，為此打開了號稱“王者之香”的中國地生蘭花的大批量人工培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸，解決了這個世界性難題。應(yīng)用該方法，我們在多年的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)出了蓮瓣蘭、豆瓣蘭、兜蘭、春劍、春
5蘭、寒蘭、綠蘭、秋枝、墨蘭、劍葉蘭等品系。所有受試蘭花品系中共實(shí)驗(yàn)91個品種全部啟動了根狀莖龍根的生成，細(xì)胞胚啟動率可達(dá)75%以上，全部分化出了完整的植株，平均每個蘭花果蓀可培養(yǎng)出3000-5000苗蘭花成苗，增加根狀莖龍根分化轉(zhuǎn)接次數(shù)可實(shí)現(xiàn)無限量中國地生蘭花種苗周年生產(chǎn)。中國蘭花是世界瀕危野生珍稀植物，其花香高雅、尊貴，國蘭精油是唯一無法人工合成的香料，價格是黃金的數(shù)十倍。更由于國蘭花種苗難育，傳統(tǒng)方式僅靠分株繁殖，數(shù)量十分稀缺，使得蘭花精油的價格逐年快速攀升。本發(fā)明從根本上解決了中國蘭花人工育苗的世界性難題，誰優(yōu)先知曉、掌握本發(fā)明誰就擁有巨大商機(jī)，形成壟斷，形成巨大產(chǎn)業(yè)。因此，本發(fā)明可能涉及國家重大經(jīng)濟(jì)利益。


圖1是蓮瓣蘭細(xì)胞胚經(jīng)消化酶處理后培養(yǎng)180天，啟動形成根狀莖向下生長實(shí)況圖。圖2蓮瓣蘭根狀莖轉(zhuǎn)瓶后180天形成龍根蛋實(shí)況圖。圖3是蓮瓣蘭龍根在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)120天后分化出完整小苗實(shí)況圖。圖4是出瓶移栽60天成活的蓮瓣蘭實(shí)況圖。
具體實(shí)施方式
下面是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)例1、蝸牛酶消化酶的提取(1)從田間收集足夠多的活大蝸牛；(2)活蝸牛饑餓兩天后；(3)用水沖洗干凈，輕輕敲碎，并小心剝?nèi)ネ鈿ぃ?4)順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液。每只大蝸牛平均可得到IML的消化液；(5)用離心機(jī)10000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，留上清液，棄掉沉淀物；(6)用無菌濾膜漏斗過濾，收集的濾液呈棕褐色，只能現(xiàn)提取現(xiàn)用，否則會很快失去活性。2、預(yù)處理選用尚未開裂的蘭花果實(shí)，表面用75%的酒精滅菌后，用10%次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，取出再用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子，將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶(配方見附配-1)溶液中25度浸泡30-50分鐘，用滴管吸取少量含有細(xì)胞胚粉粒的液體在相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)翅羽狀種皮開始降解時， 立即停止處理，用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細(xì)胞胚粉粒，準(zhǔn)備接種，整個操作過程必須嚴(yán)格在無菌環(huán)境中進(jìn)行。3、稀釋將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體配養(yǎng)基(配方見附配- 中稀釋到 50粒/ml濃度。4、接種將上述含有細(xì)胞胚粉粒的液體培養(yǎng)液按aiil/瓶的接種量接種于基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基上(配方見附配_3)，5、暗培養(yǎng)接種好的試管在25°C恒溫狀態(tài)下在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)80d，可觀察到細(xì)胞胚粉粒開始膨大，色白，細(xì)胞胚有絲分離開始。6、光照培養(yǎng)此時轉(zhuǎn)為在1300LX光強(qiáng)下每天照射1 光照培養(yǎng)，恒溫25°C條件下靜置培養(yǎng) 50d，可觀察到0. Imm以下的白色細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)膨大至l_3mm，顏色轉(zhuǎn)綠，在下部長出白色生長點(diǎn)1-6個，逐漸向下鉆入固體營養(yǎng)基，此時已完成了試管內(nèi)國蘭根狀莖(又名“龍根”)啟動過程，7、分化在超凈工作臺上將根狀莖轉(zhuǎn)接于分化固體營養(yǎng)基(配方見附配-4)中生長點(diǎn)朝下插入營養(yǎng)基，25°C光強(qiáng)2000LX條件下，培養(yǎng)60d左右生長點(diǎn)開始不斷向下生長至2-3cm時， 出現(xiàn)有趣的現(xiàn)象，根狀莖開始轉(zhuǎn)向折頭向上生長，直至鉆出固體營養(yǎng)基表面，這時生長點(diǎn)分化為芽點(diǎn)并長出子葉。8、生根在超凈工作臺上將根狀莖轉(zhuǎn)接于壯苗生根固體營養(yǎng)基(配方見附配巧)上，芽點(diǎn)朝上根狀莖朝下，25°C光強(qiáng)2500LX條件下培養(yǎng)60d根狀莖與子葉交界處長出肉質(zhì)氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗。9、煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養(yǎng)基，用1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發(fā)白時，移栽至經(jīng)高溫消毒的腐質(zhì)基質(zhì)中。附配-1 消化酶液配方蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0. lg, pH值調(diào)至5. 8，無菌水稀釋至IOOml備用。附配-2 啟動有絲分離液體配養(yǎng)基配方N6+ 蔗糖 20g+6BA2. Omg+NAAO. 2mg+ 香蕉提取液 IOOml+ 活性碳 2g 的附配-3 基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基配方1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3. 2g附配-4 分化固體營養(yǎng)基1/4MS+6BA0. 5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉 3. 7g附配-5 壯苗生根固體營養(yǎng)基1/2MS+6BA0. 2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥 IOOg+香蕉泥 IOOg+活性碳 3g+強(qiáng)度為 1300 的瓊脂粉3. 7g。利用本例的方法培養(yǎng)出來的蓮瓣蘭、豆瓣蘭、兜蘭、春劍、春蘭、寒蘭、綠蘭、秋枝、 墨蘭、劍葉蘭、蘭花細(xì)胞胚的具體啟動率如下表。
權(quán)利要求
1.一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟(1)蝸牛酶消化酶的提取從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天用水沖洗干凈，敲碎，小心剝?nèi)ネ鈿?，順消化道剪開體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機(jī)離心分層，留上清液，棄掉沉淀物，過濾純凈上清液待用；(2)細(xì)胞胚預(yù)處理選用未開裂的蘭花果實(shí)，表面用75%的酒精滅菌，用10%次氯酸鈉浸泡5 10分鐘，取出用無菌水沖洗3次完成表面消毒，切開果子，將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入消化酶溶液中25°C度浸泡30-50分鐘，翅羽狀種皮開始降解時，停止浸泡，用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細(xì)胞胚粉粒；(3)稀釋將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體培養(yǎng)基中稀釋；(4)接種將第C3)步含有細(xì)胞胚粉粒的液體培養(yǎng)液接種于試管中的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基上(5)暗培養(yǎng)接種好的試管在25°C恒溫狀態(tài)下，在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)，直至可觀察到細(xì)胞胚粉粒開始膨大，細(xì)胞胚有絲分離開始；(6)光照培養(yǎng)接上步，此時轉(zhuǎn)為在1300LX光強(qiáng)下，每天照射12h光照培養(yǎng)，恒溫25°C 條件下靜置培養(yǎng)，直到試管內(nèi)蘭花根狀莖(龍根)啟動；(7)分化將根狀莖轉(zhuǎn)接于分化固體營養(yǎng)基中，生長點(diǎn)朝下插入營養(yǎng)基，25°C光強(qiáng) 2000LX條件下，培養(yǎng)60d左右生長點(diǎn)開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉(zhuǎn)向折頭向上生長，直至鉆出固體營養(yǎng)基表面，這時生長點(diǎn)分化為芽點(diǎn)并長出子葉；(8)生根將根狀莖轉(zhuǎn)接于壯苗生根固體營養(yǎng)基上，芽點(diǎn)朝上根狀莖朝下，25°C光強(qiáng) 2500LX條件下培養(yǎng)60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質(zhì)氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；(9)煉苗移栽將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養(yǎng)基，用1/1000 濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發(fā)白時，移栽至經(jīng)高溫消毒的腐質(zhì)基質(zhì)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(1)步的消化酶上清液，現(xiàn)取現(xiàn)用，間隔不超過一天，以保持其活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(2)步的消化酶溶液配方是蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0.lg, pH值調(diào)至5. 8，無菌水稀釋至100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(3)步的啟動有絲分離液體培養(yǎng)基配方是N6+蔗糖20g+6BA2.Omg+NAAO. 2mg+香蕉提取液 IOOml+活性碳2g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(4)步的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基配方是1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉 3. 2go
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(7)步的分化固體營養(yǎng)基配方是1/4MS+6BA0.5mg+NAA0. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+活性碳3g+ 強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3. 7g。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(8)步的壯苗生根固體營養(yǎng)基配方1/2MS+6BA0.2mg+IBA2. 5mg+馬鈴薯泥IOOg+香蕉泥IOOg+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3. 7g。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(5)步暗培養(yǎng)的時間為70-90天，一般以80天為宜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(6)步的培養(yǎng)天數(shù)為40-60天，以50天為宜。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，步驟是將饑餓兩天活蝸牛敲碎，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取消化液并作凈化處理得上清液，配備成消化酶溶液；選用蘭花果實(shí)作消毒處理，取出種子粉粒，將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入消化酶溶液浸泡到翅羽狀種皮開始降解時過濾原生細(xì)胞胚粉粒；將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體培養(yǎng)基中，稀釋并接種于試管中的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基上；試管25℃恒溫在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)，讓細(xì)胞胚分離；在1300LX光強(qiáng)下每天照射12h，恒溫25℃條件下靜置培養(yǎng)，直到下部長出生長點(diǎn)；分化生根；煉苗移栽得種苗。本發(fā)明首開利用動物消化酶降解蘭花原生細(xì)胞胚種皮先河，成功培育出了90余種珍稀國蘭品種，細(xì)胞胚啟動成功率達(dá)到75％，受試品種全部啟動，解決了瀕危珍貴物種人工育種的世界難題。
文檔編號A01H4/00GK102334450SQ20111026118
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者張笑逸 申請人:張笑逸