專利名稱：一種黃色籃狀菌及其在防治植物病原菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物和生物防治領(lǐng)域，尤其涉及一種黃色籃狀菌及其在防治植物病原菌的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，控制植物病害的一般方法是使用化學(xué)農(nóng)藥，然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性而降低化學(xué)藥劑的防病效果，同時(shí)長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染。生物防治是控制植物病害的一種新途徑，它主要是利用生防菌與植物病原微生物之間的拮抗作用，抑制植物病原菌的生長(zhǎng)?；ㄉ俏覈?guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量及質(zhì)量關(guān)系著國(guó)計(jì)民生。近年來由于對(duì)花生的需求增加，耕地面積不足導(dǎo)致花生連作的現(xiàn)象普遍發(fā)生，花生又是不耐連作的作物之一?；ㄉB作后病害加重、產(chǎn)量下降。目前，生產(chǎn)中急需一種有效、安全、環(huán)保的控制花生等植物病害的新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)農(nóng)藥防治所存在的環(huán)境污染和病害發(fā)生嚴(yán)重等問題，本發(fā)明的目的是提供一種可有效防治多種作物病原菌的黃色籃狀菌，還涉及它在抑制多種病原菌方面的應(yīng)用。本發(fā)明所述黃色籃狀菌分離自連作4年花生根際土壤。使用本發(fā)明所述生防菌防治作物病害，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的用量及其在土壤中的累積，防止環(huán)境污染，有利于提高作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了一種黃色籃狀菌qwl2，其保藏編號(hào)是=CGMCC 5067。所述黃色籃狀菌菌落圓形，邊緣整齊，質(zhì)地絮狀兼絨狀或絮狀，菌落正面黃色，背面中心橙黃色，周圍黃色，分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲，帚狀枝，孢子球形。所述黃色籃狀菌子囊果是裸囊殼，其包被由不同程度疏松的菌絲交織而組成，球形或近球形；原基近圓柱狀、大而彎曲；子囊球形，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子；子囊孢子球形或近球形，透明至黃色，單細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述黃色藍(lán)狀菌制備的生物肥料。還提供了所述黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述植物為花生、番茄、楊樹、玉米、蘋果、小麥、煙草和板栗。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)花生網(wǎng)斑病菌、番茄早疫病菌、楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢葉斑病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、板栗疫病病菌和煙草炭疽病原菌。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述黃色籃狀菌對(duì)病原菌的抑制率在43% -94%。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)黃色籃狀菌有效活菌數(shù)為IX IO8-I X IO9Cfu/克。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明提供的拮抗菌能有效抑制楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢葉斑病菌、蘋果炭疽病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、板栗疫病病菌和煙草炭疽病菌的生長(zhǎng)，使用拮抗菌為有效成分的菌劑可以有效防治植物病害，并且可以減少化學(xué)農(nóng)藥的用量和其在土壤中的累積，對(duì)于防止環(huán)境污染極為重要，同時(shí)，也有利于提高我國(guó)花生等作物的質(zhì)量和產(chǎn)量，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。


圖1表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)楊樹腐爛病菌的抑制作用。圖2表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)立枯絲核菌的抑制作用。圖3表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)玉米紋枯病菌的抑制作用。圖4表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的抑制作用。圖5表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)蘋果炭疽病菌的抑制作用。圖6表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用。圖7表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)煙草赤星病菌的抑制作用。圖8表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)板栗疫病病菌的抑制作用。圖9表明本發(fā)明中黃色籃狀菌對(duì)煙草炭疽病菌的抑制作用。圖10表明本發(fā)明中黃色籃狀菌纏繞于立枯絲核菌絲。圖11表明本發(fā)明中黃色籃狀菌使煙草炭疽病菌菌絲細(xì)胞原生質(zhì)濃縮，細(xì)胞空胞化。圖12表明本發(fā)明中黃色籃狀菌使小麥赤霉病菌菌絲細(xì)胞空胞化。圖13表明本發(fā)明中黃色籃狀菌使煙草赤星病菌菌絲變形，細(xì)胞空胞化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1 拮抗菌的分離研究發(fā)現(xiàn)山東省萊西市連作4年后花生根際土壤與連作2年和7年花生根際土壤相比，植物病原菌種類和數(shù)量顯著減少，花生連作障礙明顯減輕，產(chǎn)量和質(zhì)量提高，采用土壤稀釋分離法對(duì)山東省萊西市連作4年花生根際土壤進(jìn)行分離。本發(fā)明所述黃藍(lán)狀菌即是從連作4年花生根際土壤中分離得到，通過將分離物單孢純化，分別與常見植物病原菌在 PDA平板上兩點(diǎn)對(duì)峙接種，進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)，最終篩選得到。實(shí)施例2、拮抗菌的鑒定1、拮抗菌的形態(tài)學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基如下(1)查氏瓊脂(CA)硝酸鈉3. 0g、磷酸氫二鉀1.(^、氯化鉀0.58、七水硫酸鎂 0. 5g、七水硫酸亞鐵0. Olg、蔗糖30g、瓊脂15g、蒸餾水IOOOmL,加熱使其溶解，最后定容到 IOOOmL, 121°C 滅菌 15min。(2)查氏酵母膏瓊脂(CYA)查氏濃儲(chǔ)液10mL、磷酸氫二鉀1. 0g、酵母膏5g、蔗糖 30g、瓊脂15g、蒸餾水IOOOmL,加熱使其溶解，最后定容到lOOOmL，121°C滅菌15min。查氏濃儲(chǔ)液硝酸鈉30g、氯化鉀5g、七水硫酸鎂5g、七水硫酸亞鐵0. lg、水 lOOmL，加熱使其溶解，最后定容到100mL。
4
(3)啤酒麥芽汁瓊脂(WA):啤酒麥芽汁加水調(diào)至10波美度后再加2%的瓊脂， 121°C 滅菌 15min。(4)馬鈴薯-葡萄糖瓊脂(PDA)取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水IOOOmL,煮沸 IOmin,紗布過濾，加20g瓊脂、20g葡萄糖，再加熱使其熔化，最后定容到lOOOmL，121°C滅菌 20mino將篩選到的菌株接種到PDA平板上，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長(zhǎng)情況。菌落圓形，質(zhì)地絮狀兼絨狀或絮狀，分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲，帚狀枝，孢子球形。子囊果是裸囊殼，其包被由不同程度疏松的菌絲交織而組成，球形或近球形；原基近圓柱狀、大而彎曲，子囊球形，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子；子囊孢子球形或近球形，透明至黃色， 單細(xì)胞。將篩選到的黃色藍(lán)狀菌菌株qwl2進(jìn)行菌種保藏，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期2011年7月22日；黃色藍(lán)狀菌菌株qwl2保藏編號(hào)為=CGMCC No. 5067 ；黃色藍(lán)狀菌菌株的分類命名為黃色藍(lán)狀菌Talaromyces f Iavus02、拮抗菌的分子鑒定本實(shí)例根據(jù)拮抗菌的ITS序列來對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。采用CTAB法提取菌株的 DNA。以菌株的 DNA為模板，ITSl 為5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘ (SEQ IDNo』)*ITS4 為5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘ (SEQ ID No 3)為引物擴(kuò)增菌株的ITS序列。擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化后，連接轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆送往北京諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序。 通過與GenBank中已有的ITS序列進(jìn)行Blast相似性比較確定菌株的種類。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征和ITS比對(duì)結(jié)果，最終將菌株確定為黃色籃狀菌。GenBank 登陸號(hào)JN602366，序列如下(SEQ ID No 1)TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCTCGCGG
CCCAACCTCCCACCCTTGTCTCCTATACACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCA
CCGGGGCCACCTGGTCGCCGGGGGACGCACGTCCCCGGGCCCGCGCCCGC
CGAAGCGCGCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTACTATGAA
AATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG
AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCA
TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCC
TGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTGTGG
TCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCTGGTCCTC
GAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGCGGGGGTTGGT
CACCACCACATTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCG
CTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA實(shí)施例3、黃籃狀菌的抑菌作用。將黃色籃狀菌分別與板栗疫病病菌、玉米彎孢葉斑病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、楊樹腐爛病菌和立枯絲核菌等植物病原真菌采用兩點(diǎn)對(duì)峙的方法接種到PDA平板上，同時(shí)以單獨(dú)接種各病原菌的PDA平板為對(duì)照。置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種3 天后測(cè)量菌落直徑，直到對(duì)照長(zhǎng)滿平板為止。計(jì)算抑菌率，結(jié)果如表1所示。
病原菌對(duì)峙培養(yǎng)半徑(cm) ■ 對(duì)照抑制率(％)板栗疫病病菌0.030.492.5煙草赤星病菌0.11.693.8玉米彎孢葉斑病菌0.30.8564.8小麥赤霉病菌0.92.2560.0立枯絲核菌0.470.9550.5楊樹腐爛病菌0.57143.0實(shí)施例4、菌絲抑制病理學(xué)觀察于在PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng)黃色籃狀菌與各病原菌，各病原菌包括楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢葉斑病菌、蘋果炭疽病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、板栗疫病病菌和煙草炭疽病菌等植物病原真菌，參見附圖1-9。當(dāng)黃色籃狀菌與各病原菌相交后，挑取交界處病原菌菌絲在光學(xué)顯微鏡下觀察兩種菌絲的相互作用，參見附圖10-13。黃色籃狀菌對(duì)上述9種病原菌的拮抗機(jī)制主要是重寄生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用和抗生作用。黃色籃狀菌纏繞在病原菌的菌絲上或平行波浪式生長(zhǎng)；使病菌菌絲斷裂，原生質(zhì)濃縮； 使菌絲細(xì)胞中空變形。在研究黃藍(lán)狀菌對(duì)9種病原真菌的相互作用過程中，發(fā)現(xiàn)菌絲間有被纏繞、菌絲斷裂、原生質(zhì)濃縮、菌絲變形等現(xiàn)象，從圖片上可以清晰的觀察出黃色籃狀菌與9種病原菌相互作用的現(xiàn)象。實(shí)施例5、黃色籃狀菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的作用在PDA斜面上接種黃色籃狀菌，條件下培養(yǎng)5天，制備孢子懸浮液。用移液槍取ImL孢子懸浮液接入裝有50mL PD液體培養(yǎng)基三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)4天做為種子液。 取種子液5mL接入裝有IOOmL PD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C條件下振蕩培養(yǎng)7天，發(fā)酵液用8層紗布過濾后濾液lOOOOr/min離心15分鐘，上清液用0. 22um的細(xì)菌過濾器過濾除菌，獲得無菌發(fā)酵液。在固體PDA平板中心接種病原菌培養(yǎng)至菌落直徑2cm，在距菌落邊緣約 1. 5cm處分別加入無菌發(fā)酵液0uL、300uL、400uL、500uL，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察并記錄菌落的長(zhǎng)勢(shì)，并測(cè)量和記錄菌落中心到每個(gè)邊緣的距離，直至對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平板，3次重復(fù)，結(jié)果如表2所示。表2 不同劑量黃藍(lán)狀菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種黃色籃狀菌qwl2，其保藏編號(hào)是CGMCC 5067。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種黃色籃狀菌，其特征在于，所述黃色籃狀菌菌落圓形，邊緣整齊，質(zhì)地絮狀兼絨狀或絮狀，菌落正面黃色，背面中心橙黃色，周圍黃色，分生孢子梗發(fā)生于氣生菌絲，帚狀枝，孢子球形；裸囊殼，球形或近球形；原基近圓柱狀，大而彎曲；子囊球形，內(nèi)含8個(gè)子囊孢子；子囊孢子球形或近球形，透明至黃色，單細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃色藍(lán)狀菌制備的生物肥料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為花生、番茄、楊樹、玉米、蘋果、小麥、煙草和板栗。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用，其特征在于，所述病原菌包括花生網(wǎng)斑病菌、番茄早疫病菌、楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢葉斑病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、板栗疫病病菌和煙草炭疽病原菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用，其特征在于，所述黃色籃狀菌對(duì)病原菌的抑制率在43%-94%。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的黃色籃狀菌在防治植物病原菌中的應(yīng)用，其特征在于，黃色籃狀菌有效活菌數(shù)為IXIO8-IXiO9 cfu/克。
全文摘要
一種黃色籃狀菌及其在防治植物病原菌中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種黃色籃狀菌，還涉及它在抑制多種病原菌方面的應(yīng)用。所述黃色籃狀菌qw12的保藏編號(hào)是CGMCC5067，所述黃色籃狀菌菌落圓形，質(zhì)地絮狀兼絨狀或絮狀，菌落正面黃色；分生孢子梗帚狀枝，孢子球形；原基近圓柱狀，大而彎曲；裸囊殼、球形或近球形，子囊球形，子囊孢子球形或近球形，單細(xì)胞。本發(fā)明提供的拮抗菌能有效抑制楊樹腐爛病菌、立枯絲核菌、玉米紋枯病菌、玉米彎孢葉斑病菌、蘋果炭疽病菌、小麥赤霉病菌、煙草赤星病菌、板栗疫病病菌和煙草炭疽病菌等植物病原菌的生長(zhǎng)，可以有效防治植物病害，并且可減少化學(xué)農(nóng)藥的用量及其土壤中的累積，也有利于我國(guó)經(jīng)濟(jì)作物的質(zhì)量和產(chǎn)量的提高，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益十分顯著。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102286383SQ201110262789
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者咸洪泉, 崔德杰, 柳新偉, 王大偉, 顏艷偉 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 青島瀚普生物科技有限公司