專利名稱：一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是當(dāng)前科學(xué)研究中最重要最常用的科學(xué)研究方法之一，是藥理學(xué)、生理學(xué)、病理生理學(xué)等多種學(xué)科的基本研究手段。呼吸系統(tǒng)疾病(如C0PD、肺血管疾病、肺癌等) 是危害人類健康的重大疾病，因此呼吸疾病的研究是許多醫(yī)學(xué)研究者重要的研究?jī)?nèi)容，呼吸疾病的動(dòng)物模型已廣泛用于呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)理的研究及新藥研發(fā)，其中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理學(xué)結(jié)果是判斷模型是否成功及科學(xué)研究的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟的標(biāo)準(zhǔn)化病理處理對(duì)病理結(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要。肺臟具有較大的體積順應(yīng)性，呼吸時(shí)體積變化較大，另外肺體積與動(dòng)物體重也有關(guān)系，理想的固定方法按吸氣時(shí)肺的容積自然固定，這樣有助于保存肺組織的自然形態(tài)。目前肺部的病理固定多采用福爾馬林或4%多聚甲醛直接對(duì)離體動(dòng)物肺臟進(jìn)行浸泡固定，這種固定方法使肺體積急劇萎縮，壓迫了肺泡和血管管腔，影響末梢支氣管和血管病理變化的準(zhǔn)確判斷。另外還有研究者用注射器將固定液經(jīng)氣管注射到動(dòng)物肺內(nèi)，但這種方法常常因?yàn)槭┘訅毫^(guò)大，會(huì)破壞動(dòng)物肺原有的組織形態(tài)，或因?yàn)榉闻K不均勻充盈，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便，成本低，固定快速，可規(guī)范化控制的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，該方法可使動(dòng)物肺臟得到充分均勻的自然灌注，有助于保存肺組織的自然形態(tài)，滿足觀察肺小血管、小氣管病理變化的需要。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法， 其包括以下步驟
(1)灌注固定液將裝有固定液的灌流容器懸掛于離體動(dòng)物肺臟正上方，灌流容器連接的灌流管的液體流出端插入離體動(dòng)物肺臟的氣管中，利用固定液液面與動(dòng)物肺臟所處水平面之間的高度差產(chǎn)生的靜液壓將固定液灌注入動(dòng)物肺臟的肺泡中，使動(dòng)物肺臟呈自然擴(kuò)張的狀態(tài)；
(2)浸泡固定液將所述步驟(1)得到的動(dòng)物肺臟完全浸泡于固定液中進(jìn)行固定。所述步驟(1)中固定液的體積等于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺容積，而通常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺容積可以通過(guò)測(cè)定動(dòng)物的肺功能而得。一般來(lái)說(shuō)，灌注大鼠肺臟的固定液體積為ani，而灌注小鼠肺臟的固定液體積為0. 6ml。所述步驟(1)中以動(dòng)物肺臟所處的水平面為基準(zhǔn)，固定液液面所處的高度產(chǎn)生的靜液壓應(yīng)能將等同于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺容積的固定液剛好灌入動(dòng)物肺臟的肺泡內(nèi)，且不會(huì)破壞肺組織。在本發(fā)明中，固定液液面與動(dòng)物肺臟所處的水平面之間高度差(H)與固定液體積(V) 之間成正比關(guān)系H=10*V，其中高度差H的單位為cm，固定液體積V的單位為ml。通常，對(duì)于大鼠來(lái)說(shuō)，固定液液面與動(dòng)物肺臟所處的水平面之間的高度差為20cm ；而對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)固定液液面與動(dòng)物肺臟所處的水平面的高度差為6cm。所述步驟O)中的浸泡固定的時(shí)間為MtT48h。本發(fā)明所述的固定液采用以下質(zhì)量百分比濃度的溶液4%甲酸、10%甲醛、4%多聚甲醛溶液或10%多聚甲醛溶液。本發(fā)明的有益效果如下
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟的容積進(jìn)行自然固定，最大限度的保存肺組織的自然形態(tài)，可滿足觀察肺臟末端病理機(jī)構(gòu)變化，可以達(dá)到清晰觀察肺泡及肺末梢氣管和血管形態(tài)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，避免了常?guī)病理固定方法壓迫了肺泡和血管管腔，影響末梢支氣管和血管形態(tài)的弊端，且本方法方便易行，重復(fù)性好，成本低，固定快速，可規(guī)范化控制，便于標(biāo)準(zhǔn)化操作?？捎糜诟鞣N實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括狗、兔子、大鼠、小鼠等不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺臟的病理固定，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織的標(biāo)準(zhǔn)化固定提供了一種可靠穩(wěn)定的實(shí)施方法。


圖IA是未用本發(fā)明固定的大鼠肺臟的組織切片HE染色圖。圖IB是利用本發(fā)明固定的大鼠肺臟的組織切片HE染色圖。圖2A是未用本發(fā)明固定的小鼠肺臟的組織切片HE染色圖。圖2B是利用本發(fā)明固定的小鼠肺臟的組織切片HE染色圖。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，以說(shuō)明本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟固定的應(yīng)用中的效果，但是以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的目的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一利用本發(fā)明固定大鼠肺臟組織進(jìn)行病理切片觀察肺組織形態(tài)材料及方法
一、主要實(shí)驗(yàn)材料
1、SPF級(jí)SD大鼠體重200g-250g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心
2、戊巴比妥鈉廣州化學(xué)二廠
3、多聚甲醛=Sigma公司
4、蘇木素廣州化學(xué)試劑二廠
5、伊紅廣州化學(xué)試劑二廠
二、主要儀器
1、Citadel1000組織脫水機(jī)英國(guó)Shandon公司
2、BM- II水浴式生物組織包埋機(jī)深圳新安毅達(dá)電子廠
3、光學(xué)顯微鏡日本Olympus公司
4、數(shù)碼攝影一體化系統(tǒng)日本Nikon公司
5、熒光倒置顯微鏡德國(guó)Leica公司
三、實(shí)驗(yàn)方法
1.將裝有2ml的4%(質(zhì)量百分比濃度)多聚甲醛溶液的灌流容器懸掛于大鼠離體肺臟的正上方，其中，2ml的4%多聚甲醛溶液等于大鼠的肺容積。而4%的多聚甲醛溶液的液面與大鼠肺臟所在的水平面之間的高度距離20cm，此時(shí)，4%多聚甲醛溶液與動(dòng)物肺臟之間的高度差產(chǎn)生的靜液壓能夠?qū)?%多聚甲醛溶液完全灌注入大鼠肺臟的肺泡中，且不會(huì)破壞肺組織。將灌流容器連接的灌流管的液體流出端插入大鼠肺臟的氣管中并進(jìn)行結(jié)扎，然后讓2ml的4%多聚甲醛溶液在自身重力作用下向下自然均勻灌注至肺臟的肺泡中，使大鼠肺臟呈自然擴(kuò)張的狀態(tài)；然后將大鼠全肺完全浸泡于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定Mh。2.另外取一只大鼠的肺臟直接置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)進(jìn)行固定Mh，作為對(duì)照， 取肺組織進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)切片處理，HE染色，顯微鏡下觀察。病理標(biāo)本的制備如下
將本發(fā)明固定好的大鼠肺組織和對(duì)照大鼠的肺組織置于4%多聚甲醛溶液固定Mh。1)脫水70%乙醇2h — 80%乙醇Ih — 95%乙醇Ih — 95%乙醇Ih —無(wú)水乙醇 2h —無(wú)水乙醇1. 5h —無(wú)水乙醇1. 5h
2)透明二甲苯0.5h — 二甲苯Ih — 二甲苯0. 5h
3)浸蠟低溫(50°C)浸蠟Ih—浸蠟Ih
4)包埋浸蠟后的組織放入60°C石蠟中包埋
5)切片4um連續(xù)切片
6)攤片49°C溫水中攤片
7)烘片55°C烘20min
8)透明和水化
二甲苯IOmin — 二甲苯IOmin —無(wú)水乙醇5min —無(wú)水乙醇5min — 95%乙醇5min — 80% 乙醇5min — 70%乙醇5min —流水沖洗IOmin
9)HE染色
蘇木素染色I(xiàn)min —流水沖洗Imin — 1%鹽酸酒精脫色I(xiàn)Osec —流水沖洗IOmin —伊紅染色I(xiàn)Osec —流水沖洗IOmin — 55°C烘20min —中性樹(shù)膠封片
試驗(yàn)結(jié)果從圖IA和圖IB所示，采用本發(fā)明固定的大鼠肺組織經(jīng)HE染色后，組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔結(jié)構(gòu)清楚，可見(jiàn)末梢的氣血屏障結(jié)構(gòu)，肺末梢的小動(dòng)脈小靜脈結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)單層內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞層；采用現(xiàn)有的普通方法固定的對(duì)照大鼠肺組織經(jīng)HE 染色后，肺末梢結(jié)構(gòu)較清楚，肺泡較萎縮，肺泡腔不干凈，無(wú)法識(shí)別肺內(nèi)末梢的氣血屏障結(jié)構(gòu)，小血管染色后，結(jié)構(gòu)不清楚，很難分辨內(nèi)皮和平滑肌層。結(jié)論采用本發(fā)明固定的肺組織染色后切片，效果優(yōu)于現(xiàn)有的普通固定方法，肺末梢結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔干凈，小血管結(jié)構(gòu)清晰。實(shí)施例二
與實(shí)施例一不同的是采用小鼠的離體肺臟，固定液采用0. 6ml的4%(質(zhì)量百分比濃度)甲醛溶液，4%甲醛溶液的液面與小鼠肺臟所在的水平面之間的高度距離6cm。小鼠全肺完全浸泡于4%甲醛溶液中進(jìn)行固定48h。試驗(yàn)結(jié)果從圖2A和圖2B所示，采用本發(fā)明固定的小鼠肺組織經(jīng)HE染色后，組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔結(jié)構(gòu)清楚，可見(jiàn)末梢的氣血屏障結(jié)構(gòu)，肺末梢的小動(dòng)脈小靜脈結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)單層內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞層；采用現(xiàn)有的普通方法固定的小鼠肺組織經(jīng)HE染色后，肺末梢結(jié)構(gòu)較清楚，肺泡較萎縮，肺泡腔不干凈，無(wú)法識(shí)別肺內(nèi)末梢的氣血屏障結(jié)構(gòu)，小血管染色后，結(jié)構(gòu)不清楚，很難分辨內(nèi)皮和平滑肌層。結(jié)論采用本發(fā)明固定的小鼠肺組織染色后切片，效果優(yōu)于現(xiàn)有的普通固定方法，
5肺末梢結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)清楚，肺泡腔干凈，小血管結(jié)構(gòu)清晰。
本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來(lái)概述。本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不是限制，如不限于實(shí)施例所列舉的固定液，采用以下質(zhì)量百分比濃度的溶液10%甲醛10%多聚甲醛溶液也是可以的；全肺的浸泡固定時(shí)間在內(nèi)也可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的；而固定液液面與離體動(dòng)物肺臟所處的水平面高度差根據(jù)H=10*V計(jì)算，其中高度差H的單位為cm，固定液體積V的單位為ml，而固定液體積V根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺容積來(lái)確定。因此凡是依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)灌注固定液將裝有固定液的灌流容器懸掛于離體動(dòng)物肺臟正上方，灌流容器連接的灌流管的液體流出端插入離體動(dòng)物肺臟的氣管中，利用固定液液面與動(dòng)物肺臟所處水平面之間的高度差產(chǎn)生的靜液壓將固定液灌注入動(dòng)物肺臟的肺泡中，使動(dòng)物肺臟呈自然擴(kuò)張的狀態(tài)；(2)浸泡固定液將所述步驟(1)得到的動(dòng)物肺臟完全浸泡于固定液中進(jìn)行固定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，所述步驟(1)中固定液體積等于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺容積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，所述步驟(1)中靜液壓能將等同于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺容積的固定液灌入動(dòng)物肺臟內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，所述步驟(1)中固定液液面與動(dòng)物肺臟所處的水平面之間高度差與固定液體積之間成正比關(guān)系H=10*V，其中H為固定液液面與動(dòng)物肺臟所處的水平面之間高度差，單位為cm，V為固定液體積，單位為ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，所述步驟(2)中的浸泡固定的時(shí)間為MtT48h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其特征在于，所述的固定液采用以下質(zhì)量百分比濃度的溶液4%甲酸、10%甲醛、4%多聚甲醛溶液或10%多聚甲醛溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟病理固定方法，其包括以下步驟(1)灌注固定液將裝有固定液的灌流容器懸掛于離體動(dòng)物肺臟正上方，灌流容器連接的灌流管的液體流出端插入離體動(dòng)物肺臟的氣管中，利用固定液液面與動(dòng)物肺臟所處水平面之間的高度差產(chǎn)生的靜液壓將固定液灌注入動(dòng)物肺臟的肺泡中，使動(dòng)物肺臟呈自然擴(kuò)張的狀態(tài)；(2)浸泡固定液將所述步驟(1)得到的動(dòng)物肺臟完全浸泡于固定液中進(jìn)行固定。本發(fā)明操作方便，成本低，固定快速，可規(guī)范化控制可使動(dòng)物肺臟得到充分均勻的自然灌注，有助于保存肺組織的自然形態(tài)，滿足觀察肺小血管、小氣管病理變化的需要。
文檔編號(hào)A01N1/00GK102435476SQ20111026366
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者云昕, 盧文菊, 林純意, 江倩, 王健, 陳豫欽 申請(qǐng)人:呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院