專利名稱：植物轉(zhuǎn)基因的可視化跟蹤表達系統(tǒng)及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因的可視化跟蹤表達系統(tǒng)及其應用，特別涉及一種在植物轉(zhuǎn)基因過程中，將花青素合成途徑中的兩個轉(zhuǎn)錄因子bi和Cl基因作為可視化標記基因的植物表達載體。
背景技術：
在眾多的植物遺傳轉(zhuǎn)化報告基因中，花青素代謝調(diào)節(jié)基因是最方便的一種。將其導入植物細胞之后，花青素經(jīng)過表達后會在液泡中積累，使細胞變成紅色或紫色，用一般的解剖鏡甚至肉眼即可觀測，無需對植物的檢測部位進行特殊處理或選擇特殊儀器進行觀察，更不用進行組織化學測試而殺死植物組織。因此，將這類基因應用到植物遺傳轉(zhuǎn)化的操作上，可以有效地減輕轉(zhuǎn)化后篩選的復雜工作，目的性強，實驗結(jié)果的準確度和可信度都可以大為提高，為開展轉(zhuǎn)化后的分析工作奠定了很好的基礎。另外在基因功能研究方面，根據(jù)該基因在植株上的表現(xiàn)，能夠直觀地反映出尤其是研究基因共抑制、轉(zhuǎn)基因沉默等轉(zhuǎn)基因植株可能出現(xiàn)的重大問題。已有的研究表明，不同植物中的花青素生物合成受2類基因的共同控制，一類是結(jié)構(gòu)基因，其編碼生物合成途徑中所需的酶；另一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的時空表達(Holton TA,Cornish EC. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. Plant Cell，1995，7 (7) :1071_1083)。早在 1992 年，Gof 等(Goff SA，Cone KC, Chandler VL. Functional analysis of the transcriptional activator encoded by the maize B gene :evidence for a direct functional interaction between two classes of regulatory proteins. Genes Dev. 1992，6 :864-875)證實了玉米中花青素生物合成途徑轉(zhuǎn)錄因子bHLH蛋白R與MTO蛋白Cl通過N末端相互作用調(diào)控植物組織中色素的產(chǎn)生；Cl基因要在b基因的共激活下才能調(diào)節(jié)色素在糊粉層中的合成，而b位點的基因則很少影響糊粉層和幼苗的顏色，但可調(diào)節(jié)成熟植物組織特別是葉鞘和苞葉的廣譜顏色 (Radicella J P，Turks D，Chandler VL. Cloning and nucle-otide sequence of a cDNA encoding B-Peru, a regulatory protein of the anthocyanin pathway from maize. Plant MolBiol. 1991，17 :127-130)。!fan等(!fan Y JiKim Y MiLee J Y，et al. Production of purple-colored creeping bentgrass using maize transcription factor genes Pl and Lc through Agrobacterium—mediated transformation. Plant Cell Rep. 2009， 28(3) :397-406)在利用玉米的的花青素合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因Pl和Lc分別或共同轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎也得到了類似的結(jié)果，這兩個基因單獨調(diào)控時，轉(zhuǎn)基因植株會在不同的部位不同程度顯示紫色，Lc基因的調(diào)控作用比Pl基因更強一些，但在共同作用的情況下， 會使整個轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)紫色。Doshi 等(Doshi K M, Eudes F, Laroche A，et al. Transient embryo-specific expression of anthocyanin in wheat. In Vitro Cell.Dev. Biol. Plant, 2006,42 :432-438)利用來自玉米花青素的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因Cl和B-peru基因共同在大麥不同的組織特異性啟動子驅(qū)動下調(diào)控花青素的合成，通過顏色直觀的反應出這些啟動子在小麥幼胚等器官的組織特異性和驅(qū)動能力。因此，通過綜合考慮并恰當運用結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因，選用具有器官特異性的啟動子，為植物轉(zhuǎn)基因研究以及基因功能研究提供了直觀的可視化研究證據(jù)，另外，還能夠為實現(xiàn)植物體彩色化開辟了新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可以在植物轉(zhuǎn)基因過程中作為可視化標記的可視化跟蹤表達系統(tǒng)，具體為一種植物表達載體。本發(fā)明所提供的植物表達載體包含可視化標記基因的表達盒。所述可視化標記基因的表達盒可為在植物轉(zhuǎn)基因中任何被用作可視化標記基因的表達盒，在本發(fā)明的實施例中，所述可視化標記基因的表達盒具體由花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒所組成。其表達產(chǎn)物花青素可作為植物轉(zhuǎn)基因成功與否的可視化參考標記。所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的編碼序列如序列表中序列4的第 3137位到第4796位所示；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的編碼序列如序列表中序列4的第1013位到第1834位所示。所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒是一個含有所述bi基因及bi 基因表達所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的bi基因和終止子；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒是一個含有所述 cl基因及cl基因表達所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的cl基因和終止子。所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒的啟動子均可為任何可以啟動基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，如常用的3 啟動子。所述植物表達載體還包含篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因表達盒。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因表達盒為任何在植物轉(zhuǎn)基因中被用作篩選轉(zhuǎn)基因植物所需的標記基因表達盒。在本發(fā)明的實施例中，所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因表達盒具體為EPSP基因表達盒。所述EPSP基因表達盒是一個含有EPSP基因及EPSP基因表達所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、由該啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述EPSP基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)；所述EPSP基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的編碼序列如序列表中序列5的第10 位到第2549位所示。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因的表達盒中的啟動子可為任何可以啟動基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動子，如常用的35s啟動子。所述的植物表達載體為PBAC9008，pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在pGreen載體的第1648位和第沈35位處分別插入如序列表中序列7所示的IoxP位點得到重組載體pBAC814，pBAC814中的兩個IoxP位點方向相同；2)在pBAC814 的多克隆位點前的Nde I酶切位點處插入如序列表中序列5所示的所述EPSP基因的表達盒得到重組載體PBAC823 ；3)將上述pBAC823載體的用DraIII酶切，加入如序列表中序列8所示的Agel/PacI linker，之后將如序列表中序列4所示的所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達框插入AgeI和I^cI位點之間，得到的載體命名為 PBAC9008。所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和所述花青素基因合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒的序列如序列表中序列4所示，其中，第1位到第2112位為所述cl表達框的基因序列，第2125位到第5074位為所述bi表達框的序列，第1013位到第1834位為cl基因的編碼序列，第3137位到第4796位為bi的編碼序列。所述EPSP基因的表達盒的序列如序列表中序列5所示，其中，第1位到第434位為所述35S啟動子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的Intronl的核苷酸序列，第10 位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列；所述Agel/PacI linker 的核苷酸序列如序列表中序列8所示。所述植物表達載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供利用所述植物表達載體培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括如下步驟利用所述植物表達載體構(gòu)建表達外源目的DNA的重組植物表達載體，將所述重組植物表達載體導入植物細胞中，得到表達所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi和 cl基因的紫色細胞，由所述紫色細胞得到的植株即為候選的轉(zhuǎn)基因植物；所述植物細胞本身的顏色與紫色通過肉眼觀察能相互區(qū)分。所述可視化標記基因的表達盒和所述外源目的DNA可通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導入雙子葉植物，通過DNA直接轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入雙子葉植物和/或單子葉植物。所述DNA的直接轉(zhuǎn)移法包括電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導法、多聚物介導法，花粉管通導法等。在本發(fā)明的實施例中采用的具體方法為基因槍法。所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物，在本發(fā)明的實施例中具體為單子葉植物小麥和玉米。含有所述的植物表達載體的重組原核細胞或重組真菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明以花青素合成途徑中的兩個轉(zhuǎn)錄因子bi和Cl基因作為可視化標記基因， 運用到植物轉(zhuǎn)基因中，巧妙的將顏色調(diào)控基因應用到植物遺傳轉(zhuǎn)化的操作上，有效地減輕轉(zhuǎn)化后篩選的復雜工作，目的性強，根據(jù)該基因在植株上的表現(xiàn)，有選擇的保留有價值的轉(zhuǎn)化材料，會大大節(jié)省篩選時間和研究經(jīng)費，最重要的，實驗結(jié)果的準確度和可信度的大大提高為開展轉(zhuǎn)化后的分析工作奠定了很好的基礎。另外，本發(fā)明利用顏色基因的瞬時表達，可以更為直觀地對轉(zhuǎn)化效果進行可視化的分析，從而避免了各種影響轉(zhuǎn)化因素的發(fā)生，如基因槍法轉(zhuǎn)化中金粉制備不好，基因槍轟擊效果差，轟擊范圍和轟擊位置不準確等。


圖1為花青素基因表達載體pBAC9008的質(zhì)粒圖譜。圖2為pBAC823的質(zhì)粒圖譜。圖3為花青素基因瞬時表達。A、小麥葉片；B、小麥幼胚的愈傷組織。圖4為轉(zhuǎn)基因玉米植株的分化及田間移栽。A、誘導愈傷組織；B、轉(zhuǎn)化再生植株；C、 田間移栽；D、轉(zhuǎn)化植株結(jié)實種子。圖5為pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。1 :2K plus marker ；2 陰性對照(水)；3 非轉(zhuǎn)基因植株；5 質(zhì)粒pBAC9008 ；6 18 轉(zhuǎn)化植株。圖6為T1代pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株田間表型。A、pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株T1代分離后表現(xiàn)為正常的植株；B、pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株T1代分離后表現(xiàn)為紫色植株；C、D、E分別為 PBAC9008轉(zhuǎn)基因紫色植株的雄穗、葉片和苞葉。圖7為T1代pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。1 陰性對照(水)；2 非轉(zhuǎn)基因植株；3 質(zhì)粒pBAC9008 ；4 6 紫色轉(zhuǎn)基因植株；7 8 正常顏色轉(zhuǎn)基因植株。圖8為pBAC830的質(zhì)粒圖譜。圖9為pBAC9009的質(zhì)粒圖譜。圖10為pBAC9009轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測。1 :2K plus marker ；2 17 轉(zhuǎn)化植株；18 陰性對照(水)；19 非轉(zhuǎn)基因植株；20 質(zhì)粒pBAC9009。圖11為轉(zhuǎn)基因玉米中Kan基因刪除示意圖。其中，A代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(父本)；B代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米(母本)；C代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(刪除抗生素基因)；D代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米；E和F均代表轉(zhuǎn)目的基因玉米/轉(zhuǎn)重組酶基因玉米的雜合體。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。玉米優(yōu)良自交系501 (楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，張立全，張曉東.外源脫水應答轉(zhuǎn)錄因子CBF4基因轉(zhuǎn)化玉米的獲得.作物學報，2009，35 (10) :1759-1763)。T4DNA連接酶等購自Promega公司；Taq酶、氨芐青霉素、IPTG、X-gal等試劑均購自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒購自天根生化科技公司；限制性內(nèi)切酶購自 Promega, New England Biolabs ；普通生化試劑購自Sigma公司、Promega公司或國產(chǎn)。基因槍型號PDS-1000/He (BioRad)。下面結(jié)合具體實施例，詳細闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍實施例1、玉米花青素調(diào)控基因的合成及植物表達載體的構(gòu)建考慮到基因槍轉(zhuǎn)化中抗生素安全的問題，為了便于后續(xù)實驗中抗生素基因的刪除，將pGreen載體進行改造，在Kan基因表達框的兩側(cè)分別插入兩個同向的IoxP位點，經(jīng)測序鑒定正確的載體命名為PBAC814。之后在pBAC814載體多克隆位點前的NdeI酶切位點處插入CaMV 35S啟動子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動的EPSP基因(EPSP基因表達盒)，所述EPSP基因作為篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標記基因。經(jīng)測序鑒定正確的載體命名為 PBAC823。將上述pBAC823載體用DraIII酶切，加入Agel/PacI linker，之后將花青素合成途徑中兩個轉(zhuǎn)錄因子bi和cl的表達框(序列4)插入AgeI和I^cI位點之間，得到的載體命名為PBAC9008。pBAC9008載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。所得pBAC9008載體即為用于插入外源目的DNA的含有玉米花青素調(diào)控基因的植物表達載體。其中，上述pBAC823載體的構(gòu)建步驟具體如下所述以pGreen基礎框架載體(如序列6所示)為模板，利用PF1648(序列9)/PR1648(序列11)引物對進行PCR擴增，產(chǎn)物自連，引入一個IoxP位點，轉(zhuǎn)化E. coli JMllO0通過序列測定確定IoxP位點是否正確插入pGreen載體中。將鑒定正確的載體命名為pGreen-loxp (在pGreen的1648位點處插入如序列表中序列7所示的IoxP位點得到的重組載體)，以pGreen-loxp載體為模板，以 PF2635(序列10)/PR2635(序列1 引物對進行第二次PCR，步驟同上，引入第二個IoxP位點。測序正確的載體命名為pBAC814(在pGreen-loxp中對應pGreen的沈35位點處插入 IoxP位點得到的重組載體，PBAC814中的兩個IoxP位點方向相同)。在pBAC814多克隆位點前的Nde I酶切位點處插入CaMV 35S啟動子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動的EPSP 基因(EPSP基因表達盒)，所述EPSP基因作為篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標記基因。經(jīng)測序鑒定正確的載體命名為PBAC823 (pBAC823的質(zhì)粒圖譜如圖2所示)。pBAC823中CaMV 35S啟動子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動的EPSP基因(EPSP基因表達盒)的序列如序列表中序列5所示，其中第1位到第434位為所述35S啟動子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的^itronl的核苷酸序列，第10 位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列。實施例2、花青素基因的瞬時表達取小麥葉片和開花后15-17天的小麥保豐104(王軍衛(wèi)，楊鳳萍，張曉東等，Induced expression of DREB transcriptional factor and study on its physiological effects of drought tolerance in transgenic wheat. Acta Genetica Sinica,2006,33(5) :468 476)幼胚，去除生長頂端部位后將盾片倒置接種在MS固體培養(yǎng)基上，用純化好的濃度為Iyg μ廠1的PBAC9008載體，按張曉東等(aiang Xiaodong, Liang Rongqi,Chen Xvqing,Yang Fengping,Zhang Liquan,Transgene inheritance and quality improvement by expressing novel HMW glutenin subunit(HMW-GS) genes in winter wheat. Chinese Science Bulletin, 2003,48 (8) :771-776.)所述方法進行基因槍微彈的制備，PDS-1000/He型基因槍轟擊盾片和葉片，4 后在萊卡體式顯微鏡下觀察花青素基因在不同組織的瞬時表達情況。結(jié)果顯示，基因槍轟擊過的小麥幼胚愈傷組織和葉片在培養(yǎng)間經(jīng)過48小時培養(yǎng)后，在體式顯微鏡下可以觀察到，在兩個玉米花青素合成調(diào)控基因共同作用下，金粉轟擊到的細胞均呈現(xiàn)出紫顏色，如圖3所示。這一結(jié)果說明這兩個基因的共同作用可以明確指示出金粉轟擊的效果和具體的部位。因此，利用顏色基因的瞬時表達，可以更為直觀地對基因槍轉(zhuǎn)化效果進行可視化的分析，從而避免了各種影響基因槍轉(zhuǎn)化因素的發(fā)生，如金粉制備不好，基因槍轟擊效果差，轟擊范圍和轟擊位置不準確等。實施例3、玉米基因槍轉(zhuǎn)化誘導培養(yǎng)基N6基本培養(yǎng)基 +IOmg Γ1 AgNO3+IOOmg Γ1 肌醇 +^ng Γ1 2，4_D+30g L-1蔗糖+7g L-1瓊脂。分化培養(yǎng)基N6基本培養(yǎng)基 +0. 5mg Γ1 AgNO3+IOOmg Γ1 肌醇 +1. 5mg Γ1 KT+30g L-1蔗糖+7g L-1瓊脂+0. 5mg L-1草甘膦。取授粉后12d左右的玉米優(yōu)良自交系501的果穗，經(jīng)75%乙醇表面消毒后挑取其幼胚接種到誘導培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 5d后誘導出胚性愈傷組織。純化好的PBAC9008 載體調(diào)整濃度為 Iyg μ L-1，按張曉東等(Zhang Xiaodong, Liang Rongqi, Chen Xvqing, Yang Fengping, Zhang Liquan, Transgene inheritance and quality improvement by expressing novel HMW glutenin subunit(HMW-GS) genes in winter wheat. ChineseScience Bulletin, 2003,48 (8) :771-776.)所述方法進行基因槍微彈的制備，PDS-1000/He 型基因槍轟擊胚性愈傷組織，5d后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有草甘膦的篩選培養(yǎng)基(誘導培養(yǎng)基中加入Img L—1草甘膦)上篩選20d左右。然后選取生長正常的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化，分化的幼苗進行壯苗后移栽到海南。結(jié)果顯示，基因槍轟擊后的幼胚經(jīng)5mg/L除草劑草甘膦篩選后進行分化，將獲得的轉(zhuǎn)基因植株移栽到海南，共得到轉(zhuǎn)化植株四株，有23株結(jié)實，其中7株的種子有花青素基因的表達。圖4為玉米幼胚轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)基因植株的整個過程。實施例4、轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測用改良CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米嫩葉(紫色)的基因組DNA，根據(jù)3 啟動子序列設計上游引物為TCCACTGACGTAAGGGAT (序列4的M66-2483位)，根據(jù)an_B基因序列設計下游引物為TGGACCAGAAGAGGGCAT (序列4的3240-3257位)，擴增的目的片段大小為792bp。非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，PBAC9008為陽性對照，水為空白對照，反應體系為ddH20 17. 3μ L， DNA IyLdug μ L-1), 10XPCR Reaction Buffer2. 5 μ L, dNTPs (2. 5mmol Γ1) 2 μ L，上游引物lyL，下游引物lyL，I1aq DNA聚合酶(5U yL—Oo^yL。反應程序如下95°C變性 5min ；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，共；35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖5所示，所獲得的部分轉(zhuǎn)化植株與陽性對照質(zhì)粒(泳道5)都能擴增出了 792bp的bi基因表達盒的特異片段，陰性對照(無模板DNA，泳道2)和非轉(zhuǎn)化植株(泳道 3)沒有擴增帶，根據(jù)這一結(jié)果，我們初步判定外源的an-C和an-B基因成功轉(zhuǎn)入玉米中。另外，作為可視化標記的花青素直接反映在植株及種子上的紫色進一步說明外源的an-C和 an-B基因被轉(zhuǎn)入了玉米植株中。另外，T1代pBAC9008的轉(zhuǎn)基因植株在田間種植后表現(xiàn)出了后代分離的現(xiàn)象，部分植株有不同程度的花青素表達，表現(xiàn)為紫色植株(圖6B)或是在不同部位如雄穗、葉片和玉米苞葉表現(xiàn)為紫色(圖6C、D、E)，部分植株和非轉(zhuǎn)基因植株一致，表現(xiàn)為正常的植株顏色。 分別提取了紫色和正常顏色的轉(zhuǎn)化植株的總DNA，根據(jù)所設計an-B基因的特異引物，進行 PCR檢測。結(jié)果如圖7所示，所獲得紫色轉(zhuǎn)化植株與陽性對照質(zhì)粒(泳道5)都能擴增出了含有目標基因的特異片段，陰性對照(無模板DNA，泳道2)和正常表現(xiàn)的轉(zhuǎn)化植株(泳道 6 8)沒有擴增帶，由此可以看出，外源an-C和an-B基因在T1代出現(xiàn)了分離，PCR檢測與花青素基因表達一致。這一結(jié)果揭示利用顏色基因可以作為外源基因在轉(zhuǎn)基因植株染色體上的存在以及表達部位和表達量等外在特征的參考。實施例5、用植物表達載體pBAC9008構(gòu)建親本載體，培育抗生素標記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因植物在實施例1所構(gòu)建的植物表達載體加入IoxP位點，是為了與含有Cre酶基因的植物表達載體(母本載體)共同作用，從而用于刪除轉(zhuǎn)基因植物抗生素標記基因。具體步驟如下一、含有Cre酶基因的植物表達載體的構(gòu)建利用PCR方法，從水稻基因組中克隆出熱激活蛋白hsp70基因啟動子，根據(jù)ere基因的序列，人工合成優(yōu)化的ere酶基因，構(gòu)建hsp70啟動子熱誘導表達的ere酶基因的表達框。將該表達框插入PBAC823載體的DraIII酶切位點。命名為pBAC830 (pBAC830的質(zhì)粒圖譜如圖8所示)。PBAC830中，所述hsp70啟動子熱誘導表達的ere酶基因的表達框的核苷酸序列如序列表中序列13所示，其中，第1位到第687位為所述hsp啟動子的核苷酸序列， 第694位到第1725位為所述Cre酶基因的編碼序列。再將花青素合成途徑中bi表達框和 cl表達框的插入pBAC830載體的EcoR I位點，命名為pBAC9009。pBAC9009中所述花青素合成途徑中bi表達框和cl表達框的序列如序列表中序列4所示，其中，第1位到第2112位為所述cl表達框的基因序列，第2125位到第5074位為所述bi表達框的序列，第1013位到第1834位為cl基因的編碼序列，第3137位到第4796位為bi基因的編碼序列。pBAC9009即為用于刪除所述抗生素標記基因的含Cre酶基因的植物表達載體，其質(zhì)粒圖譜如圖9所示。PBAC9009為環(huán)狀載體，含有兩個同向IoxP位點，可控啟動子，被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，抗生素標記基因的表達盒，可視化標記基因的表達盒，和篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因的表達盒。所述兩個同向的IoxP位點將所述含Cre酶基因的植物表達載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標記基因，可控啟動子及被所述可控啟動子啟動的Cre酶基因，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因的表達盒和所述可視化標記基因的表達盒。所述的可控啟動子為熱激活蛋白基因啟動子。所述的抗生素標記基因表達盒含有啟動卡那霉素標記基因的原核啟動子、SD序列、被該啟動子啟動的卡那霉素標記基因和轉(zhuǎn)錄終止序列。所述的可視化標記的基因表達盒由花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因表達盒和花青素基因合成途徑中cl基因表達盒這兩個表達盒組成。二、玉米基因槍轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測按照實施例3所述方法，分別用pBAC9008和pBAC9009質(zhì)粒轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系 501 ；并按照實施例4所述方法，分別檢測pBAC9008和pBAC9009轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因。 對于pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測的是an-B基因的表達，具體方法完全同實施例4所述；對于PBAC9009轉(zhuǎn)基因植株，PCR檢測的是ere基因的表達，其檢測引物是根據(jù)ere基因設計的，具體為上游引物TGGAAGATGCTACTGTCTGTC (序列13的第817-837位)，下游引物 CAGTGCTGACCAGAGTCTTA(序列13的1293-1312位)，擴增的目的片段大小為495bp。pBAC9008質(zhì)粒對玉米的轉(zhuǎn)化效果如實施例3所述，pBAC9008質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因植株an_B 和an-C基因的表達情況如實施例4所述。pBAC9009質(zhì)粒對對玉米的轉(zhuǎn)化效果得到轉(zhuǎn)化植株155株，有97株結(jié)實，其中10 株的種子有花青素基因的表達。PBAC9009質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因植株中ere酶基因的表達情況如圖10 所示，所獲得的部分轉(zhuǎn)化植株與陽性對照質(zhì)粒(泳道20)都能擴增出了 495bp左右的ere 基因的特異片段，陰性對照(無模板DNA，泳道18)和非轉(zhuǎn)化植株(泳道19)沒有擴增帶，表明外源ere酶基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入玉米中。三、轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定后代雜交刪除抗生素標記基因按照步驟二所述將實施例1所得的含有抗生素標記基因的植物表達載體 (PBAC9008)和步驟一所得的含有Cre酶基因的植物表達載體(pBAC9009)分別轉(zhuǎn)化植物，經(jīng)過Tl代、T2代兩代選擇，獲得Cre酶基因或外源目的基因、花青素合成途徑轉(zhuǎn)錄因子bi和 cl基因、以及EPSP基因均穩(wěn)定表達的、純合的pBAC9009與pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株(T2代植株的種子若為全紫色即為純合的后代)。再通過雜交來刪除Kan抗性標記基因。下面就以轉(zhuǎn)基因玉米為例來進行說明。
轉(zhuǎn)重組酶基因(pBAC9009)植株(種子全為紫色)的T3代(母本)與轉(zhuǎn)目的基因(pBAC9008)植株(種子全為紫色)的T3代(父本)進行雜交，種子進行40°C熱誘導處理后種植，即可刪除PBAC9008轉(zhuǎn)基因植株的后代中的Kan基因及花青素轉(zhuǎn)錄因子。熱誘導處理后，假設刪除效率為100%，當代結(jié)實的種子理論上3 1分離，1/4為黃色，即Kan 抗性基因刪除后的pBAC9008(目的基因)轉(zhuǎn)基因植株的后代，有3/4為紫色，后者其中有 1/3為pBAC9009(重組酶)轉(zhuǎn)基因植株的后代，2/3為同時含有pBAC9008 (目的基因)和 pBAC9009(重組酶)的轉(zhuǎn)基因植株的雜合體(圖11)，雜合體分離出的黃色玉米仍是Kan抗性基因刪除后的pBAC9008(目的基因)轉(zhuǎn)基因植株的后代。即使是刪除不完全，也只是在紫色種子中混有部分目的基因轉(zhuǎn)基因植株的后代，黃色種子中仍100%為pBAC9008(目的基因)轉(zhuǎn)基因植株的后代。僅僅從種皮的顏色以判斷出轉(zhuǎn)基因的效果與刪除效果，因此該刪除體系在轉(zhuǎn)基因研究領域是一個突破，大大節(jié)省了分子檢測的成本，對于后續(xù)的育種也有著重要的意義。
權(quán)利要求
1.植物表達載體，所述植物表達載體包括可視化標記基因表達盒；所述可視化標記基因表達盒由花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子Cl基因的表達盒組成；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達載體，其特征在于所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的編碼序列如序列表中序列4的第3137位到第4796位所示；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的編碼序列如序列表中序列4的第1013位到第1834位所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物表達載體，其特征在于所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒是一個含有所述bi基因及bi基因表達所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的bi基因和終止子；所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒是一個含有所述cl基因及cl基因表達所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動子、被該啟動子啟動的cl基因和終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的植物表達載體，其特征在于所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和所述花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒的啟動子均為3 啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的植物表達載體，其特征在于所述植物表達載體還包括篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因表達盒；所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標記基因的表達盒為 EPSP基因的表達盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的植物表達載體，其特征在于所述植物表達載體為 PBAC9008, pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在pGreen載體的第1648位和第沈35位處分別插入如序列表中序列7所示的IoxP 位點得到重組載體PBAC814，pBAC814中的兩個1 οχΡ位點方向相同⑵在pBAC814的多克隆位點前的Nde I酶切位點處插入如序列表中序列5所示的所述EPSP基因的表達盒得到重組載體PBAC823 ；3)將上述pBAC823載體的用DraIII酶切，加入如序列表中序列8所示的 Agel/PacI linker，之后將如序列表中序列4所示的所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達框插入AgeI和I^cI位點之間，得到的載體命名為pBAC9008。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的植物表達載體在植物轉(zhuǎn)基因中的應用。
8.利用權(quán)利要求1-7中任一所述植物表達載體培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟利用權(quán)利要求1-6中任一所述的植物表達載體構(gòu)建表達目的DNA的重組植物表達載體， 將所述重組植物表達載體導入植物細胞中，得到表達所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi 和cl基因的紫色細胞，由所述紫色細胞得到的植株即為候選的轉(zhuǎn)基因植物；所述植物細胞本身的顏色與紫色通過肉眼觀察能相互區(qū)分。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，單子葉植物如小麥或玉米。
10.含有權(quán)利要求1-6中任一所述的植物表達載體的重組原核細胞或重組真菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了植物轉(zhuǎn)基因的可視化跟蹤表達系統(tǒng)及其應用。本發(fā)明所提供的可視化跟蹤表達系統(tǒng)為含有可視化標記基因表達盒的植物表達載體，所述可視化標記基因表達盒由花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達盒和花青素合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達盒組成。本發(fā)明將顏色調(diào)控基因應用到植物遺傳轉(zhuǎn)化操作上，有效減輕了轉(zhuǎn)化后的篩選工作，根據(jù)該基因在植株上的表現(xiàn)，可有選擇的保留有價值的轉(zhuǎn)化材料，從而大大節(jié)省篩選時間和研究經(jīng)費，且實驗結(jié)果的準確度和可信度大大提高，這為開展轉(zhuǎn)化后分析工作奠定了很好的基礎。另外，本發(fā)明利用顏色基因的瞬時表達，可更為直觀地對轉(zhuǎn)化效果進行可視化分析，從而避免各種影響轉(zhuǎn)化因素的發(fā)生。
文檔編號A01H5/00GK102352375SQ20111029432
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者宮硤, 張曉東, 張立全, 李向龍, 楊鳳萍, 薛靜, 陳緒清 申請人:北京市農(nóng)林科學院