專利名稱：黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種黃瓜紫黃質脫氧環(huán)化酶基因啟動子及其應用。
背景技術：
植物在生長發(fā)育過程中總是面臨著各種非生物逆境脅迫。強光下，植物葉片所能利用的光能只占光合器官所吸收光能的一小部分，過剩的激發(fā)能如不能被及時耗散掉，就會導致光抑制甚至對光合機構造成破壞，如果同時存在其它環(huán)境脅迫，光破壞作用還會增強。植物在長期的進化過程中形成了一整套耗散過剩光能的有效機制。葉黃素循環(huán)就是其中一種保護機制，在植物防御光破壞中起重要作用。葉黃素循環(huán)由紫黃質(V)、環(huán)氧玉米黃質㈧和玉米黃質(Z)三種色素，以及催化它們相互轉化的兩種酶組成。研究表明ζ和A能夠從葉綠素中吸收過多的激發(fā)能并以熱能的形式耗散掉，從而保護光合器免受強光的破壞。在高等植物中，在這個過程中紫黃質脫環(huán)氧化酶(VDE)是葉黃素循環(huán)的關鍵酶。黃瓜在光照強的露地栽培時強光會導致其光合能力下降，尤其在低溫脅迫下，即使中等強度的光強也會使植物發(fā)生光抑制。因此，對黃瓜紫黃質VDE基因及其啟動子的克隆，和功能的研究具十分重要意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明所提供的DNA分子，來源于葫蘆科甜瓜屬黃瓜(Cucumis sativus L.)品種戴多星，為如下1)-3)中任一種1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。優(yōu)選為95%以上同源性。序列表中序列1由1983個核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明的實施例中所述重組載體為在PCAMBIA1391的多克隆位點插入所述DNA 分子得到的重組質粒，而所述插入DNA分子的多克隆位點具體為限制性內切酶位點Ml I 禾口 Nco I。所述表達盒可以由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。所述DNA分子在啟動目的基因在植物表達中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明的實施例中，所述植物具體為擬南芥；所述表達為葉片特異表達。
利用所述DNA分子培育轉基因植物的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍，該方法包括如下步驟1)構建目的基因重組表達載體將目的基因插入攜帶有所述DNA分子(黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子基因)的所述重組載體，使所述DNA分子啟動所述目的基因表達，得到目的基因重組表達載體；2)將步驟1)構建的目的基因重組表達載體導入目的植物中，得到在葉片中特異表達所述目的基因的轉基因植物。在本發(fā)明的實施例中，所述目的植物具體為擬南芥。將所述目的基因重組表達載體導入所述目的植物的方法可為農桿菌介導法、Ti質粒法、Ri質粒法、植物病毒載體法、直接DNA轉化法、顯微注射法、電導法等，在本發(fā)明的實施例中具體采用的為農桿菌介導法。另外，擴增所述DNA分子(黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子基因)全長或任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明從黃瓜(戴多星)中克隆出了黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子的相關序列，實驗證實該啟動子是一個高效特異性表達的啟動子，主要在進行光合作用的綠色植物組織(如葉片)中啟動目的基因的表達，這對于進一步研究植物光合作用相關分子生物學信息具有非常重要的意義。


圖1為含有CsVDEP啟動子轉基因擬南芥的根、莖、葉、花和果莢的GUS活性測定結果柱狀圖。橫坐標表示植株的部位，A-E分別代表轉基因擬南芥的根、莖、葉、花和果莢；縱坐標表示GUS的相對活性。圖2為含有CsVDEP啟動子轉基因擬南芥及轉pCAMBIA1391空載體的擬南芥根、 莖、葉和花的⑶S染色結果圖。其中，第一排為含有CsVDEP啟動子轉基因擬南芥根、莖、葉和花的⑶S染色結果圖，第二排為轉PCAMBIA1391空載體的擬南芥根、莖、葉和花的⑶S染色結果圖(陰性對照)。A為轉基因擬南芥根的GUS染色結果；B為轉基因擬南芥葉的GUS 染色結果；C為轉基因擬南芥花的GUS染色結果；D為轉基因擬南芥莖的GUS染色結果。圖3為啟動子(CsVDEP) PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，第1泳道為 DL2000bpmarker,第 2 泳道為 PCR 產物 CsVDEP。
具體實施方
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。黃瓜品種戴多星的種子(購自北京玉合種子有限公司)pCAMBIA1391載體(普如汀生物技術(北京)有限公司，目錄號 Biovector-104802)實施例1、啟動子(CsVDEP)的獲得將黃瓜品種戴多星的種子播種于裝有草炭、蛭石和田間土(體積比為1 1 1) 的混合基質中，待植株長至5-6片葉片時，于晴天中午選取幼嫩的葉片，提取葉片的總DNA。
4并以此DNA為模板，根據農科院黃瓜基因組序列比對出一個可能的黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子序列，并設計如下PCR引物上游引物為5’ -TCTAGGATTAGTAGATCGATTGTTACC-3’，下游引物為5’ -GGCGCATCAGTGATTTGAAAAGAAG-3’，通過PCR方法克隆黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子。反應體系如下10XPCR緩沖液5μ 1 ;dNTP Mixture (25mM) 4 μ 1 ；Taq 酶(5U/μ 1)1 μ 1 ；上下游引物(濃度均為ΙΟμΜ)各2μ 1 ；模板(DNA) 2 μ 1 ；ddH20補充至 50 μ 1。PCR反應條件如下95°C預變性5min，94°C變性30S，58°C退火30s，72°C延伸2min, 共30個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。取10 μ L PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，得到2000bp左右大小的目的片段(圖3)。切下目的片段，純化回收后連接到pGEM-T easy載體(Promega公司，商品號 A1360)上，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂有IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)和X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)，含氨芐青霉素(100微克 /毫升)的LB平板上生長過夜。第二天挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜。堿法提取質粒DNA，送樣測序。經同源性比較分析后確定獲得的目的片段即是黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子的片段，將此片段命名為CsVDEP，連接到pGEM-T easy載體后的重組質粒命名為pGEM-T easy =CsVDEP0 CsVDEP的基因序列如序列表中序列1所示。實施例2、啟動子(CsVDEP)功能活性驗證一、含有啟動子序列的植物表達載體構建以實施例1所得的重組質粒pGEM-T easy =CsVDEP為模板，在CsVDEP的兩端設計引物，上游引物為5，ACGCGTCGACTCTAGGATTAGTAGATCGATTGTTACC-3‘(下劃線部分的序列為酶切位點Ml I及其保護堿基，酶切位點Ml I以后的序列對應于序列1的第1-27位)； 下游引物為5，-CATGCCATGGGGCGCATCAGTGATTTGAAAAGAAG-3‘(下劃線部分的序列為酶切位點Nco I及保護堿基，酶切位點Nco I以后的序列對應于序列1的第1959-1983位)。 通過PCR反應擴增出上兩端分別含有酶切位點Ml I和Nco I的CsVDEP片段。再將得到的CsVDEP片段與pCAMBIA1391載體分別同時用上述兩種限制性內切酶酶切后，將目的片段 CsVDEP的酶切產物和pCAMBIA1391載體酶切后的大片段同時回收，用T4連接酶連接后，轉化大腸桿菌。得到的陽性克隆通過PCR和測序鑒定，獲得構建成功的植物表達載體，命名為 PCAMBIA1391CsVDEP。二、根癌農桿菌感受態(tài)細胞的制備、轉化(一 )根癌農桿菌感受態(tài)細胞的制備按照如下步驟操作(1)挑取根癌農桿菌EHA105的單菌落，接種于5ml附加有70mg/L利福平(Rif)液體的YEB培養(yǎng)基中，28°C，搖床震蕩(轉速為200rpm)培養(yǎng)過夜。( 取2ml步驟(1)的培養(yǎng)物至液體YEB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD8tltl為0. 5左右。(3)將步驟O)的培養(yǎng)物冰浴30分鐘，4°C，5000rpm,離心5分鐘，棄去上清液。(4)用IOml預冷的濃度為0. lmol/L的NaCl懸浮菌體。(5) 40C，5000rpm,離心步驟的懸浮液體，5分鐘，棄上清液。(6)用Iml預冷的濃度為20mmol/L的CaCl2懸浮菌體，分裝成200 μ 1/管，液氮中冷凍后-70°C保存。( 二)凍融法轉化農桿菌
按照如下步驟操作(1)冰上融化步驟(一)制備好的感受態(tài)細胞。(2)加入1-2 μ 1質粒步驟一獲得的植物表達載體pCAMBIA1391 =CsVDEP或 PCAMBIA1391空載體，冰浴45分鐘，液氮中冷凍1分鐘，在37°C水浴3分鐘。(3)加入Iml無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28°C，搖床震蕩(轉速為200rpm)培養(yǎng) 3小時。(4) 12000rpm離心1分鐘以濃縮菌液，再用Iml無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基回溶菌體。(5)將轉化后的菌液涂于含50mg/L卡那霉素(Kan)，70mg/L利福平(Rif)的固體 LB培養(yǎng)基上，28 0C，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。將轉入重組載體pCAMBIA1391 =CsVDEP的農桿菌EHA105命名為EHA105/ PCAMBIA1391 =CsVDEP ；轉入 pCAMBIA1391 空載體的農桿菌 EHA105 命名為 EHA105/ PCAMBIA1391。三、轉基因擬南芥的獲得(一 )農桿菌轉化擬南芥擬南芥轉化參照Clough 等[Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip :a simplified methodfor Agrobacteriym-mediated transtormation of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal，16 (6)，735 743]的蘸花法進行。轉化受體為擬南芥 (Arabidopsis thaliana)。將過夜培養(yǎng)的農桿菌(EHA105/pCAMBIA1391 :CsVDEP或EHA105/ PCAMBIA1391)菌液，用浸染液稀釋，把將要開花的花蕾浸泡在農桿菌浸染液中2分鐘，25
暗培養(yǎng)20小時。然后，將轉化的植株開花結果后，收集種子。( 二)轉基因擬南芥的篩選和檢測將收集到的種子，進行表面消毒后，種植在含有潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選。將在潮霉素抗性培養(yǎng)基上能夠正常生長的擬南芥植株轉接到花盆，使其開花結果。 用SDS-CTAB改進法提取植株葉片DNA，針對CsVDEP基因片段，設計引物(上游引物 5，-ACTAAACATTTGGTTCACCAATA-3，；下游引物5，-GGCGCATCAGTGATTTGAAAAGAAG-3，，進行 PCR擴增，從導入EHA105/pCAMBIA1391 =CsVDEP的擬南芥植株中篩選得到轉入CsVDEP基因的陽性植株(得到350bp左右的PCR產物)，收集陽性植株的種子。同時以導入EHA105/ PCAMBIA1391的擬南芥植株作為對照。四、啟動子(CsVDEP)的功能驗證啟動子(CsVDEP)的功能驗證是通過轉基因擬南芥的⑶S基因表達分析及組織化學分析實驗進行的。具體如下所述
(一 )轉基因擬南芥的GUS基因的活性分析(1)甲基傘形酮(MU)標準曲線的制作用終止緩沖液(0. 2mol/L Na2CO3)將MU貯液稀釋，配成濃度范圍在0-10 μ mol/L 的一系列MU標準液，通過測定它們的熒光強度做出一條標準曲線。( ⑶S提取1)取新鮮的植物材料(轉CsVDEP基因擬南芥的根、莖、葉、花、果莢)，放入1. 5ml Effendof管中，加入300 μ 1 GUS提取液(配方0. lmol/L磷酸緩沖液(pH = 7. 0) 50ml ；10 % 十二烷基肌氨酸鈉 Iml ;0. 5mol/L EDTA(pH = 8. 0) 2ml ；甲醇 20ml ;Triton X-100 100 μ 1 ； β -巰基乙醇100 μ 1 ；用H2O定容到100ml)，在冰上用勻漿機將組織磨碎。2)4°C，8000rpm離心lOmin，將上清液轉入新管中，備用。(3)⑶S活性檢測1)測定的每個樣品取3個平行。2)樣品進行測定時，預先準備160 μ 1，lmmol/1的4_甲基傘形酮-β -D-葡萄糖醛酸苷G-MethylumbelIifery-β -D-Glucuronide簡稱MUG)溶液于微量離心管中，在37°C下 7jC浴 5min。3)向上述2)中加入40 μ 1細胞提取液，迅速充分混勻，并立刻取出100 μ 1混合液加入到900 μ 1的反應終止液(0. 2mol/L Na2CO3)中，將該管作為酶促反應的O點。4)15min后，取出100 μ 1的反應液，轉入900 μ 1的反應終止液。5)用熒光分光光度計在激發(fā)波長365nm、發(fā)射波長455nm下，測定不同時間點的熒光值。6)取ΙΟΟμ 1的上清液，用考馬斯亮藍法測定樣品蛋白含量。7)計算每個樣品單位時間內GUS活性。其中計算方法為根據步驟5)所測熒光值及步驟1)的標準曲線，計算得到的單位時間的MU濃度變化，再用單位時間的MU濃度變化除以步驟6)測得的參加反應的樣品蛋白含量，求出單位質量的蛋白單位時間的MU濃度變化，即為單位時間內的GUS活性。GUS活性定量分析結果如圖1(圖1中的數據為三次重復實驗結果的平均值)所示。⑶S活性主要表現在轉CsVDEP基因擬南芥葉片中，根、莖、花和果莢中⑶S活性較低。 而作為陰性對照的轉PCAMBIA1391空載體的擬南芥植株無GUS活性。( 二)轉基因擬南芥的⑶S組織化學分
(1)將待檢測的植物材料根、莖、葉、花以及陰性對照材料(野生型擬南芥)均加入 GUS 染色液配方為200mM PBS (PH7. 0) ； IOOmM K3Ife (CN)6 ；IOOmM K4Ife (CN)6 ；0. 5mM EDTA(PH8. 0) ；X-Gluc (10mg/ml)；吐溫20中，37°C保溫數小時或過夜。(2)樣品(包括葉片等綠色材料)用70%乙醇脫色2-3次，至陰性對照材料呈白色。(3)顯微鏡觀察，白色背景下的藍色即為⑶S表達位點。結果如圖2所示，在轉化了 CsVDEP啟動子的擬南芥中，GUS染色在葉片中呈明顯藍色，花瓣中沒有觀察到明顯藍色，但花萼中染色明顯。植株根中能觀察到微弱藍色。而轉 PCAMBIA1391空載體的擬南芥植株的根、莖、葉、花均未被染色。上述轉基因擬南芥的⑶S基因表達分析及組織化學分析的實驗結果表明，CsVDEP 啟動子是一個葉片中高效特異性表達的啟動子，這對于進一步研究植物的光合作用具有重要意義。
權利要求
1.DNA分子，為如下1) -3)中任一種1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子； 所述3)中的基因，與1)或2)限定的基因最好有95%以上的同源性。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.根據權利要求2所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在pCAMBIA1391的多克隆位點插入權利要求1所述DNA分子得到的重組質粒。
4.根據權利要求2所述的表達盒，其特征在于所述表達盒由具有啟動子功能的所述 DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所述目的基因與所述轉錄終止序列連接。
5.權利要求1所述DNA分子在啟動目的基因在植物表達中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述植物為擬南芥。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于所述表達為葉片特異表達。
8.利用權利要求1所述的DNA分子培育轉基因植物的方法，包括如下步驟1)構建目的基因重組表達載體將目的基因插入權利要求2或3所述重組載體，使權利要求1所述的DNA分子啟動所述目的基因表達，得到目的基因重組表達載體；2)將步驟1)構建的目的基因重組表達載體導入目的植物中，得到在葉片中特異表達所述目的基因的轉基因植物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥。
10.擴增權利要求1所述DNA分子全長或任一片段的引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃瓜紫黃質脫氧環(huán)化酶基因啟動子及其應用。本發(fā)明所提供的啟動子為如下1)-3)中任一種1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交，且具有啟動子功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。本發(fā)明公開了黃瓜紫黃質脫環(huán)氧化酶基因啟動子的序列，實驗證實該啟動子是一個在植物綠色組織中高效特異性表達的啟動子，主要在進行光合作用的綠色植物組織，如葉片中啟動目的基因的表達，這對于進一步研究植物光合作用相關分子生物學信息具有非常重要的意義。
文檔編號A01H5/00GK102329795SQ20111030646
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權日2011年10月11日
發(fā)明者張振賢, 李欣, 眭曉蕾, 趙文超, 黃洪宇 申請人:中國農業(yè)大學