專利名稱：重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，以及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)芍藥種苗的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)現(xiàn)有的芍藥優(yōu)良觀賞品種主要通過(guò)自然實(shí)生選種獲得，有關(guān)芍藥品種介紹的書(shū)籍中都未表明它們的親本來(lái)源。雖然許多科研單位都已有目的地通過(guò)芍藥親本的選擇選配開(kāi)展了芍藥雜交育種，但是多年來(lái)進(jìn)展很慢，究其原因，這是由于芍藥0 ⑶flia lactiflora Pall.)觀賞品質(zhì)中最重要的的重瓣性狀是由其雌蕊或者雄蕊退化后發(fā)生瓣化變異形成，因此，利用觀賞性狀優(yōu)良的芍藥重瓣品種作父母本開(kāi)展雜交育種時(shí)，很難受精結(jié)實(shí)，或雖能結(jié)實(shí)但許多種胚發(fā)育不良而不能播種出苗；根據(jù)我們的工作體驗(yàn)，在獲得的雜交種子中，由于種子胚乳發(fā)育不充實(shí)而不能正常發(fā)芽的種子比率占70%左右，因此，提高雜交種子的成苗率是決定芍藥雜交育種工作效率的關(guān)鍵技術(shù)。植物幼胚培養(yǎng)技術(shù)是利用現(xiàn)代組織培養(yǎng)手段將植物幼胚從種子中分離出來(lái)在離體無(wú)菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)，主要針對(duì)不能正常發(fā)育的種子進(jìn)行胚拯救，這在早熟桃、 杏、無(wú)籽葡萄、櫻桃等作物上被成功應(yīng)用。關(guān)于牡丹、芍藥胚培養(yǎng)的工作，在程金水主編的 《園林植物遺傳育種學(xué)》教材第32章“牡丹芍藥育種”中，李嘉鈺先生指出可借鑒雜種胚培養(yǎng)技術(shù)提高牡丹芍藥遠(yuǎn)緣雜種成苗率，但是沒(méi)有引用有關(guān)文獻(xiàn)具體說(shuō)明；同樣，在呂振偉的 “牡丹與牡丹與芍藥的育種方法”一文中也沒(méi)有牡丹芍藥胚培養(yǎng)的具體引用資料。
關(guān)于芍藥組織培養(yǎng)的研究已有許多工作，主要集中于利用帶節(jié)間莖段、腋芽誘導(dǎo)叢生芽的快繁技術(shù)研究，這些研究在芍藥雜交育種應(yīng)用上作用不大。在周美艷O007)的碩士學(xué)位論文“芍藥組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究”中，作者開(kāi)展了芍藥種胚的離體培養(yǎng)工作， 并已成苗，但是在取材方面，該研究“①、選用的品種‘粉玉奴’是單瓣品種，②、種胚為9月份的成熟種子”，這兩點(diǎn)對(duì)于芍藥育種中“①選用的品種主要為重瓣類型，②種胚發(fā)育不良， 不能正常成熟”條件不一致，因此，該項(xiàng)研究對(duì)芍藥雜交育種工作也沒(méi)有直接應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決重瓣芍藥由于種胚發(fā)育不良而不能正常播種出苗的技術(shù)難題，本發(fā)明提供了一種重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，以及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)芍藥種苗的方法，為芍藥雜交育種提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。本發(fā)明公開(kāi)了一組重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基，它包括
①誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，配方為改良MS+ TDZ 0. 5 1. 5 mg/L，蔗糖IOOg · L—1，瓊脂 6g .LipHSS-S;
②不定芽壯苗培養(yǎng)基，配方為改良MS+ TDZ 0.01 0.05 mg/L,蔗糖30 g.L—1，瓊脂 6 g .LipH 為 5. 8;③生根培養(yǎng)基，配方為1/2改良MS + IAA 0.5 1.0 mg/L，蔗糖30 g · L—1， 瓊脂6 g · L—1，活性炭0. 1%，pH為5. 8 ；
其中所述改良MS，是將MS培養(yǎng)基中的大量元素含量改良為KNO3 125 mg/L、NH4N03 250 mg/L、MgSO4 ·7Η20 125 mg/L,KH2PO4 275 mg/L、CaCl2 · 2H20 250 mg/L，其它微量元素、鐵鹽與有機(jī)成分含量不變；
改良1/2 MS是指將所述改良MS中的大量元素含量減半，其它成分不變。本發(fā)明還公開(kāi)了用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)重瓣芍藥幼胚的方法，具體步驟為 (1)取材-J月上旬取生長(zhǎng)健康的未成熟重瓣芍藥種子，挑取種胚。(2)培養(yǎng)基配方
①誘導(dǎo)不定芽改良MS+ TDZ 0.5 1.5 mg/L，蔗糖IOOg .L—1，瓊脂eg.L—SpH為 5. 8。置于25°C暗培養(yǎng)2個(gè)月(附圖1)；
②不定芽壯苗將上述材料轉(zhuǎn)入改良MS+ TDZ 0. 01 0. 05 mg/L,蔗糖30 g · L—1， 瓊脂6 β· ΛρΗ*5.8。置于25°C，12001x光強(qiáng)下培養(yǎng)2個(gè)月(附圖2)；
③生根將上述健壯的芽轉(zhuǎn)入1/2改良MS + IAA 0.5 1.0 mg/L，蔗糖30 g · ΙΛ瓊脂6 g · L—1，活性炭0. 1%，pH為5. 8。繼續(xù)置于25°C,12001x光強(qiáng)下培養(yǎng)2-3個(gè)月(附圖3)。效果(1)未成熟胚成苗率達(dá)60%以上，克服了重瓣芍藥種子因種胚發(fā)育不良不能成苗的技術(shù)障礙。(2)每個(gè)萌動(dòng)的種胚可以形成3-8個(gè)不定芽，5-10個(gè)肉質(zhì)根，達(dá)到了正常種子播種苗3年才能分化苗的效果，提高了芍藥種苗的生長(zhǎng)速度，有利于芍藥雜種苗早期開(kāi)花，縮短芍藥育種周期。


圖1是傷口一側(cè)形成叢生不定芽。圖2是不定芽在壯苗培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況。圖3是幼苗生根情況。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1
以重瓣芍藥品種‘紅艷爭(zhēng)輝’為試材，開(kāi)展本項(xiàng)研究工作
(1)取材7月上旬采集‘紅艷爭(zhēng)輝’果皮開(kāi)始轉(zhuǎn)色的莢果，用洗滌液浸泡10 min，自來(lái)水沖洗凈洗滌液，用1%浸泡20分鐘后自來(lái)水沖洗干凈，剝?nèi)スv，取出種子，先用75%酒精表面滅菌30 s，再用0.1 %的升汞滅菌8min，無(wú)菌水沖洗5 6遍。置于無(wú)菌濾紙上， 用解剖刀剖開(kāi)種子，用解剖針挑出種胚。(2)培養(yǎng)基配方
①將種胚先接種于以下3種誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基1)、改良MS + TDZ 0.5 mg/L，蔗糖 IOOg · L-1，瓊脂 6g · L-1，pH 為 5. 8 ；2)、改良 MS + TDZ 1. 0 mg/L，蔗糖 IOOg · L-1，瓊脂 6g .Γ1，3)、改良 MS + TDZ 2.0 mg/L，蔗糖 IOOg · Γ1，瓊脂 6g · Λ pH 為 5. 8，pH 為 5. 8， 置于25°C暗培養(yǎng)2個(gè)月，在傷口一側(cè)的橫切面上均能出現(xiàn)一輪約5-10個(gè)叢生芽(附圖1)。②將上述叢生芽根據(jù)芽的多少分割成1-3塊，每塊3-5個(gè)芽，轉(zhuǎn)入降低TDZ的3種培養(yǎng)基1)、改良 MS + 0.01 mg/L + TDZ 0.01 0.05 mg/L,蔗糖 30 g·!/1，瓊脂 6 g · Λ pH 為 5. 8;2)、改良 MS + TDZ 0.02 mg/L,蔗糖 30 g·!/1，瓊脂 6 g · Λ 口!1為5.8，3)改良 MS + TDZ 0. 05 mg/L,蔗糖 30 g.171，瓊脂 6 g · Λ pH 為 5. 8，置于 25°C，12001x 光強(qiáng)下進(jìn)行壯苗培養(yǎng)2個(gè)月，苗均能健壯成長(zhǎng)(附圖2)。③將上述健壯的芽轉(zhuǎn)入以下2種生根培養(yǎng)基1)、1/2改良MS + IAA 0. 5 mg/ L，蔗糖 30 g·!/1，瓊脂 6 g·!/1，活性炭 0.1%，pH 為 5.8 ;2)、1/2 改良 MS + IAA 0.5 mg/L,蔗糖30 g · ΙΛ瓊脂6 g · ΙΛ活性炭0. 1%，pH為5. 8 ；置于25°C,12001x光強(qiáng)下進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-3個(gè)月后均能形成5-10個(gè)肉質(zhì)根，可進(jìn)行煉苗移栽(附圖3)。本發(fā)明不限于這些公開(kāi)的實(shí)施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書(shū)中所描述的范圍，以及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1.一組重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于包括①誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，配方為改良MS+ TDZ 0. 5 1. 5 mg/L，蔗糖IOOg · L—1，瓊脂 6g .LipHSS-S;②不定芽壯苗培養(yǎng)基，配方為改良MS+ TDZ 0.01 0.05 mg/L,蔗糖30 g.L—1，瓊脂 6 g .LipH 為 5. 8;③生根培養(yǎng)基，配方為1/2改良MS+ IAA 0.5 1.0 mg/L，蔗糖30 g · L—1， 瓊脂6 g · L—1，活性炭0. 1%，pH為5. 8 ；其中所述改良MS，是將MS培養(yǎng)基中的大量元素含量改良為KNO3 125 mg/L、NH4N03 250 mg/L、MgSO4 ·7Η20 125 mg/L,KH2PO4 275 mg/L、CaCl2 · 2H20 250 mg/L，其它微量元素、鐵鹽與有機(jī)成分含量不變；改良1/2 MS是指將所述改良MS中的大量元素含量減半，其它成分不變。
2.一種重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)方法，包括選取種胚、培養(yǎng)基配配制和接種培養(yǎng)的步驟，其特征在于所述接種培養(yǎng)的步驟為①誘導(dǎo)不定芽將種胚接入誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，置于25°C暗培養(yǎng)2個(gè)月；所述誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基配方為改良MS + TDZ 0. 5 1. 5 mg/L，蔗糖IOOg · L—1，瓊脂6g · L—1，pH為 5. 8 ；②不定芽壯苗將上述培養(yǎng)的不定芽轉(zhuǎn)入不定芽壯苗培養(yǎng)基，置于25°C，12001x光強(qiáng)下培養(yǎng)2個(gè)月；所述不定芽壯苗培養(yǎng)基配方為改良MS + TDZ 0.01 0.05 mg/L,蔗糖 30 g · L—1，瓊月旨 6 g · Ι^,ρΗ 為 5.8 ；③生根將上述步驟②得到的健壯的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基繼續(xù)置于25°C，12001x光強(qiáng)下培養(yǎng)2-3個(gè)月；所述生根培養(yǎng)基配方為1/2改良MS + IAA 0. 5 1. 0 mg/L，蔗糖 30 g · ΙΛ 瓊脂 6 g · ΙΛ 活性炭 0. 1%，PH 為 5. 8 ；其中所述改良MS，是將MS培養(yǎng)基中的大量元素含量改良為KNO3 125 mg/L、NH4N03 250 mg/L、MgSO4 ·7Η20 125 mg/L,KH2PO4 275 mg/L、CaCl2 · 2H20 250 mg/L，其它微量元素、鐵鹽與有機(jī)成分含量不變；改良1/2 MS是指將所述改良MS中的大量元素含量減半，其它成分不變。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種重瓣芍藥幼胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方，以及利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)芍藥種苗的方法。所述培養(yǎng)基包括誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基、不定芽壯苗培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，是在改良MS或1/2　改良MS基礎(chǔ)上添加TDZ、蔗糖、瓊脂等。所述培養(yǎng)方法，包括選取種胚、培養(yǎng)基配配制和接種培養(yǎng)的步驟，接種培養(yǎng)是用上述的3種培養(yǎng)基依次實(shí)施誘導(dǎo)不定芽、不定芽壯苗及生根步驟。本發(fā)明使未成熟胚成苗率達(dá)60%以上，克服了重瓣芍藥種子因種胚發(fā)育不良不能成苗的技術(shù)障礙。每個(gè)萌動(dòng)的種胚可以形成3-8個(gè)不定芽，5-10個(gè)肉質(zhì)根，達(dá)到了正常種子播種苗3年才能分化苗的效果，提高了芍藥種苗的生長(zhǎng)速度，有利于芍藥雜種苗早期開(kāi)花，縮短芍藥育種周期。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102428872SQ20111031063
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者葛金濤, 薛銀芳, 趙大球, 陶俊, 韓晨霞 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)