專(zhuān)利名稱(chēng)：高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因綿羊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段以及利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
提高動(dòng)物產(chǎn)肉率和瘦肉率一直是動(dòng)物遺傳育種學(xué)家、動(dòng)物繁殖學(xué)家和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家追求的目標(biāo)。通過(guò)改善飼料營(yíng)養(yǎng)比例和使用添加劑等技術(shù)手段可以有限地提高動(dòng)物產(chǎn)肉率和瘦肉率，但效果不顯著，而且還存在一些食品安全問(wèn)題。因此，探尋一條安全有效的提高動(dòng)物產(chǎn)肉性能的途徑對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，屬于生長(zhǎng)分化因子β超家族成員，是肌肉生長(zhǎng)分化的主要負(fù)調(diào)控因子。肌肉生長(zhǎng)抑制素基因敲除小鼠的肌肉發(fā)生了廣泛的增生和肥大，小鼠的骨骼肌重量增加2-3倍。但其他表型同野生型無(wú)顯著差異。世界著名的具有“雙肌”表型的比利時(shí)蘭牛和皮埃蒙特牛都是因?yàn)樵摶虬l(fā)生自然突變所致，它們的產(chǎn)肉量比野生牛要高出30%左右。同時(shí)，“雙肌”牛具有肌肉群異常發(fā)達(dá)，皮下脂肪少，且有更多的脂肪沉積于肌纖維中等表型特征。這些研究表明利用基因工程方法阻斷myostatin基因功能，是一種提高動(dòng)物產(chǎn)肉量和改善肉品質(zhì)的新途徑。RNA干擾技術(shù)是一種在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達(dá)的新技術(shù)，通過(guò)表達(dá)可與靶基因配對(duì)的siRNA，可實(shí)現(xiàn)靶基因的沉默。目前，RNA干擾沉默基因表達(dá)在各種物種的不同基因上得到了充分證明，并實(shí)現(xiàn)應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)、篩選出一段高效抑制myostatin基因的shRNA片段。該片段命名為shMSTN3，shMSTN3可顯著抑制myostatin在細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊的方法。將構(gòu)建的shMSTN3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞，用細(xì)胞篩選技術(shù)篩選出myostatin基因敲低的綿羊成纖維細(xì)胞，并利用體細(xì)胞核移植和胚胎移植技術(shù)制備myostatin基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊。上述利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊方法，是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段的篩選設(shè)計(jì)了 3條靶向myostatin基因的shRNA片段，將這3條shRNA片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞中myostatin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示shMSTN3可顯著抑制myostatin在細(xì)胞中的表達(dá)。(2)綿羊shRNA特異表達(dá)載體的構(gòu)建使用融合PCR的方法，獲得啟動(dòng)子TO和shMSTN3的融合表達(dá)盒子(TO_shMSTN3)，將該表達(dá)盒子克隆到PMD18-T中，產(chǎn)生pU6-shMSTN3載體。(3)myostatin基因沉默綿羊成纖維細(xì)胞的構(gòu)建將pTO_shMSTN3轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞，用新霉素篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，篩選7_10天后，將形成的抗性細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。利用新霉素基因引物對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行PCR鑒定，從而獲得myostatin基因沉默綿羊成纖維細(xì)胞。(4)myostatin基因沉默轉(zhuǎn)基因綿羊的構(gòu)建利用體細(xì)胞核移植技術(shù)將(3)中獲得細(xì)胞構(gòu)建為重構(gòu)胚胎，再通過(guò)胚胎移植技術(shù)將胚胎移植到代孕母羊中，對(duì)出生的羔羊進(jìn)行PCR鑒定，證實(shí)成功構(gòu)建myostatin基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊。本發(fā)明涉及利用RNA干擾技術(shù)沉默綿羊myostatin基因在體細(xì)胞中的表達(dá)。在利用體細(xì)胞核移植技術(shù)，構(gòu)建一種myostatin基因沉默轉(zhuǎn)基因綿羊，該轉(zhuǎn)基因綿羊具有瘦肉率高，生長(zhǎng)快速的特點(diǎn)。本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)構(gòu)建myostatin基因敲低的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊，探索制備具有“雙肌”性狀的綿羊，為最終培育產(chǎn)肉率、瘦肉率和肉品質(zhì)好的優(yōu)良品種家畜奠定基礎(chǔ)。


圖 lpU6_shMSTN3 載體圖譜；圖2整合有shMSTN3的綿羊成纖維細(xì)胞的PCR鑒定；圖3轉(zhuǎn)基因綿羊的PCR鑒定。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段的篩選1. 1靶向myostatin基因shRNA片段的設(shè)計(jì)和合成應(yīng)用生物信息軟件設(shè)計(jì)3條靶向myostatin基因的siRNA，將siRNA序列加上loop 及終止序列，轉(zhuǎn)換為 shRNA，分別為 shMSTNl、shMSTN2、shMSTN3，將 shMSTNl、shMSTN2，shMSTN3亞克隆至pGenesil-1 (晶賽公司)載體，獲得pGenesil-shRNA表達(dá)載體。1. 2shRNA轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天在12孔板中以DMEM(10% FBS)培養(yǎng)綿羊成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80-90%豐度時(shí)，用脂質(zhì)體2000，以1. 8ug/孔的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的總RNA，-80°C保存。1. 3熒光定量PCR檢測(cè)myostatin的表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)中myostatin基因表達(dá)情況。用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞的總RNA，獲得的eDNA用核酸定量?jī)x定量后用于熒光定量PCR。擴(kuò)增myostatin基因使用MSTN_F(5’ -ATCCGATCTCTGAAACTTGACAT-3，)和 MSTN-R(5，-AGTCCTTCTTCTCCTGGTTCTG-3，)引物。內(nèi)參基因 GAPDH 使用 GAPDH-F (5，-GGCGCCAAGAGGGTCAT-3，)和 GAPDH-R (5，-GTGGTTCACGCCCATCACA-3，)引物。定量 PCR 使用了 STOR Green 染料，反應(yīng)體系為 95°C/5min 后；95°C/15s，56°C/15s，720C /IOs共30個(gè)循環(huán)；myostatin的Ct值被GAPDH均一化。myostatin相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)Δ ACT數(shù)值法定量。結(jié)果顯示，shMSTNl, shMSTN2和shMSTN3分別抑制81%、56%和90%的myostatin轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。其中shMSTN3抑制效率最高，與對(duì)照組myostatin基因表達(dá)相比具有顯著差異。實(shí)施例2綿羊shRNA特異表達(dá)載體的構(gòu)建2. IshRNA表達(dá)載體的構(gòu)建參見(jiàn)圖1，使用融合PCR技術(shù)，將TO啟動(dòng)子和shMSTN3片段實(shí)現(xiàn)融合。PCR反應(yīng)條件為95°C /5min 后；95°C /30s, 58°C /30s, 72°C /lmin 共 30 個(gè)循環(huán)，72°C 7min.將 PCR 產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用凝膠回收試劑盒回收U6-shMSTN3基因片段。將回收產(chǎn)物亞克隆至pMD18-T載體中，產(chǎn)生pTO-shMSTN3載體。實(shí)施例3my0Statin基因沉默綿羊成纖維細(xì)胞的構(gòu)建3. 1綿羊成纖維細(xì)胞的制備采集受精35-45d時(shí)的綿羊胚胎，，無(wú)菌取出胎兒，用含雙抗的PBS液洗滌3_4次后，去除頭、尾、四肢和內(nèi)臟部分，剩余部分放入IOmm平皿中，剪成Imm3的組織碎塊，與培養(yǎng)箱中放置4小時(shí)后，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于C02培養(yǎng)箱內(nèi)39. 55% C02飽和濕度培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)或凍存。3. 2綿羊成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選轉(zhuǎn)染前l(fā)d，將綿羊胎兒成纖維細(xì)胞以5 X 105/mL的密度加入含10%小牛血清的DMEM(無(wú)抗生素)培養(yǎng)基中，接種于6孔板。待細(xì)胞80% 90%融合時(shí)，將培養(yǎng)基換為無(wú)雙抗、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，用pTO-shMSTN3載體轉(zhuǎn)染綿羊胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染3 后，1孔傳4-6孔的比例稀釋傳代，24小時(shí)以500 μ g/mL G418篩選。篩選3_5天后，部分細(xì)胞會(huì)開(kāi)始脫落死亡。10天后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞克隆，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，凍存?zhèn)溆谩?. 3陽(yáng)性細(xì)胞的PCR鑒定以新霉素neo基因序列設(shè)計(jì)引物，用于檢測(cè)綿羊成纖維細(xì)胞克隆。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為neo-Pl (ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC)和neo-P2 (ACACCCAGCCGGCCACAGT)。以此為引物，以陽(yáng)性細(xì)胞裂解物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95°C 5min，95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min40sec，循環(huán) 36 次，72°C 10min，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為5^bp。能夠PCR擴(kuò)增出585bp外源基因片段的細(xì)胞克隆被認(rèn)定為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)以水作PCR模板為對(duì)照。參見(jiàn)圖2，結(jié)果共獲得4株整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。實(shí)施例4my0Statin基因沉默轉(zhuǎn)基因綿羊的構(gòu)建4. 1卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)屠宰場(chǎng)大量收集綿羊卵巢，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，經(jīng)生理鹽水洗滌、除結(jié)締組織等附著物后，采用切剖法從2-5mm的卵泡中，分離形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)致密，色澤均一，卵丘細(xì)胞在3層或3層以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。在38. 5°C，5% C02，飽和濕度下培養(yǎng)，采用微滴培養(yǎng)系統(tǒng)在卵母細(xì)胞成熟液OM中體外成熟培養(yǎng)22-24h。4. 2 核移植用0. 透明質(zhì)酸酶吹打消化去除顆粒細(xì)胞，選擇排出第一極體的卵母細(xì)胞在細(xì)胞松弛素中進(jìn)行去核，將供體細(xì)胞(綿羊成纖維細(xì)胞)注入至去核卵母細(xì)胞的透明帶下。
4. 3電融合將供體細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞的接觸面與電流方向放垂直。電融合的電激參數(shù)為120v/mm，3次直流電脈沖誘導(dǎo)體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞相融合。4. 4胚胎激活及培養(yǎng)用Ionomycin聯(lián)合6-DMAP激活重構(gòu)胚胎，轉(zhuǎn)移到SOFaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每4 半量換液1次，4 后檢查卵裂率，第7d檢查記錄囊胚發(fā)育情況。4. 5胚胎移植選擇發(fā)育形態(tài)好的2-8細(xì)胞期轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，通過(guò)外科手術(shù)移植到自然發(fā)情第3天受體綿羊兩側(cè)近輸卵管傘的第一彎曲部。同樣方法將桑甚胚和囊胚移植到自然發(fā)情6d，7d, 8d受體綿羊子宮角。受體綿羊手術(shù)后觀察其返情情況，對(duì)未返情的綿羊在手術(shù)移植后的30-45d，用B超進(jìn)行直腸孕檢，以鑒定受體羊妊娠情況。實(shí)施例5my0Statin基因沉默轉(zhuǎn)基因綿羊的鑒定分析5. 1轉(zhuǎn)基因綿羊PCR鑒定用天根DNA基因組試劑盒提取綿羊基因組，以新霉素neo基因序列引物neo-Pl (ATTCGGCTATGACTGGGCACAAC)和 neo_P2 (ACACCCAGCCGGCCACAGT)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95°C 5min，95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min40sec，循環(huán) 36 次，72°C 10min，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為5^bp。能夠PCR擴(kuò)增出585bp外源基因片段的綿羊被認(rèn)定為轉(zhuǎn)基因克隆綿羊，同時(shí)以非轉(zhuǎn)基因綿羊基因組DNA和水為PCR模板為對(duì)照。參見(jiàn)圖3，結(jié)果獲得2只轉(zhuǎn)基因克隆綿羊。5. 2轉(zhuǎn)基因綿羊myostatin的表達(dá)分析提取綿羊肌肉組織總RNA，用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用核酸定量?jī)x定量后用于熒光定量PCR。擴(kuò)增myostatin基因使用MSTN-F (5，-ATCCGATCTCTGAAACTTGACAT-3，)禾口 MSTN-R(5，-AGTCCTTCTTCTCCTGGTTCTG-3，)引物。內(nèi)參基因 GAPDH使用 GAPDH-F (5，-GGCGCCAAGAGGGTCAT-3，)和 GAPDH-R (5，-GTGGTTCACGCCCATCACA-3，)引物。定量 PCR 使用了 STOR Green 染料，反應(yīng)體系為 95°C/5min 后；95°C/15s，56°C/15s，72°C /10s共30個(gè)循環(huán)；myostatin的Ct值被GAPDH均一化。myostatin相對(duì)表達(dá)水平通過(guò)Δ Δ CT數(shù)值法定量。結(jié)果顯示，2只轉(zhuǎn)基因克隆綿羊中myostatin基因表達(dá)量分別降低7 71%和 49%。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.高效抑制myostatin基因表達(dá)的ShRNA片段shMSTN3，其核苷酸序列為5’_CAAAGATGCTATAAGACAATTCAAGAGATTGTCTTATAGCATCTTTGTTTTTTGGMCG-3’3’-GTTTCTACGATATTCTGTTAAGTTCTCTAACAGAATATCGTAGAAACAAAAAACCTTGC-5’。
2.一種利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建肌肉生長(zhǎng)抑制素基因沉默的轉(zhuǎn)基因綿羊的方法，其特征在于，包括以下主要步驟(1)根據(jù)綿羊myostatin基因的序列，鑒定出一條可高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA 片段shMSTN3 ；(2)構(gòu)建了靶向myostatin基因的shRNA表達(dá)載體；(3)轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞，獲得整合有shRNA表達(dá)載體的綿羊成纖維細(xì)胞；(4)體細(xì)胞核移植和胚胎移植獲得整合有shRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因綿羊；(5)利用PCR，熒光定量RT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)基因綿羊的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因表達(dá)量顯著下降。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在所述步驟(1)中，所述可高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段shMSTN3，其位于myostatin基因的219_237bp位置，靴位點(diǎn)長(zhǎng)度為19bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在所述步驟O)中，克隆TO啟動(dòng)子，以該啟動(dòng)子構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)靶向myostatin基因的shRNA特異表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效抑制myostatin基因表達(dá)的shRNA片段及構(gòu)建轉(zhuǎn)基因綿羊的方法。本發(fā)明以靶向綿羊肌肉生長(zhǎng)抑制素myostatin基因的shRNA構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染綿羊成纖維細(xì)胞后，經(jīng)抗性篩選獲得整合有上述shRNA表達(dá)載體的綿羊成纖維細(xì)胞，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)及胚胎移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因綿羊，試驗(yàn)證實(shí)這種轉(zhuǎn)基因綿羊的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因表達(dá)被沉默，表達(dá)量顯著下降。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102382827SQ201110313899
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者喬軍, 倪偉, 哈孜, 張輝, 王遠(yuǎn)志, 王鵬雁, 盛金良, 胡圣偉, 賽務(wù)加甫, 陳創(chuàng)夫 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)