專利名稱：黃花烏頭轉(zhuǎn)基因苗及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃花烏頭轉(zhuǎn)基因苗及其獲得方法。
技術(shù)背景
關(guān)附甲素是一種治療心絞痛的特效藥品，為一類新藥，用量極微就有很好的療效。 目前，國(guó)內(nèi)主要是從黃花烏頭(Aconitum Coreanum(Levi. ) Rapaics)根(關(guān)白附)內(nèi)提取關(guān)附甲素供藥用。但天然黃花烏頭株纖細(xì)，高達(dá)2米左右，常受氣候的影響，且生產(chǎn)的季節(jié)性強(qiáng)，易受風(fēng)害及病害，這會(huì)嚴(yán)重影響黃花烏頭的產(chǎn)量和質(zhì)量；加之黃花烏頭生長(zhǎng)周期長(zhǎng)， 需5年才能采收1次，受氣候及病蟲害影響大，質(zhì)量不穩(wěn)定；并且，其根頭小，單產(chǎn)低，嚴(yán)重制約黃花烏頭在生產(chǎn)上的應(yīng)用。
發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes, Ar.)為根瘤菌科，革蘭氏陰性菌，根據(jù)來(lái)源不同，發(fā)根農(nóng)桿菌分為8196和A4兩大類，前者是從蘋果樹上分離得到的，致毒力較弱， 后者是從玫瑰植株上分離得到的，致毒力較強(qiáng)。A4型菌株導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化組織合成各種農(nóng)桿堿 (agropine)，因此，又通常稱之為農(nóng)桿堿型菌株。發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞后產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根，也稱為發(fā)狀根(hairy root), 簡(jiǎn)稱為毛根或發(fā)根。發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ri質(zhì)粒(rootinducing plasmid)，其大小為 200 8001Λ。Ri質(zhì)粒上含有T-DNA，其能轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，表現(xiàn)發(fā)根性狀。Ri質(zhì)粒具有普通的質(zhì)粒的特點(diǎn)是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)，能獨(dú)立復(fù)制，為閉合環(huán)狀雙鏈DNA，可自我復(fù)制并具有遺傳的穩(wěn)定性，在特殊環(huán)境中對(duì)細(xì)菌的生存起著重要的作用，它具有可轉(zhuǎn)移性、可重組性、可整合性、可消除性等特點(diǎn)，該質(zhì)粒上存在的RolC基因。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育黃花烏頭苗的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟
1)將黃花烏頭發(fā)根進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；
2)將步驟1)得到的愈傷組織進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，得到黃花烏頭苗。
所述黃花烏頭發(fā)根按照如下方法制備，將含有目的外源基因的重組發(fā)根農(nóng)桿菌導(dǎo)入黃花烏頭葉片中(將Ri質(zhì)粒上rolC轉(zhuǎn)入葉片細(xì)胞)，得到黃花烏頭發(fā)根；所述含有目的外源基因的重組發(fā)根農(nóng)桿菌具體為發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)A4 ；
所述步驟1)和步驟幻中，所述培養(yǎng)的溫度均為22°C _25°C，所述培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為10001ux-15001ux，所述培養(yǎng)的光照時(shí)間均為11小時(shí)/天_13小時(shí)/天，所述培養(yǎng)的時(shí)間均為30天-50天。
所述步驟1)和步驟幻中，所述培養(yǎng)的溫度均為221、231或251，所述培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為10001uxU2001ux或15001ux，所述培養(yǎng)的光照時(shí)間均為11小時(shí)/天、12小時(shí) /天或13小時(shí)/天，所述培養(yǎng)的時(shí)間均為30天、40天或50天。
步驟1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、細(xì)胞分裂素、水4和1/2MS培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)33123533216，濟(jì)南市中天組培園藝用品供應(yīng)中心)混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. Olmg · L^1-O. 2mg · 所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mg · L4-IOmg · Γ1 ；
步驟2)中，所述脫分化的培養(yǎng)基按照如下方法制備將6-芐氨基嘌呤、水和1/2MS 培養(yǎng)基混合，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mg · L4-IOmg · L—1。
步驟1)中，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Olmg · Γ1、 0. Img · Γ1或0. 2mg · Γ1 ；所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為 0. 5mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1
步驟2)中，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度具體為 0. 5mg · L-1、lmg · L-1、2mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1。
在所述步驟1)前還包括如下步驟將所述黃花烏頭發(fā)根進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)發(fā)根。
所述預(yù)培養(yǎng)的溫度為22°C _25°C，所述預(yù)培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為10001ux-15001ux，所述預(yù)培養(yǎng)的光照時(shí)間為11小時(shí)/天-13小時(shí)/天；所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為30天-60天；
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. 01 0. 2mg · L—1，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Olmg · L-1、?！?Img · L-1或0. 2mg · L-1 ；
所述預(yù)培養(yǎng)的溫度為22°C、23°C或25°C，所述預(yù)培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為lOOOlux、 1200lux或1500lux，所述預(yù)培養(yǎng)的光照時(shí)間為11小時(shí)/天、12小時(shí)/天或13小時(shí)/天，所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為30天、40天或60天。
所述黃花烏頭發(fā)根的長(zhǎng)為2cm-2. 5cm ；所述黃花烏頭發(fā)根的長(zhǎng)具體為2cm、2. 3cm 或 2. 5cm。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于培育黃花烏頭苗的培養(yǎng)基。
本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，由上述方法中的所述脫分化的培養(yǎng)基、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基和所述脫分化的培養(yǎng)基組成。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用黃花烏頭的發(fā)根進(jìn)行成苗，其成苗率高，且所獲得的黃花烏頭再生苗在普通的組織培養(yǎng)基中即能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，繁殖速度快，生產(chǎn)周期短 (約30天左右)，不受自然條件的影響，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)集約化生產(chǎn)，克服了人工種植黃花烏頭時(shí)所具有的繁殖速度慢、育種周期長(zhǎng)、抗性低、遺傳穩(wěn)定性差等缺陷；此再生苗具有廣闊的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。


圖1為黃花烏頭再生苗具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、黃花烏頭再生苗的培育
以黃花烏頭發(fā)根為外植體，在脫分化培養(yǎng)基上，再經(jīng)芽叢誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)，幾個(gè)月培養(yǎng)后即可獲得再生苗無(wú)性系。
一、黃花烏頭發(fā)根的獲得
將發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes) A4 (Ri質(zhì)粒的快速提取及rolC基因的克隆，李昌禹，馬海琴，趙壽經(jīng)，臧埔[J]吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2003，25 C3) :263 沈5， 公眾可從李昌禹，王英平，盧淑波，張慶田，孔祥義，徐佳萍，艾軍獲得，利用上述文獻(xiàn)的方法，對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌及目的物的PCR檢測(cè)利用rolC引物，對(duì)從農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒及黃花烏頭再生苗葉片提取的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了同樣大小的DNA序列；此菌株內(nèi)含有Ri 質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒上含有目的基因rolC，其核苷酸序列為序列1。)轉(zhuǎn)入黃花烏頭(Aconitum Coreanum (Levi.) Rapaics)(科技成果黃花烏頭無(wú)公害規(guī)范化生產(chǎn)示范基地建設(shè)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，2004-01 2006-12公眾可從李昌禹，王英平，盧淑波，張慶田，孔祥義，徐佳萍，艾軍獲得)葉片，與發(fā)根農(nóng)桿菌A4工程菌液共培養(yǎng)10分鐘，具體為將發(fā)根農(nóng)桿菌A4在進(jìn)行YEB液體培養(yǎng)16小時(shí)，再轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)液內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)后，此培養(yǎng)液即可作為工程菌使用，將黃花烏頭葉片切成0. 5cm 1. OcmX 1. 0cm，浸入到農(nóng)桿菌工程液， 共培養(yǎng)(室溫25°C ) 10分鐘后，得到黃花烏頭發(fā)根。
提取黃花烏頭發(fā)根的基因組DNA，用引物序列5 ‘ CGAAGCTTCTATATTCGCACAACG3 ‘ (5'-上游區(qū) 12276) ;5' GCGAATTCGCGATGAAATCAAGTATCC3‘ (3'-下游區(qū) 13134)進(jìn)行擴(kuò) ±曾，得到PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測(cè)序，其核苷酸序列為序列表中的序列1，說(shuō)明該發(fā)根內(nèi)含有rolC基因，證明其為所需要獲得的黃花烏頭發(fā)根。
二、黃花烏頭再生苗培育
方法1
1)預(yù)培養(yǎng)
將上述步驟1獲得的黃花烏頭發(fā)根分別切成2cm長(zhǎng)根段，1 2段/發(fā)根(共72 段發(fā)根)，轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，于22°C、光照強(qiáng)度為lOOOlux，光照時(shí)間為12小時(shí)/ 天，培養(yǎng)30d (每瓶10段)，得到預(yù)培養(yǎng)發(fā)根；
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. Olmg · Γ1 ；
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟1)得到的預(yù)培養(yǎng)發(fā)根接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于22°C、光照強(qiáng)度為lOOOlux，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，培養(yǎng)30d直到長(zhǎng)出愈傷組織；
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、細(xì)胞分裂素、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. Img · L—1，所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 5mg · L—1。
3)脫分化培養(yǎng)將步驟2、得到的愈傷組織轉(zhuǎn)入脫分化的固體培養(yǎng)基上，于22°C、 光照強(qiáng)度為lOOOlux，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，培養(yǎng)30天，得到18株黃花烏頭苗(圖1所示)，成苗率為25%。
所述脫分化的培養(yǎng)基按照如下方法制備將6-芐氨基嘌呤、水和1/2MS培養(yǎng)基混合，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mg · L—1。
方法2
1)預(yù)培養(yǎng)與方法1基本相同，不同的是將黃花烏頭發(fā)根分別切成2. 3cm長(zhǎng)根段 (1000段)，于23°C、光照強(qiáng)度為12001UX，光照時(shí)間為11小時(shí)/天，培養(yǎng)40d ；6
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. Img · Γ1 ；
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)
與方法1基本相同，不同的是于23°C、光照強(qiáng)度為12001UX，光照時(shí)間為11小時(shí)/ 天，培養(yǎng)40d；
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、細(xì)胞分裂素、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. Olmg · L—1，所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為5mg · L—1 ；
3)脫分化培養(yǎng)
與方法1基本相同，不同的是于23°C、光照強(qiáng)度為12001UX，光照時(shí)間為11小時(shí)/ 天，培養(yǎng)40d；
所述脫分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將6-芐氨基嘌呤、水和1/2MS培養(yǎng)基混合，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度為5mg · L—1。
得到23株黃花烏頭苗，成苗率為2.3%。
方法3
1)預(yù)培養(yǎng)與方法1基本相同，不同的是將黃花烏頭發(fā)根分別切成2. 5cm長(zhǎng)根段 (2000段)，于25°C、光照強(qiáng)度為15001UX，光照時(shí)間為13小時(shí)/天，培養(yǎng)60d ；
所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. 2mg · Γ1 ；
2)誘導(dǎo)培養(yǎng)
與方法1基本相同，不同的是于25°C、光照強(qiáng)度為15001UX，光照時(shí)間為13小時(shí)/ 天，培養(yǎng)50d；
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、細(xì)胞分裂素、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. 2mg · L—1，所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為IOmg · L—1 ；
3)脫分化培養(yǎng)
與方法1基本相同，不同的是于25°C、光照強(qiáng)度為15001UX，光照時(shí)間為13小時(shí)/ 天，培養(yǎng)50d；
所述脫分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將6-芐氨基嘌呤、水和1/2MS培養(yǎng)基混合，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度為IOmg · Γ1。
得到48株黃花烏頭苗，成苗率為2.4%。
三、黃花烏頭苗的擴(kuò)大、快繁培養(yǎng)
分別將上述步驟二的方法一得到的黃花烏頭苗置于1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)(于25°C、光照強(qiáng)度為15001UX，光照時(shí)間為11小時(shí)/天，培養(yǎng)60d)，每30d轉(zhuǎn)繼代1次， 繁殖系數(shù)均為5 (黃花烏頭的繁殖系數(shù)為5 7為好)。
將上述步驟二的方法一得到的18株黃花烏頭苗在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(1/2MS固體培養(yǎng)基) 生根培養(yǎng)(于25°C、光照強(qiáng)度為15001UX，光照時(shí)間為11小時(shí)/天，培養(yǎng)30d)，平均生根率為90%，得到組培苗。
于25°C、自然光下，組織苗培養(yǎng)育苗缽里，置于小溫棚內(nèi)，濕度保持在95%以上，栽培基質(zhì)為根層為河沙1cm，沙以下為田園土，培養(yǎng)20d后，逐漸撤去溫棚，轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)管理，移栽成活率為80%，此苗自然休眠后那為成品苗，得苗率為70%。于次年帶土坨定植到田間即可。
觀察成品苗木，其平均株高為0. 5m,已達(dá)到2 3年生狀態(tài)，將其繼續(xù)栽培次年可開花，且開花率為70%，地下部即可分生多數(shù)小子根(小子根數(shù)量平均為6，大小平均為 Icm) ο
采用同樣的方法檢測(cè)方法二和三獲得的黃花烏頭苗，結(jié)果與方法一無(wú)顯著差異。
而現(xiàn)有的黃花烏頭的繁殖都是采用種子繁殖，種子繁殖的育種率低，種子萌發(fā)率在20%，第一年只長(zhǎng)出子葉，第二年才能長(zhǎng)出真葉，因此繁殖速度慢。
權(quán)利要求
1.一種培育黃花烏頭苗的方法，包括如下步驟1)將黃花烏頭發(fā)根進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，得到黃花烏頭苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述黃花烏頭發(fā)根按照如下方法制備將含有目的外源基因的重組發(fā)根農(nóng)桿菌導(dǎo)入黃花烏頭葉片中，得到黃花烏頭發(fā)根；所述含有目的外源基因的重組發(fā)根農(nóng)桿菌具體為發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)A4 ；所述步驟1)和步驟幻中，所述培養(yǎng)的溫度均為22°c -25°C，所述培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為 10001ux-15001ux，所述培養(yǎng)的光照時(shí)間均為11小時(shí)/天-13小時(shí)/天，所述培養(yǎng)的時(shí)間均為30天-50天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟1)和步驟幻中，所述培養(yǎng)的溫度均為22°C、23°C或25°C，所述培養(yǎng)的光照強(qiáng)度均為10001ux、12001ux或15001UX，所述培養(yǎng)的光照時(shí)間均為11小時(shí)/天、12小時(shí)/天或13小時(shí)/天，所述培養(yǎng)的時(shí)間均為30、40或50天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、細(xì)胞分裂素、 水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為0. Olmg ^r1-O. ang·!/1，所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度為 0. 5mg · IZ1-IOmg · L-1 ；步驟中，所述脫分化的培養(yǎng)基按照如下方法制備將6-芐氨基嘌呤、水和1/2MS培養(yǎng)基混合，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度為0. 5mg · L4-IOmg · L—1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述萘乙酸在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Olmg ·Ι^、 0. Img · L—1或0. 2mg · L—1，所述細(xì)胞分裂素在所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中的濃度具體為 0. 5mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1 ；步驟2)中，所述6-芐氨基嘌呤在所述脫分化的培養(yǎng)基中的濃度具體為0. 5mg · L—1、 Img · L-1、2mg · L-1、5mg · L-1 或 IOmg · L-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于在所述步驟1)前還包括如下步驟將所述黃花烏頭發(fā)根進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，得到預(yù)培養(yǎng)發(fā)根。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述預(yù)培養(yǎng)的溫度為22°C _25°C，所述預(yù)培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為10001UX-15001UX，所述預(yù)培養(yǎng)的光照時(shí)間為11小時(shí)/天-13小時(shí)/天；所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為30天-60天；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備將萘乙酸、水和1/2MS培養(yǎng)基混合得到培養(yǎng)基，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. Olmg · L^1-O. 2mg · L—1，所述萘乙酸在所述預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度具體為0. Olmg · L-1、?！?Img · L-1或0. 2mg · L-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述預(yù)培養(yǎng)的溫度為22°C、23°C或25°C，所述預(yù)培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為lOOOlux、12001ux 或15001ux，所述預(yù)培養(yǎng)的光照時(shí)間為11小時(shí)/天、12小時(shí)/天或13小時(shí)/天，所述預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間為30天、40天或60天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述黃花烏頭發(fā)根的長(zhǎng)為2cm-2. 5cm ；所述黃花烏頭發(fā)根的長(zhǎng)具體為2cm、2. 3cm或 2. 5cm0
10.一種用于培育黃花烏頭苗的培養(yǎng)基，由權(quán)利要求1-9所述方法中的所述脫分化的培養(yǎng)基、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基和所述脫分化的培養(yǎng)基組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃花烏頭苗及其獲得方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)將黃花烏頭發(fā)根進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；2)將步驟1)得到的愈傷組織進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，得到黃花烏頭苗。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用黃花烏頭的發(fā)根進(jìn)行成苗，其成苗率高，且所獲得的黃花烏頭再生苗在普通的組織培養(yǎng)基中即能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，繁殖速度快，生產(chǎn)周期短(約30天左右)，不受自然條件的影響，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)集約化生產(chǎn)，克服了人工種植黃花烏頭時(shí)所具有的繁殖速度慢、育種周期長(zhǎng)、抗性低、遺傳穩(wěn)定性差等缺陷；此再生苗具有廣闊的應(yīng)用前景和利用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102499078SQ20111031720
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者盧淑波, 孔祥義, 張慶田, 徐佳萍, 李昌禹, 王英平, 艾軍 申請(qǐng)人:盧淑波, 孔祥義, 張慶田, 徐佳萍, 李昌禹, 王英平, 艾軍