專利名稱：抑制FLPs神經(jīng)肽基因的dsRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制FLPs神經(jīng)肽基因的dsRNA及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲是世界范圍內(nèi)的重要病原生物之一，它給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴重損失，每年全世界因此而造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失高達1570億。目前世界上已經(jīng)報道的根結(jié)線蟲有90余種，而南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M. javanica)，花生根結(jié)線蟲(Marenaria)和北方根結(jié)線蟲(M. hap la)占整個根結(jié)線蟲的95%。南方根結(jié)線蟲造成設(shè)施生產(chǎn)的一系列問題并使其大量經(jīng)濟作物減產(chǎn)。而在我國北方，以南方根結(jié)線蟲為主，根結(jié)線蟲的寄主植物范圍廣泛，超過3000種植物，包括單子葉植物，雙子葉植物，草本植物，木本植物，特別是蔬菜中的茄科、葫蘆科等經(jīng)濟價值高的作物，尤其是番茄和黃瓜， 受害后，一般可造成減產(chǎn)30% 40%，甚至絕收。當前，根結(jié)線蟲的防治主要以化學藥品防治為主，但是，由于其對環(huán)境、人畜安全的危害，逐漸被立法部門取消。所以，安全有效的生物學防治方法迫在眉睫。根結(jié)線蟲主要包括六個生育期，而在線蟲的二齡期，利用發(fā)達的受神經(jīng)支配的頭感器，通過頭部的嗅覺神經(jīng)元(AWA，AffC)來感知根系散發(fā)出的信號物質(zhì)，向寄主植物進行趨向性遷移，侵染植物，從而完成其生命周期。因此，在根結(jié)線蟲的二齡期，可以通過干擾根結(jié)線蟲的趨向性遷移，起到線蟲防治的目的。隨著模式動物Caenorhabditis elegans基因組測序工作的完成，已經(jīng)分離和鑒定了 19，800個能夠編碼6627個蛋白家族的基因，并對有關(guān)基因的功能進行了詳細而深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種dsRNA。本發(fā)明提供的dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。上述dsRNA的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍。含有上述dsRNA或其編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種DNA分子。本發(fā)明提供的DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列3。本發(fā)明的另一個目的是提供一種防治線蟲的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為所述dsRNA或所述編碼基因或所述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或所述DNA分子。上述dsRNA或其編碼基因或上述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或上述的DNA分子在抑制Mi-flp-18基因表達中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍，所述Mi-flp-18基因的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述dsRNA或上述編碼基因或上述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或上述的DNA分子在制備防治線蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述dsRNA或上述編碼基因或上述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或上述的DNA分子在防治線蟲中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應(yīng)用是通過降低線蟲對寄主植物的趨向性遷移和/或降低線蟲侵染和繁殖能力體現(xiàn)。在上述應(yīng)用中，所述降低線蟲對寄主植物的趨向性遷移通過降低吸引指數(shù)體現(xiàn)；在上述應(yīng)用中，所述降低線蟲侵染和繁殖能力通過減少根結(jié)數(shù)量體現(xiàn)；在上述應(yīng)用中，所述線蟲為南方根結(jié)線蟲；在本發(fā)明的實施例中，上述寄主植物為番茄。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種dsRNA，浸泡南方根結(jié)線蟲的二齡幼蟲，通過RNAi后，有效的趨避南方根際線蟲向寄主植物的趨向性遷移，降低對寄主植物的侵染， 而且還抑制了線蟲的繁殖，從生物學安全的角度上考慮，dsRNA不會產(chǎn)生功能蛋白，具有專一性的特點，減少對非目標生物的影響。


圖1為RNAi處理對線蟲表型、吸收及在轉(zhuǎn)錄水平的效應(yīng)圖2為RNAi處理對線蟲趨向性的影響圖3為RNAi處理對線蟲侵染的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。番茄(Lycopersicon esculentum cv.)佳粉19，種子購自北京蔬菜花卉研究所。南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)(武揚，鄭經(jīng)武，商晗武.根結(jié)線蟲分類和鑒定途徑及進展.浙江農(nóng)業(yè)學報.2005，17:106-110，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得)從山東壽光溫室大棚土壤中分離獲得。大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司。pMD20-T 購自 TAKARA 公司。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生物技術(shù)公司；Trizol試劑、RNase-free DNAse I，Taq 等 DNA 聚合酶，Real-time PCR 的試劑、SYBE GREEN 用東洋紡的產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶采用Promega公司產(chǎn)品；MEGAscript RNAi Kit試劑盒購自Ambion公司； 亞精胺、FITC購自sigma公司；其他主要化學試劑為國產(chǎn)AR級試劑。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生物工程公司合成，DNA測序由上海生物工程公司完成。表1實施例中所用的基因及引物
權(quán)利要求
1.一種dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。
2.權(quán)利要求1所述dsRNA的編碼基因。
3.含有權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒。
4.一種DNA分子，其核苷酸序列為序列表中的序列3。
5.一種防治線蟲的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述編碼基因或權(quán)利要求3所述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或權(quán)利要求4所述的 DNA分子。
6.權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述編碼基因或權(quán)利要求3所述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或權(quán)利要求4所述的DNA分子在抑制Mi-f lp-18基因表達中的應(yīng)用；所述Mi-flp-18基因的核苷酸序列為序列表中的序列4。
7.權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述編碼基因或權(quán)利要求3所述重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或權(quán)利要求4所述的DNA分子在制備防治線蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用；或權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述編碼基因或權(quán)利要求3所述重組表達載體、 轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或表達盒或權(quán)利要求4所述的DNA分子在防治線蟲中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用通過降低線蟲對寄主植物的趨向性和/或降低線蟲侵染和繁殖能力體現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述線蟲為南方根結(jié)線蟲；所述寄主植物為番茄。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制FLPs神經(jīng)肽基因的dsRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了dsRNA，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了一種dsRNA(dsRNA)，浸泡南方根結(jié)線蟲的二齡幼蟲，通過RNAi后，有效的趨避南方根際線蟲向寄主植物的趨向性遷移，降低對寄主植物的侵染，而且還抑制了線蟲的繁殖，從生物學安全的角度上考慮，dsRNA不會產(chǎn)生功能蛋白，具有專一性的特點，減少對非目標生物的影響。
文檔編號A01P5/00GK102352357SQ20111032206
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者左元梅, 李曉林, 董林林 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學