專利名稱：一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚層來(lái)源的一類具有多向分化能力的干細(xì)胞，廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并能在特定條件下分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的深入研究，目前已經(jīng)可以從多種組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有支持造血和調(diào)節(jié)免疫等作用，在造血重建、組織修復(fù)、免疫治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)MHC II 類分子及共刺激因子B7-1、B7-2、⑶40、⑶40L等，極少表達(dá)MHC I類分子，因此免疫原性弱。由于以上間充質(zhì)干細(xì)胞的作用及特性，近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞被用于臨床多種疾病的臨床試驗(yàn)及治療中，并且表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)有資質(zhì)開展大規(guī)模分離、擴(kuò)增、培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞的機(jī)構(gòu)很少，而間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用范圍卻非常廣泛，因此急需研究一種間充質(zhì)干細(xì)胞保護(hù)液，使間充質(zhì)干細(xì)胞在此種保護(hù)液中活性維持時(shí)間較長(zhǎng)，可以滿足運(yùn)輸?shù)絿?guó)內(nèi)大多數(shù)地區(qū)及周邊國(guó)家的要求，并且可以直接應(yīng)用于人體，安全無(wú)毒。目前國(guó)內(nèi)可以大量提供人間充質(zhì)干細(xì)胞的機(jī)構(gòu)通常是采用生理鹽水或者細(xì)胞培養(yǎng)基作為臨床間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用時(shí)的溶液介質(zhì)。如果將人間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增后，立即給病人應(yīng)用，生理鹽水是方便安全的，但是間充質(zhì)干細(xì)胞在生理鹽水中活力下降的速度非常快，單純用生理鹽水保存間充質(zhì)干細(xì)胞，2小時(shí)后細(xì)胞活力就會(huì)降低10%左右，因此只適用于間充質(zhì)干細(xì)胞的即時(shí)使用?，F(xiàn)有的另外一種細(xì)胞保護(hù)液是將細(xì)胞培養(yǎng)基作為成份之一，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所需的糖類、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素等物質(zhì)，對(duì)于維持細(xì)胞滲透壓及活力有較好的作用，但是目前國(guó)內(nèi)大部分細(xì)胞培養(yǎng)基均是僅供科研使用，不作為臨床應(yīng)用的常規(guī)試劑，因此臨床應(yīng)用人間充質(zhì)干細(xì)胞的同時(shí)直接應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)基的安全性及可靠性不確定， 并且細(xì)胞培養(yǎng)基由于生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)方法的不同，質(zhì)量、純度、價(jià)格也不等，純度、質(zhì)量都比較好的進(jìn)口培養(yǎng)基價(jià)格更貴?，F(xiàn)有技術(shù)是用TC199無(wú)血清培養(yǎng)基、人血白蛋白和低分子肝素鈣配置的溶液作為人間充質(zhì)干細(xì)胞的保存液。該技術(shù)將人間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、收集后分別用含有人血清白蛋白的TC199和含有1 %人血清白蛋白的生理鹽水保存，細(xì)胞濃度為5 X 105/ml， 4°C保存8小時(shí)后，生理鹽水組的細(xì)胞活力明顯低于TC199組；調(diào)整人血白蛋白的濃度，分別使TC199中含有0. 5%、1%、2%、5%的人血白蛋白，1%、2%、5%的人血白蛋白對(duì)于保持間充質(zhì)干細(xì)胞的活力都是有益的；用含人血白蛋白的TC199分別配制含0. 01% EDTA、 75AXaIU/ml低分子肝素鈉、75AXaIU/ml低分子肝素鈣的溶液保存人間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低分子肝素鈣可以有效防止間充質(zhì)干細(xì)胞聚集?？傊F(xiàn)有技術(shù)是將TC199培養(yǎng)基、人血白蛋白、低分子肝素鈣作為保存液保存人間充質(zhì)干細(xì)胞，干細(xì)胞可以保持90%以上的活力對(duì)小時(shí)，細(xì)胞活力隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸遞減，并且可以防止干細(xì)胞與容器內(nèi)壁的粘附。但現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)之一在于間充質(zhì)干細(xì)胞保存液中的TC199是一種細(xì)胞培養(yǎng)基， 細(xì)胞培養(yǎng)基通常被用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞及組織培養(yǎng)，并非國(guó)家批準(zhǔn)可以臨床應(yīng)用于人體的試劑， 成份復(fù)雜，不同生產(chǎn)廠家的培養(yǎng)基質(zhì)量不一，進(jìn)口試劑價(jià)格昂貴，而且近年來(lái)隨著生物試劑領(lǐng)域的不斷發(fā)展，TC199已經(jīng)逐漸退出培養(yǎng)基市場(chǎng)，被其它培養(yǎng)基所替代，因此其來(lái)源有限?？傊?，盡管現(xiàn)有技術(shù)用TC199作為間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的有效成份可以保持細(xì)胞活力M小時(shí)，從試劑來(lái)源、臨床應(yīng)用的合法性、試劑成本方面考慮都是不利于間充質(zhì)干細(xì)胞臨床推廣使用的。現(xiàn)有技術(shù)的另一個(gè)不足之處在于其保持間充質(zhì)干細(xì)胞活力的時(shí)間較短，間充質(zhì)干細(xì)胞在現(xiàn)有技術(shù)的細(xì)胞保存液中可以保持90%以上活力僅M個(gè)小時(shí)，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)， 細(xì)胞活力下降，那么就意味著超過(guò)M小時(shí)，細(xì)胞活力將下降到90%以下，然而干細(xì)胞治療及臨床試驗(yàn)已經(jīng)在國(guó)內(nèi)多數(shù)城市及國(guó)外多個(gè)國(guó)家開展，利用現(xiàn)有的交通工具二4小時(shí)的活力維持時(shí)間明顯限制了間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，該保存液能延長(zhǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性維持時(shí)間，降低保存液的制備成本，且臨床應(yīng)
用安全可靠。本發(fā)明的另一目的在于提供上述間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的用途。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，含有占保存液體積5-15%的人AB型臍帶血血漿和 70-80AXaIU/ml的低分子肝素鈣，余量為生理鹽水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖水溶液；所述的低分子肝素鈣的濃度優(yōu)選75AfeIU/ml ；所述的人AB型臍帶血血漿與間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自同一提供者。上述的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的制備方法，是將人AB型臍帶血血漿、低分子肝素鈣與生理鹽水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖水溶液混合均勻即可。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(1)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液能延長(zhǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性維持時(shí)間(4_15°C 下保持90%以上的活性72小時(shí))，使得間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)途遠(yuǎn)距離運(yùn)輸成為可能，大大增加了間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用范圍。(2)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的制備方法簡(jiǎn)單，降低了保存液的制備成本。(3)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液其臨床應(yīng)用安全可靠。臍帶血血漿比一般人血漿中含有更多的生長(zhǎng)因子，對(duì)于細(xì)胞的保存來(lái)說(shuō)具有比人血白蛋白以及普通人血清更好的效果，同時(shí)由于是AB型的臍帶血血漿，輸注于任何血型的人體時(shí)都不會(huì)引起溶血反應(yīng)。該 AB型臍帶血血漿和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于同一個(gè)胎盤，屬于自體血漿，這就減少了外源病毒污染的可能性。
(4)間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明的保存液中保存72小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)正常、不影響其增殖擴(kuò)增能力、不影響間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。


圖1是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型分析結(jié)果圖。圖2是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明的保存液A中保存7 后的細(xì)胞表型分析結(jié)果圖。圖3是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明的保存液B中保存7 后的細(xì)胞表型分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及表型鑒定(1)將臍帶在含100IU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的注射用生理鹽水中浸泡10-15 分鐘。(2)用注射用生理鹽水充分沖洗臍帶，然后將臍帶組織塊剪碎成Imm3的小塊。(3)加入LONZA培養(yǎng)基懸浮組織塊，將全部組織塊接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于 37°C>5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國(guó))中培養(yǎng)。(4)組織塊培養(yǎng)1周后全量換LONZA培養(yǎng)基，棄去組織塊及非貼壁細(xì)胞。(5)以后每3天半量換LONZA培養(yǎng)基，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察細(xì)胞至80%融合時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶(GIBC0公司，美國(guó))消化細(xì)胞，按1 3傳代。(6)收集細(xì)胞以FITC標(biāo)記的CD45、CD90(BD公司，美國(guó))，PE標(biāo)記的CD105、CD34、 CD73(BD公司)進(jìn)行流式細(xì)胞儀(Fascalibur，BD公司，美國(guó))檢測(cè)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型分析結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá) 〇090、00105、0073，不表達(dá)0045、0034。如圖 1 所示。2、人AB型臍帶血血漿的濃度選擇以下所述低分子肝素鈣購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司。配制保存液1 :占保存液體積1 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的生理鹽水注射液配制保存液2 占保存液體積5 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的生理鹽水注射液 配制保存液3 占保存液體積10 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的生理鹽水注射液配制保存液4 占保存液體積15 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的生理鹽水注射液配制保存液6 占保存液體積1 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的5% (質(zhì)量比)葡萄糖注射液
配制保存液7 占保存液體積5 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的5% (質(zhì)量比)葡萄糖注射液配制保存液8 占保存液體積10 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的5% (質(zhì)量比)葡萄糖注射液配制保存液9 占保存液體積15 %的人AB型臍帶血血漿+75AXaIU/ml低分子肝素鈣的5% (質(zhì)量比)葡萄糖注射液制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，密度為5X IO5個(gè)/ml。分裝M管(每種保存液3支平行管)dml/管；分別加入3ml配制好的保存液，將細(xì)胞混勻后置于4°C保存72小時(shí)，期間分別于第12、24、36、48、72小時(shí)時(shí)用臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率。結(jié)果判斷死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深藍(lán)色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色， 鏡下呈無(wú)色透明狀。結(jié)果人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞保存于含有不同體積分?jǐn)?shù)的人AB型臍帶血血漿 +75AXaIU/ml低分子肝素鈣的5%葡萄糖注射液(或生理鹽水)的保存液中，人AB型臍帶血血漿濃度分別為1%、5%、10%、15%，結(jié)果表明5-15%濃度的人AB型臍帶血血漿對(duì)于細(xì)胞活力及形態(tài)的維持較適宜。結(jié)果如表1和2所示。表 權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，其特征在于含有占保存液體積5-15%的人AB型臍帶血血漿和70-80AXaIU/ml的低分子肝素鈣；所述的人AB型臍帶血血漿與間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自同一提供者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，其特征在于所述的低分子肝素鈣的濃度為 75AXaIU/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，其特征在于余量為生理鹽水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖水溶液。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液的制備方法，其特征在于包括以下步驟將人AB型臍帶血血漿、低分子肝素鈣與生理鹽水或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖水溶液混合均勻即可。
5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液在間充質(zhì)干細(xì)胞保存液中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液及其制備方法與應(yīng)用，該間充質(zhì)干細(xì)胞保存液含有占保存液體積5-15％的人AB型臍帶血血漿和70-80AXaIU/ml的低分子肝素鈣；所述的人AB型臍帶血血漿與間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自同一提供者。本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液能延長(zhǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的活性維持時(shí)間(4-15℃下保持90％以上的活性72小時(shí))，間充質(zhì)干細(xì)胞在本發(fā)明的保存液中保存72小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)正常、不影響其增殖擴(kuò)增能力、不影響間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征。本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞保存液其臨床應(yīng)用安全可靠，AB型臍帶血血漿和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于同一個(gè)胎盤，屬于自體血漿，這就減少了外源病毒污染的可能性。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102365933SQ20111032531
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者萬(wàn)樺, 魏偉 申請(qǐng)人:廣州市天河諾亞生物工程有限公司