專利名稱：一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法。
背景技術(shù)：
玉米單倍體產(chǎn)生的主要途徑是誘導(dǎo)系雜交誘導(dǎo)途徑產(chǎn)生母本(雌性)單倍體，簡稱為孤雌生殖單倍體。孤雌生殖單倍體可以通過生物誘導(dǎo)和非生物誘導(dǎo)(如化學(xué)誘導(dǎo))等途徑產(chǎn)生，但非生物誘導(dǎo)的問題與花藥組培一樣存在很多困難，很難在育種上應(yīng)用。生物誘導(dǎo)是利用生物誘導(dǎo)材料使誘導(dǎo)對象產(chǎn)生單倍體。Coe (Coe E H.A line of maize withhigh haploid frequency [J].Am Nat, 1959,93:381-382)在 1959 年發(fā)現(xiàn)了玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系Stock6。后來在其基·礎(chǔ)上不斷改造,如轉(zhuǎn)入Navajo (ACR-nj)遺傳標記基因，通過籽粒顏色和植株顏色鑒定出單倍體，從而使雜交誘導(dǎo)單倍體進行單倍體育種成為了可能。但是在實踐應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)，Stocke的誘導(dǎo)率也很低(約為3% )，并且存在很多嚴重的缺陷，如雄花對溫度敏感，自交結(jié)實性差，穗粒腐病嚴重，Navajo遺傳標記較弱。因此，利用Stocke誘導(dǎo)單倍體的關(guān)鍵是要在保持其誘導(dǎo)能力的前提下克服上述缺點。國外在這方面起步較早，并已取得了較大進展，選育出了一些優(yōu)良的誘導(dǎo)系，如法國的WS14(LashermesP, Beckert M.Genetic control of maternal haploidy in maize (Zea mays L.) andselection of haploid inducing lines[J].Theor Appl Genet,1988,76 (3):405-410)、前蘇聯(lián)的KEMS (Shatskaya 0 A.et al,Mass induction of maternal haploids in corn [J].Maize Genet Coop Newslett, 1994,68:51),摩爾多瓦的 MHI (Chalyk S T.Creating newhap1id-1nducing lines of maize[J].Maize Genet Coop Newslett, 1999, 73:53-54),德國的 RWS(F.K.Rober et al., In vivo haploid induction in maize-Performance ofnew inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding[J].Maydica，2005，50:275-283)等等。這些新選的誘導(dǎo)系不但適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，而且其誘導(dǎo)率及遺傳標記也進一步提高，利用價值已經(jīng)大大超出了 Stock6。誘導(dǎo)系的選育是耗時費力的過程，一個誘導(dǎo)系的選育往往要花費7-10年時間。由于誘導(dǎo)系的選育需要每代單株測驗誘導(dǎo)率，選育規(guī)模越大所需的工作量越大。例如某世代測驗規(guī)模為400個株系，每個株系有10株，每株測驗3穗測驗種，就將測驗12000個果穗，僅田間種植就將需要5畝試驗地。收獲后，對得到的雜交果穗挑選單倍體，測定單株誘導(dǎo)率。單倍體的篩選在世界范圍內(nèi)均為手工操作，一個熟練工每日可完成30個果穗的單株誘導(dǎo)率測定工作，那么僅考種一項，就需要10個熟練工連續(xù)工作40天。如果縮小育種規(guī)模在常規(guī)選育條件下往往會丟失掉誘導(dǎo)性狀。由于誘導(dǎo)性狀選育的復(fù)雜性，很難在選擇誘導(dǎo)率的同時兼顧農(nóng)藝性狀等，造成誘導(dǎo)系本身適應(yīng)性差。我國各生態(tài)區(qū)域氣候條件復(fù)雜，現(xiàn)有的誘導(dǎo)系很難在全國各地廣泛使用，加之在不適合的氣候條件下，誘導(dǎo)系可能會不散粉、不結(jié)實等，造成巨大經(jīng)濟損失。因此有必要在不同生態(tài)區(qū)域選育適合當(dāng)?shù)貧夂驐l件的誘導(dǎo)系，有必要突破常規(guī)方法，降低單倍體誘導(dǎo)性狀的選育難度，提高誘導(dǎo)系選育效率，使得誘導(dǎo)系的選育過程中誘導(dǎo)率與農(nóng)藝性狀能夠被兼顧。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供第一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法。本發(fā)明所提供的種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法，包括如下步驟:檢測待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率，若所述待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率滿足如下條件1)、2)或3)，則確認所述待測玉米候選為玉米單倍體誘導(dǎo)系;1)為如下1、II和III所示:1、結(jié)實率為80%以下；11、胚乳敗育率為4%以上；II1、胚敗育率為3.5%以上；2)為如下1、II和III所示:1、結(jié)實率為70%以下；I1、胚乳敗育率為10%以上；II1、胚敗育率為3.5%以上；3)為如下1、II和III所示:1、結(jié)實率為70%以下；I1、胚乳敗育率為8%以上；II1、胚敗育率為1.5%以上。所述結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率為本領(lǐng)域常用的指標，均可用現(xiàn)有方法檢測。本發(fā)明的另一個目的是提供另一種輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法。本發(fā)明的提供的輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法，包括如下步驟:(1)雜交1:以已知單倍體誘導(dǎo)系為父本，以目標玉米自交系為母本，進行雜交，得到Fl代雜交玉米果穗；(目標玉米自交系一般指根據(jù)實際需要而選擇的具有目標性狀的玉米，如適合于在目的區(qū)域內(nèi)生長的玉米)(2)自交 1:將所述Fl代雜交玉米果穗中的雜交玉米籽粒進行播種，得到Fl代玉米植株；將Fl代植株進行自交，得到F2代果穗。(3)自交 2:種植F2代果穗，得到F2代植株；對F2代玉米植株進行自交，得到F3代自交玉米果穗；選取滿足如下條件的F3代自交玉米果穗，記作目的F3代自交玉米果穗；所述條件為1、II和III所示:1、結(jié)實率為80 %以下；I1、胚乳敗育率為4%以上；II1、胚敗育率為3.5%以上；種植所述目的F3代自交玉米果穗中的籽粒，得到F3代玉米植株，即得到玉米單倍體誘導(dǎo)系。上述另一種輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法中，所述步驟中，在所述步驟(3)之后，包括如下步驟(4):將所述目的F3代自交玉米果穗中的玉米籽粒均進行播種，得到F3代玉米植株；將F3代玉米植株進行自交，得到F4代自交玉米果穗；選取滿足如下條件的F4代自交玉米果穗，記作·目的F4代自交玉米果穗；所述條件為1、I1、III和IV所示:1、結(jié)實率為70 %以下；I1、胚乳敗育率為10%以上；II1、胚敗育率為3.5%以上；IV、來自于同一個F3代雜交玉米果穗的F4代自交玉米果穗的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率均一致。上述另一種輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法中，所述已知單倍體誘導(dǎo)系為玉米自交系CAU5 ；上述另一種輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法中，所述目標玉米自交系為玉米自交系N1680。上述第一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法在篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述第一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法在玉米育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明為培育玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法，是利用自交籽粒結(jié)實與敗育性狀篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系，可以不通過單株誘導(dǎo)率測驗，淘汰掉大量無誘導(dǎo)率或低誘導(dǎo)率單株，增大單倍體誘導(dǎo)系的選育效率，加速單倍體誘導(dǎo)系的選育過程。在與以往相同選育規(guī)模下，可以更加注重對農(nóng)藝性狀的篩選。本發(fā)明方法尤其適合于培育在目的區(qū)域環(huán)境內(nèi)能夠進行單倍體誘導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)系，即以適合于在目的區(qū)域內(nèi)生長的玉米為母本，用已知的單倍體誘導(dǎo)系作為父本，按照本發(fā)明方法進行操作，便可以得到既具有父本的單倍體誘導(dǎo)性狀又具有母本的適應(yīng)于目的區(qū)域環(huán)境的性狀的單倍體誘導(dǎo)系。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。1、高油單倍體誘導(dǎo)系CAUHO1:CAUH0I為高油單倍體誘導(dǎo)系(Liang Li, XiaoweiXu, Weiwei Jin, Shaojiang Chen.Morphological and molecular evidences for DNAintrogression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize.Planta，2009，230:367-376)，誘導(dǎo)率在2 %，具有R_nj標記，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。2、高頻單倍體誘導(dǎo)系CAU5、CAU079:單倍體誘導(dǎo)系CAU5、CAU079為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的二代單倍體誘導(dǎo)系，平均誘導(dǎo)率均達到10%以上，具有R-nj標記，在“陳紹江，黎亮，李浩川.玉米單倍體育種技術(shù)[M].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009.”一書中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
3、高頻單倍體誘導(dǎo)系UH400:UH400單倍體誘導(dǎo)率達到8%左右，在文獻“PriggeV, Sanchez C, Dhillon BS, Schipprackff, Araus JL, Banziger M, Melchinger AE.Doubledhaploids in tropical maize:1.Effects of inducers and source germplasm on invivo haploid induction rates.Crop Sci, 2011, 51:1_9 ”中公開過，由德國霍恩海姆大學(xué)選育，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。4、高油玉米自交·系N1680在文獻“陳紹江，姜海鷹，宋同明.玉米顯性高油基因存在的若干證據(jù)[J]，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，9 (6) 7-8”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。5、BY815，GY923，GY302, GY220為高油玉米自交系，在文獻“姜海鷹，陳紹江，高蘭鋒，邢吉敏，宋同明，戴景瑞.高油玉米自交系的雜種優(yōu)勢群劃分和優(yōu)勢模式分析[J]，作物學(xué)報，2005，31 (3):361-367"中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。6、Mol7、178、黃C、綜3、綜31、P138為常規(guī)自交系，在“曹廣才，徐雨昌.實用玉米自交系[M].氣象出版社，2000.” 一書中詳細介紹。公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。7、自交系 B73 為常規(guī)玉米自交系，在 “HallauerA R.Specialty Corns [M].CRCPress.2001” 一書中詳細介紹。公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。8、玉米自交系1145，在“陳紹江，宋同明.利用高油分的花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體[J]，作物學(xué)報，2003，29 (4):587-590”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。玉米雜交種鄭單958購自北京德農(nóng)種業(yè)有限公司。1、結(jié)實率定義為:(即雄穗花粉、雌穗花絲均處于正常活力狀態(tài)下)，雌穗上的結(jié)實數(shù)占總胚囊數(shù)的比率；檢測方法為自交果穗未脫粒之前，單穗統(tǒng)計自交果穗上的籽粒數(shù)與胚囊數(shù)；結(jié)實率=果穗中的籽粒數(shù)目/果穗中的胚囊數(shù)目；I1、胚乳敗育率定義為:胚乳敗育的籽粒數(shù)量占所有籽粒數(shù)量的比率；檢測方法為自交果穗未脫粒之前，單穗統(tǒng)計自交果穗上的胚乳敗育的籽粒數(shù)量與總籽粒數(shù)量；胚乳敗育率=果穗中胚乳敗育的籽粒數(shù)目/果穗中的籽粒總數(shù)目；胚乳敗育的籽粒的判定標準:胚胎在發(fā)育過程中，胚乳發(fā)育中途停止，而呈現(xiàn)出籽粒明顯較小，籽粒皺縮或空泡化的現(xiàn)象。II1、胚敗育率定義為:是指胚敗育的籽粒數(shù)量占所有籽粒數(shù)量的比率；檢測方法為自交果穗脫粒后，單穗統(tǒng)計自交果穗中胚敗育的籽粒數(shù)量與胚乳正常籽粒數(shù)量；胚敗育率=果穗中胚敗育的籽粒數(shù)目/果穗中的胚乳正常籽粒數(shù)目；胚敗育的籽粒的判定標準:胚敗育籽粒具有正常的胚乳外形，因此籽粒大小與正常籽粒無顯著差別，但其胚部凹陷，種皮與胚乳緊貼，無胚或胚發(fā)育不全。IV、單倍體誘導(dǎo)率定義為:是指果穗中單倍體籽粒數(shù)量占有R-nj標記籽粒數(shù)量的比率。其中胚乳呈紫顏色且胚無顏色的玉米籽粒為單倍體籽粒，胚乳呈紫顏色且胚呈紫顏色的玉米籽粒為雜交籽粒。實施例1、不同自交系中，單倍體誘導(dǎo)率與自交果穗的結(jié)實性、胚乳敗育性、胚敗育性顯著相關(guān)玉米自交系CAU5、CAUHO1、CAU079、UH400、N1680、B73，Mo 17，BY815，GY923，GY302，GY220, P138，綜 3，綜 31，178，黃 C，1145。其中 CAU5、CAUHO1、CAU079、UH400 為單倍體誘導(dǎo)系，其余均為常規(guī)自交系。
按照以上定義對上述17個材料的自交結(jié)實率、胚乳敗育率、胚敗育率、單倍體誘導(dǎo)率進行分析，其中4個誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)率按上述定義方法進行。對于剩余的13個常規(guī)自交系未統(tǒng)計單倍體誘導(dǎo)率。有研究表明玉米也是二倍體(2n = 20)，單倍體(2n =10)的自然發(fā)生頻率很低，只有 0.1 (Chase SS.Monoploid frequencies in commercialdouble cross hybrid maize and in its component single cross hybrids and inbredlines.Genetics，1949，34:328 332)，而上述的13個常規(guī)自交系都是生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的骨干自交系，未見任何報道指出這些自交系具有單倍體誘導(dǎo)能力，因此此處這13個常規(guī)自交系的單倍體誘導(dǎo)率被視為0，統(tǒng)計結(jié)果如下:表1、17個玉米自交系自交果穗性狀統(tǒng)計表
權(quán)利要求
1.一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法，包括如下步驟: 檢測待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率，若所述待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率滿足如下條件I)、2)或3)，則確認所述待測玉米候選為玉米單倍體誘導(dǎo)系； 1)為如下1、II和III所示: 1、結(jié)實率為80%以下； I1、胚乳敗育率為4%以上； II1、胚敗育率為3.5%以上； 2)為如下1、II和III所示: 1、結(jié)實率為70%以下； I1、胚乳敗育率為10%以上； II1、胚敗育率為3.5%以上； 3)為如下1、II和III所示:實率為70%以下； I1、胚乳敗育率為8%以上； II1、胚敗育率為1.5%以上。
2.一種輔助篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法，包括如下步驟: (1)雜交1:以已知單倍體誘導(dǎo)系為父本，以目標玉米自交系為母本，進行雜交，得到Fl代雜交玉米果穗； (2)自交I: 將所述Fl代雜交玉米果穗中的雜交玉米籽粒進行播種，得到Fl代玉米植株；將Fl代植株進行自交，得到F2代果穗； (3)自交2: 種植F2代果穗，得到F2代植株；對F2代玉米植株進行自交，得到F3代自交玉米果穗；選取滿足如下條件的F3代自交玉米果穗，記作目的F3代自交玉米果穗； 所述條件為1、II和III所示: 1、結(jié)實率為80%以下； I1、胚乳敗育率為4%以上； II1、胚敗育率為3.5%以上； 種植所述目的F3代自交玉米果穗中的籽粒，得到F3代玉米植株，即得到玉米單倍體誘導(dǎo)系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述步驟中，在所述步驟(3)之后，包括如下步驟⑷: 將所述目的F3代自交玉米果穗中的玉米籽粒均進行播種，得到F3代玉米植株； 將F3代玉米植株進行自交，得到F4代自交玉米果穗；選取滿足如下條件的F4代自交玉米果穗，記作目的F4代自交玉米果穗； 所述條件為1、I1、III和 IV所示: 。1、結(jié)實率為70%以下； I1、胚乳敗育率為10%以上； II1、胚敗育率為3.5%以上；IV、來自于同一個F3代雜交玉米果穗的F4代自交玉米果穗的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率均一致。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述已知單倍體誘導(dǎo)系為玉米自交系 CAU5 ； 所述目標玉米自交系為玉米自交系N1680。
5.權(quán)利要求1所述方法在篩選玉米單倍體誘導(dǎo)系中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述方法在玉米育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒別玉米單倍體誘導(dǎo)系的方法。本發(fā)明方法包括如下步驟檢測待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率，若所述待測玉米的結(jié)實率、胚乳敗育率和胚敗育率滿足如下條件1)、2)或3)，則確認所述待測玉米候選為玉米單倍體誘導(dǎo)系。本發(fā)明方法尤其適合于培育在目的區(qū)域環(huán)境內(nèi)能夠進行單倍體誘導(dǎo)的單倍體誘導(dǎo)系，即以適合于在目的區(qū)域內(nèi)生長的玉米為母本，用已知的單倍體誘導(dǎo)系作為父本，按照本發(fā)明方法進行操作，便可以得到既具有父本的單倍體誘導(dǎo)性狀又具有母本的適應(yīng)于目的區(qū)域環(huán)境的性狀的單倍體誘導(dǎo)系。
文檔編號A01H1/02GK103081802SQ20111033216
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者陳紹江, 徐小煒, 黎亮, 董昕 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)