專利名稱：用于對植物土傳病害生物防治的一種真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域，特別的，屬于對植物土傳病害生物防治的一種真菌。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對作物病害的防治主要集于化學(xué)農(nóng)藥的使用，然而化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境具有長期的破壞作用，降低作物的品質(zhì)，病原物的抗藥性以及對人畜有著直接或間接的危害等諸多問題。尋找更為安全、有效的病害防治方法具有重要的意義，利用生物的方法來防治植物病害可以克服上述問題。因而，植物病害的生物防治越來越受到廣大研究者的關(guān)注。國內(nèi)外對植物病害生物防治的研究很多]。然而，生物防治目前主要還是集中在菌株的篩選，生防機(jī)制的研究等實(shí)驗(yàn)室階段，僅有少量已經(jīng)被開發(fā)成商品的生防制劑。由于生防菌對環(huán)境適應(yīng)的局限性使得篩選出的生防菌在自然環(huán)境中很難正常的生長及繁殖。多數(shù)生防菌(如木霉)在使植物增強(qiáng)抗性和促進(jìn)植物生長的同時(shí)也能產(chǎn)生一些對植物本身產(chǎn)生毒害的物質(zhì)，從而對植物的生長產(chǎn)生抑制作用]。其次，生防菌對農(nóng)藥比較敏感]，在田間的農(nóng)藥殘留或后期農(nóng)藥的使用都能使得生防菌的防效降低甚至消失]。同時(shí)，生防菌的引入能夠?qū)е峦寥牢⑸锒鄻有越档偷葐栴}]。因此，篩選出能夠適應(yīng)多種生態(tài)環(huán)境的生防菌，以及開發(fā)和生產(chǎn)更為安全的生防菌制劑仍是植物病害生物防治研究的重要內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的研究小組意外發(fā)現(xiàn)從浙江寧波地區(qū)楊梅樹根圍土樣中分離獲得的ι株根圍真菌(MF-91菌株)初步盆栽試驗(yàn)表明其對水稻立枯絲核菌、油菜菌核病菌 {Sc Iero tinia sclero tiorum )、黃瓜灰霄病菌iBo trytis cinerea )禾口舌甘瓜蔓才古病菌 Widymella bryoniae)等多種土傳病害具有較好的防治效果。本發(fā)明提供一種用于對土傳病害具進(jìn)行生物防治的真菌，其特征在于，該真菌包括保藏號(hào)為5290的真菌。優(yōu)選的，這些土傳病害包括以下病害中的一種或幾種水稻立枯絲核菌、水稻禾S癌病菌(Magnaporthe《risea)、大麥赤霉病菌(Fusarium《raffliflear腫)、草莓炭疽病菌、Colletotrichum ^/oeo^orioiofes)、黃瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓割病菌 (fusarium腫)、舌甘瓜蔓枯病菌、英白古月麻斑病菌{Bipolaris zizaniae)
(.Alternaria sc^a/ /)及黃瓜才古妻病菌(/^Asaria oxysporum f. sp. cucumerinum) 0優(yōu)選的，這些土傳病害包括以下病害中的一種或幾種菌株對甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌。另一方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)保藏號(hào)為的真菌的方法，該方法包括在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲或孢子，pH為3. 0—12. 0 ；溫度為15— 40°C。優(yōu)選的，pH為5.0 —11.0。優(yōu)選的，溫度為30 — 。本發(fā)明的有益效果
經(jīng)形態(tài)、分子生物學(xué)及相關(guān)報(bào)道，初步鑒定MF-91菌株為伐從如組· mrmm。通過本研究表明，MF-91菌株對多種植物病原菌具有良好的抑制效果；在PDA培養(yǎng)基中生長情況最好，且菌絲呈現(xiàn)環(huán)狀的黃色狀；僅在PDA和燕麥片培養(yǎng)基中有孢子產(chǎn)生；對pH的適應(yīng)范圍較廣，偏堿性條件下有利于菌絲生長，而中性環(huán)境下適合孢子產(chǎn)生；對溫度的適應(yīng)較強(qiáng)，但是過低溫或過高溫能夠使該菌株停止生長和產(chǎn)孢。綜上可知，MF-91菌株對環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，使它能夠更好的在各種生態(tài)土壤中，尤其是偏堿性土壤中存活并繁殖，改善土壤酸堿性，這將大大提高其在田間的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為溫度對MF-91營養(yǎng)生長和孢子產(chǎn)量的影響(注圖中不同的字母表示數(shù)據(jù)通過Duncan’ s比較后，在Patl5水平上具顯著性差異)。圖2為MF-91對水稻立枯絲核菌的離體抑制效果。其中A為MF-91與水稻立枯絲核菌平板對峙效果，(a 試驗(yàn)組，b 空白對照);B、C為不同濃度的MF-91菌株代謝產(chǎn)物對水稻立枯絲核菌的抑制效果(注圖B中不同的小寫字母表示數(shù)據(jù)通過Duncan’ s比較后，在 P0.05水平上具顯著性差異，井R霉素濃度為300 μ g/m)。圖3為MF-91生長性狀，其中A、B 菌落生長初期(正、反面)；B 菌落生長后期； C:子囊孢子；D 子囊果；E:子囊.
圖4為MF-91菌株基于ITS序列的聚類圖。對于保藏真菌的生物學(xué)特性說明
該真菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)碼為CGMCC NO. 5290，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，拉丁學(xué)名 Chaetomium sp. 0
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但應(yīng)該理解本發(fā)明并不受這些內(nèi)容所限制。材料和方法 1. 1材料
1.1.1供試菌株
菌株MF-91為本實(shí)驗(yàn)室從楊梅樹根圍土樣中分離獲得。本研究所涉及的11種病原真菌均為本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存，分別為水稻立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、大麥赤霉病菌{Fusarium graminearum)、草莓炭疽病菌{ColIetotrichum gloeosporioides)、黃瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、舌甘瓜蔓害ι]病菌ifusarium oxysporum)、 甜瓜蔓枯病菌、茭白胡麻斑病菌iBipolaris zizaniae)、番茄早疫病菌U/ ternaria )及黃瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum) 0培養(yǎng)基
本文研究所用培養(yǎng)基主要包含以下種類馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PA)、查氏培養(yǎng)基(CA)、淀粉瓊脂培養(yǎng)基(SA)、酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YDA)、 燕麥片瓊脂培養(yǎng)基(OA)、MYRO培養(yǎng)基、Peberdy培養(yǎng)基以及液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDB)0培養(yǎng)基配方參考《現(xiàn)代植物病理學(xué)研究方法》[16]。
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以上培養(yǎng)基均121 °C高壓滅菌20min。生化試劑
限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，膠回收和質(zhì)?；厥赵噭┖芯徸?Axygene 公司，pGEM_T3 easy 載體購自 TransGen 公司。抑菌譜測定
在直徑為9cm培養(yǎng)皿中加入20ml PDA培養(yǎng)基，采用平板十字交叉對峙生長法[17]，即在 PDA平板中央接種病原菌，周圍4點(diǎn)接種MF-91菌株，于黑暗培養(yǎng)，設(shè)單獨(dú)接種病原菌為對照。觀察菌落生長情況，及時(shí)記錄病原菌菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù) 2次。通過以下公式計(jì)算抑菌率
抑菌率(％)=[(對照平板菌落半徑-對峙平板菌落半徑)/對照平板菌落半徑]X 100 %。不同環(huán)境對MF-91菌株?duì)I養(yǎng)生長和產(chǎn)孢量的影響 1. 3. 1培養(yǎng)基對MF-91菌株?duì)I養(yǎng)生長和產(chǎn)孢量的影響
選取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、MYRO培養(yǎng)基、Peberdy培養(yǎng)基和理查德培養(yǎng)基 9種不同的培養(yǎng)基對MF-91菌株培養(yǎng)并對其營養(yǎng)生長、菌落形態(tài)和產(chǎn)孢情況進(jìn)行觀察分析。 用直徑為5mm滅菌的打孔器打取活化6d的MF-91菌株邊緣菌苔，接入培養(yǎng)基中心位置，于黑暗培養(yǎng)9d后十字交叉測量菌落直徑，比較MF-91菌株在不同培養(yǎng)基中生長的差異。 28d后用IOml無菌水洗下孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)MF-91菌株在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢情況。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)2次。1. 3. 2初始pH值對MF-91菌株?duì)I養(yǎng)生長和產(chǎn)孢量的影響
用 NaOH 或 HCl 將 PDA 培養(yǎng)基調(diào)配初始 pH 值為 2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0、 10. 0,11. 0，12. 0。將活化的MF-91菌株用直徑5mm滅菌打孔器打取邊緣菌苔接入含20ml PDA培養(yǎng)基平板中央位置。并于恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，9d后測量MF-91菌株的菌落直徑；28d后用IOml無菌水洗下孢子，計(jì)算產(chǎn)孢量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)2次。溫度對MF-91菌株?duì)I養(yǎng)生長和產(chǎn)孢量的影響
經(jīng)活化的MF-91菌株用直徑5mm滅菌打孔器打取邊緣菌苔接入含20ml不同初始pH值的PDA和燕麥培養(yǎng)基平板中央位置，分別置于15、20、25、30、35和40°C的黑暗培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，9d后測量PDA培養(yǎng)基平板中MF-91菌株的菌落直徑，比較生長速度差異；28d后用 IOml無菌水洗下燕麥培養(yǎng)基中的孢子，比較產(chǎn)孢差異。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)2 次。菌株代謝產(chǎn)物對水稻立枯絲核菌的抑制作用
經(jīng)活化的MF-91菌株用直徑5mm滅菌打孔器打取邊緣菌苔3個(gè)接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于160rpm振蕩黑暗培養(yǎng)6d后收集代謝產(chǎn)物，冷凍離心機(jī)4°C，12000rpm離心30min，取上清用0. 45 μ m超濾膜過濾得無菌發(fā)酵液。將活化的水稻立枯絲核菌5mm菌餅接入至20ml含不同濃度代謝產(chǎn)物的PDA平板中央位置，其中MF-91菌株代謝產(chǎn)物含量分別為洲、4%、6%、8%和10%，以無菌水作為空白對照，300 μ g/ml井岡霉素為陽性對照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算相對抑制率。試驗(yàn)重復(fù)2次。相對抑制率(％)=[(空白對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/空白對照組菌落直徑]X100%1. 5菌種鑒定
1.5. 1 形態(tài)觀察
將MF-91菌株接種至PDA培養(yǎng)基中央位置，于培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。及時(shí)觀察記錄菌落生長形態(tài)和生長情況，并于28d后觀察孢子形態(tài)。菌株ITS序列測序與分析
提取MF-91菌株基因組DNA，方法參照Chi。采用通用引物ITSl (5 ‘ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ‘)和 ITS4 (5 ‘ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ‘)進(jìn)行 rDNA-ITS-PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95°C 2min ；94°C 15s，58°C 15s，72°C 45s，;35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ； 16°C Smin0 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切取目標(biāo)片段的凝膠， 用試劑盒進(jìn)行回收，具體步驟參照試劑盒說明。將回收的目標(biāo)片段與PGEM-T3 easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆提取質(zhì)粒[19]，酶切驗(yàn)證后測序(由上海生工生物工程有限公司完成)。所得序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對和分析。菌株β-tubulin序列測定與分析
采用真菌通用引物 Tl(5' -AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3 ‘)和 Τ224 (5 ‘ -GAGGGAACGACGGAGAAGGTGG-3 ‘)對 MF-91 基因組進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增?；蚪M DNA 提取、 PCR及TA克隆等方法同1.5.2。數(shù)據(jù)處理
研究中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行處理，多重比較采用LSD和Duncan方法。結(jié)果與分析
2.1抑菌譜測定
MF-91菌株抑菌譜測定結(jié)果表明，MF-91菌株對11種病原真菌均具有一定的抑效果，從表1可以看出MF-91菌株對甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌等土傳病原菌具有較好的抑制效果。表1 MF-91對主要病原真菌營養(yǎng)生長的抑制效果
權(quán)利要求
1.用于對植物土傳病害進(jìn)行生物防治的一種真菌，其特征在于，該真菌包括保藏號(hào)為 5290的真菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌，其特征在于，所述的土傳病害包括以下病害中的一種或幾種水稻立枯絲核菌、水稻稻瘟病菌、大麥赤霉病菌、草莓炭疽病菌、黃瓜灰霉病菌、油菜菌核病菌、甜瓜蔓割病菌、甜瓜蔓枯病菌、茭白胡麻斑病菌、番茄早疫病菌及黃瓜枯萎病菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真菌，其特征在于，所述的土傳病害包括以下病害中的一種或幾種菌株對甜瓜蔓枯病菌、油菜菌核病菌、草莓灰霉病菌和番茄早疫病菌。
4.一種培養(yǎng)保藏號(hào)為5290的真菌的方法，其特征在于，該方法包括在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌絲或孢子，pH為3. 0—12. 0 ；溫度為15 — 40°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，pH為5.0-11. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，溫度為30—35°C。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于對植物土傳病害進(jìn)行生物防治的真菌，其特征在于，該真菌包括保藏號(hào)為5290的真菌。該真菌對多種植物病原菌具有良好的抑制效果，可以作為生物農(nóng)藥進(jìn)行開發(fā)利用。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102409001SQ20111033927
公開日2012年4月11日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉詩胤, 姜華, 孫國昌, 張震, 杜新法, 柴榮耀, 毛雪琴, 王教瑜, 王艷麗, 邱海萍 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院