專利名稱：采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種水培種植技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法。
背景技術(shù)：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素 (artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法 (ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能?？梢娗噍锼厥且环N極具潛力的天然藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0. 01%-1%)，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多數(shù)研究者在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養(yǎng)及細胞工程生產(chǎn)青蒿素的可行性也不高。
隨著青蒿素生物合成途徑研究的逐漸深入以及植物次生代謝工程的不斷發(fā)展， 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿中青蒿素的含量是一種頗具前景的方法。2009年，本實驗室 Siang等同學(xué)在《Biotechnol. Appl. Biochem.》(《生物技術(shù)和應(yīng)用生物化學(xué)》)發(fā)表了題為"Development of transgenic Artemisia annua(Chinese wormwood)plants with an enhanced content of artemisinin,an effective anti-malarial drug,by hairpin-RNA mediated gene silencing^ “構(gòu)建RNAi載體并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使抗瘧疾藥物青蒿素在轉(zhuǎn)基因青蒿中的含量得到提高。”)的論文，報道了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可明顯提高青蒿中有效成分青蒿素含量這一實驗結(jié)果。目前，本實驗室已得到多個不同品系且青蒿素含量較高的轉(zhuǎn)基因青蒿。然而，轉(zhuǎn)基因青蒿一般為雜合體，不具備遺傳穩(wěn)定性，后代中基因發(fā)生分離，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。從轉(zhuǎn)基因青蒿培育純系品種需要很長的時間，而且耗費大量的人力物力，這使得轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣受到了一定的限制。
現(xiàn)有資料中目前已有通過微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿植株的方法。然而， 微不定芽技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿植株需要經(jīng)轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的脫毒，轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因青蒿微不定芽的伸長，轉(zhuǎn)基因青蒿不定芽的生根以及轉(zhuǎn)基因青蒿再生植株的移栽等多個步驟，過程較為復(fù)雜，其中多步需要無菌操作，稍有不慎就易引起青蒿外植體污染，致使擴繁失敗。且在轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的脫毒過程中需要使用升汞等劇毒試劑， 容易對操作人員身體造成損害，對周圍環(huán)境造成污染。
通過水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿，為保持轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。且可以克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因青蒿水培擴繁技術(shù)中種種弊端，省時，低耗，是一種極具應(yīng)用前景的生物技術(shù)。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題所提及的采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的相關(guān)報道。 發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，通過水培培養(yǎng)液的配方和水培快速擴繁的方法，建立了用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，能夠在短時間內(nèi)繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，并且保持轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對于轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明通過將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體置于水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液中避光培養(yǎng)得到不定根后移栽到移栽基質(zhì)中，通過馴化獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
所述的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體是指含青蒿內(nèi)源基因的植物雙元表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar 1)，在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，再經(jīng)過外植體的預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)， 抗性再生植株的篩選和轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測后所得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。
所述的水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組分為lg/L全水溶性肥料(花無缺，20-20-20+TE，通用肥)以及10mg/L吲哚乙酸(IAA)，余量為水。
所述的避光培養(yǎng)是指將幼嫩的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體枝條轉(zhuǎn)移到水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，在25士3°C環(huán)境下避光培養(yǎng)14天生根，即不定根。
所述的移栽是指選取生長健壯的植株，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤或花盆里。
所述的移栽基質(zhì)為體積比為1 1的珍珠巖泥炭的混合物。
本發(fā)明采用水培的方法，可快速繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，并且保持轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對于轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗，及提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。同時，本方法可得到大量的、易取材的轉(zhuǎn)基因青蒿根尖，為轉(zhuǎn)基因青蒿染色體的制備及采用熒光原位雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)基因青蒿植株進行染色體定位打下了堅實的基礎(chǔ)。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
含青蒿內(nèi)源基因的植物雙元表達載體的構(gòu)建
1.中間載體 pCAMBIA2300: :p!35S-gus-nos 的構(gòu)建
選用pBI121和pCAMBIA2300為基本元件，構(gòu)建雙元植物表達載體 PCAMBIA2300: :p!35S-gus-nos。具體地，HindIII 和 EcoRI 雙酶切 pBI121 和 pCAMBIA2300 質(zhì)粒；回收pBI121的gus表達盒和pCAMBIA2300大片段；連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化篩選，抽質(zhì)粒酶切驗證。
2.植物表達載體pCAMBIA2300: :p35S_青蒿內(nèi)源基因_nos的構(gòu)建
以所述的pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos為表達載體，用青蒿內(nèi)源基因替換其上的gus基因。具體地，BamHI/SacI雙酶切pGEMT-easy+青蒿內(nèi)源基因和 PCAMBIA2300: :p35S-gus-nos,回收青蒿內(nèi)源基因和 pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos 大片段， 連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗證。
本實施例將青蒿內(nèi)源基因可操作性地連接于表達調(diào)控序列，形成含青蒿內(nèi)源基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過代謝工程策略來提高青蒿中青蒿素的含量。
實施例2
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)青蒿內(nèi)源基因遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株
1.含青蒿內(nèi)源基因雙元植物表達載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得
將實施例1中含青蒿內(nèi)源基因的植物雙元表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105， 為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar 1)， 并進行PCR驗證。結(jié)果表明，含青蒿內(nèi)源基因植物雙元表達載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。
2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)青蒿內(nèi)源基因轉(zhuǎn)化青蒿
2. 1.外植體的預(yù)培養(yǎng)
青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20% NattO浸泡20min，無菌水沖洗3_4次， 用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。
2. 2.農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS+AS 100ymol/L)中，滴加含活化好的所述含青蒿內(nèi)源基因植物雙元表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。
2. 3.抗性再生植株的篩選
將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0. 5mg/ L+NAA0. 05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h 光照培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
3.轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測
根據(jù)目的基因所在表達盒p35s_青蒿內(nèi)源基因-nos序列和青蒿內(nèi)源基因分別設(shè)計正向引物設(shè)計和反向引物對目的基因進行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計的PCR特異引物，能擴增出特異的DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。
本實施例將所述的植物表達載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含青蒿內(nèi)源基因植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng) PCR檢測的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。轉(zhuǎn)基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
實施例3
利用HPLC-ELSD測定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量
1. HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標準溶液的配制
HPLC 采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (SymmetryShieldTM C18, 5 μ m, 250 X 4. 6mm, Waters)，流動相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫300C，流速1. OmL/min,進樣量10 μ L，靈敏度(AUFS =1.0)，理論塔板數(shù)按青蒿素峰計算不低于2000。
ELSD 采用water alliance M20系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)(gain)為7，載氣壓力^ar ；
精密稱取青蒿素標準品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素標準品溶液，保存于_20°C備用。
本發(fā)明中流動相為甲醇(methanol)水，比例為70% 30%時，青蒿素的保留時間為5. lmin，峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。
2.標準曲線的制作
將所述對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進樣2 μ 1，4 μ 1，6 μ 1，8 μ 1，10 μ 1記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，μ g)進行回歸分析。通過研究，本發(fā)明中青蒿素在4-20 μ g范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性關(guān)系。青蒿素對照品的log-log 線性回歸方程為:Y = 1. 28e+000X+4. 71e+000, R = 0. 979546。
3.樣品的制備和青蒿素含量的測定
在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鮮的青蒿葉片，于45°C烘箱中烘至恒重。然后從烘干的枝條上敲下葉和花蕾，磨成粉末。稱取約0. Ig干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超聲波處理30min，5000rpm離心lOmin，取上清用0. 22 μ m濾膜過濾，即可用于HPLC-ELSD測定青蒿素的含量。
采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 μ 1，根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。
實施例4
1)轉(zhuǎn)基因青蒿外植體的取材和水培的誘導(dǎo)
從轉(zhuǎn)基因青蒿植株上剪取含有生長點的幼嫩莖段作為外植體。將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體轉(zhuǎn)移到水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液，所述的水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液為lg/L全水溶性肥料(花無缺， 20-20-20+TE，通用肥)+10mg/L吲哚乙酸(IAA)。培養(yǎng)溫度為25 士3°C，避光培養(yǎng)14天后在外植體周圍長出不定根。長度為l-2cm。水培誘導(dǎo)率達到80%以上。
2)轉(zhuǎn)基因青蒿再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養(yǎng)液，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤里，所述的移栽基質(zhì)中的成分珍珠巖和泥炭配方比例為1 1。通過馴化1周，可獲得大量生長正常的轉(zhuǎn)基因青蒿植株，移栽存活率為100%。
通過研究，在本發(fā)明中提供了一種采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，為快速繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，并且保持轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對于轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。同時，本方法可得到大量的、易取材的轉(zhuǎn)基因青蒿根尖，為轉(zhuǎn)基因青蒿染色體的制備及采用熒光原位雜交技術(shù)對轉(zhuǎn)基因青蒿植株進行染色體定位打下了堅實的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，其特征在于，通過將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體置于水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液中避光培養(yǎng)得到不定根后移栽到移栽基質(zhì)中，通過馴化獲得大量轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體是指含青蒿內(nèi)源基因的植物雙元表達載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)下，再經(jīng)過外植體的預(yù)培養(yǎng)， 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)，抗性再生植株的篩選和轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測后所得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的根癌農(nóng)桿菌為EHA105型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組分為lg/L全水溶性肥料以及10mg/L吲哚乙酸，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的避光培養(yǎng)是指將幼嫩的轉(zhuǎn)基因青蒿外植體枝條轉(zhuǎn)移到水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，在25士3°C環(huán)境下避光培養(yǎng)14天生根，即不定根。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的移栽是指選取生長健壯的植株，移栽到裝有移栽基質(zhì)的穴盤或花盆里。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的移栽基質(zhì)為體積比為1 1的珍珠巖泥炭的混合物。
全文摘要
一種水培種植技術(shù)領(lǐng)域的采用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，通過將轉(zhuǎn)基因青蒿外植體置于水培誘導(dǎo)培養(yǎng)液中避光培養(yǎng)得到不定根后移栽到移栽基質(zhì)中，通過馴化獲得大量轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明建立了用水培技術(shù)快速繁殖轉(zhuǎn)基因青蒿的方法，能夠在短時間內(nèi)繁殖出大量的轉(zhuǎn)基因青蒿苗，并且保持轉(zhuǎn)基因青蒿的遺傳穩(wěn)定性，對于轉(zhuǎn)基因青蒿的大面積推廣、保障充足優(yōu)質(zhì)的青蒿種苗、提高青蒿素的產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號A01G31/00GK102499037SQ20111034042
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者吳韶龑, 唐克軒, 張凌, 張芳源, 江偉民, 沈乾, 陸續(xù) 申請人:上海交通大學(xué)