專利名稱：膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立大鼠慢性腎盂腎炎模型的方法，用于模擬、研究和防止人類的慢性腎盂腎炎等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
泌尿道感染時臨床常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率根據(jù)我國普查統(tǒng)計，占到人口 0.91%，在婦女、兒童和老年人、HIV感染者、糖尿病及腫瘤等患者中均有很高的發(fā)病率。盡管當(dāng)今抗病藥物研究迅速發(fā)展，品種不斷更新?lián)Q代，泌尿道感染的發(fā)病率仍居高不下，且不斷面臨新的挑戰(zhàn)，抗病毒的濫用、免疫抑制劑的應(yīng)用等導(dǎo)致一些原來非致病病毒引起的感染不斷增加。泌尿道感染按照解剖部位的不同，分為尿道炎、膀胱炎和腎盂腎炎。反復(fù)不斷感染，病情遷延，可發(fā)展為慢性腎盂腎炎，是一種較嚴重的形式，出尿道刺激癥狀外，還出現(xiàn)全身癥狀，而且常常由于用藥不規(guī)則，細菌極易產(chǎn)生多重耐藥性，晚期出現(xiàn)腎功能不全，可危及患者生命。據(jù)歐洲透析中心統(tǒng)計資料表明，慢性腎盂腎炎占整個慢性尿毒癥的 19. 8% 21. 2%，制作與人類泌尿道感染相似的動物模型，對探討慢性腎盂腎炎的發(fā)病機制和研究的治療方法十分必要，國外研究證實，有很多方法能夠造成慢性甚于腎炎動物模型，但是有些方法周期長，或者為豬、兔比較昂貴。目前，用大鼠為模型，制造慢性甚于腎炎的報道有，王俊生等(大鼠慢性甚于腎炎模型的建立及L-型菌的分離鑒定[J].中華腎臟病雜質(zhì)，1990，6 17)在國內(nèi)首先利用尿道直接接種細菌的方法，報道了 CPN大鼠模型，該方法并不能誘導(dǎo)腎臟外觀出現(xiàn)癲痕和固縮， 嚴格講并不成功。龔學(xué)忠等(慢性腎盂腎炎模型的建立[J]. 2004,26(4)391-393)按照Bitz 等的方法，延長觀察時間創(chuàng)建一種慢性腎盂腎炎大鼠模型，用不同濃度的致病性大腸桿菌株膀胱內(nèi)注射，并短暫結(jié)扎左側(cè)輸尿管，觀察90天內(nèi)腎臟形態(tài)學(xué)動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著感染性炎癥的修復(fù)，左腎外觀有皮質(zhì)癲痕及相關(guān)腎乳頭收縮和腎盞的擴張，鏡下慢性腎間質(zhì)性腎炎改變和纖維化；細胞培養(yǎng)陽性結(jié)果主要在左腎和尿。因此，這些模型都不夠成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種大鼠慢性腎盂腎炎模型，該模型的構(gòu)建方法是通過給大鼠的膀胱灌注大腸埃希氏菌。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內(nèi)置入鋼絲，形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導(dǎo)尿管于膀胱內(nèi)3cm， 取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入大腸埃希氏菌懸液，然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。所述大腸埃希氏菌懸液的濃度為108-109CFU/100ul，每次注入量為 0.093-0. lml/100g。
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所述大腸埃希氏菌溶液的由以下方法制備所得在無菌條件下，從-70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有LB培養(yǎng)基的無菌離心試管中，置于37cc 恒溫搖床，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分，IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 IO9CFU/IOOul 濃度。
所述大鼠是正常清潔級SD雌性大鼠。
在本發(fā)明的一具體實施例中，給大鼠連續(xù)6周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次。
在本發(fā)明的一具體實施例中，用腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量為 0.7ml/100g。
本發(fā)明通過給膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建的慢性腎盂腎炎大鼠模型，腎臟組織HE 染色后，其腎間質(zhì)可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤，伴毛細血管充血擴張水腫。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明。
實施例1
1、實驗動物
13月齡正常清潔級SD雌性大鼠20只，體重為200g_215g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院清潔級動物實驗中心常溫飼養(yǎng)，預(yù)養(yǎng)7天。
2、實驗試劑
大腸埃希氏菌0111B4(ATCC四522，中國藥品生物制品檢定所，批號44155)。
3、實驗分組
13月齡SD雌性SD大鼠，隨機分為2組，①對照組，η = 10只；②模型組，η = 10 只，各組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。
4、模型方法
4. 1膀胱內(nèi)灌注大腸埃希氏菌方法
(1)大腸埃希氏菌溶液的制備在無菌條件下，從_70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有5ml LB培養(yǎng)基的無菌離心試管中，置于37cc恒溫搖床，轉(zhuǎn)速 150轉(zhuǎn)/分。IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 109CFU/100ul 濃度。
(2)膀胱內(nèi)灌注細菌懸液予SD大鼠每周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次，連續(xù) 6周。予5%水合氯醛(0.7ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉10只大鼠，新潔爾滅酊消毒大鼠尿道口，取24G靜脈留置針，內(nèi)置入鋼絲，形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口， 成功置入導(dǎo)尿管于膀胱內(nèi)3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入0. 2ml 108-109CFU/100ul大腸埃希氏菌懸液，然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。
4. 2標本獲取
灌注大腸埃希氏菌共計6周后，每只雌性SD大鼠腹腔內(nèi)注射0. 7ml/100g 5%水合氯醛，將之置于解剖臺上，新潔爾滅酊消毒腹部，用手術(shù)剪逐層打開腹腔，游離腎臟，將腎臟置入10%福爾馬林溶液中。最后大鼠被引頸椎處死。
4. 3腎臟組織HE染色腎臟用10%福爾馬林固定Mh，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，超薄切片，常規(guī)脫蠟，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，伊紅復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。光鏡下觀察腎臟病理變化。5、實驗結(jié)果光鏡下觀察大鼠腎臟病理切片HE染色情況(見表1)，對照組正常，無炎癥細胞浸潤。而模型組大鼠的腎間質(zhì)可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤， 伴毛細血管充血擴張水腫。表1:腎臟HE染色表現(xiàn)
分組_η_炎癥情況_對照組10-
模型組_10_++ ~ +++_注-陰性。+腎間質(zhì)少量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管輕度充血水腫。++腎間質(zhì)中量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管充血水腫。+++腎間質(zhì)大量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管重度充血水腫。
權(quán)利要求
1.一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內(nèi)置入鋼絲， 形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導(dǎo)尿管于膀胱內(nèi)3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入大腸埃希氏菌懸液，然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌懸液的濃度為108-109CFU/100ul，每次注入量為 0.093-0. lml/100g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，用腹腔內(nèi)注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量為0. 7ml/100g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，給大鼠連續(xù)6周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大腸埃希氏菌溶液的由以下方法制備所得在無菌條件下，從-70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有LB培養(yǎng)基的無菌離心試管中，置于37cc 恒溫搖床，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分，IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 IO9CFU/IOOul 濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大鼠是正常清潔級SD雌性大鼠。
全文摘要
一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構(gòu)建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，包括以下步驟連續(xù)6周，一周2次，將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內(nèi)置入鋼絲，形成15°-30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導(dǎo)尿管于膀胱內(nèi)3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用1ml OT針筒注入濃度為108～109CFU/100ul的大腸埃希氏菌懸液，然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒；本方法建構(gòu)的慢性腎盂腎炎大鼠模型，其腎臟病理切片HE染色后，腎間質(zhì)可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤，伴毛細血管充血擴張水腫。
文檔編號A61D7/00GK102499786SQ20111036168
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者王怡, 陳敏, 顧向晨 申請人:王怡