專利名稱：一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
楊樹是我國重要的造林綠化及工業(yè)用材樹種。特別是在我國北方的生態(tài)建設(shè)和商品林建設(shè)中占有不可替代的地位。楊樹常規(guī)育種周期長，見效慢，而且可操作性差。應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行楊樹育種提高了育種的目的性和可操作性，為楊樹育種開辟了一條誘人的新途徑。但不同基因型楊樹再生效率及轉(zhuǎn)化效率存在顯著差異，所以針對不同基因型楊樹探索其最佳的轉(zhuǎn)基因體系是非常必要的。小黑楊是我國北方主要的綠化和造林樹種，目前已獲得了抗蟲、抗鹽、抗真菌等轉(zhuǎn)基因小黑楊，但轉(zhuǎn)化效率非常低，最多只獲得了 13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(轉(zhuǎn)化率為4%)。旺盛分裂的細(xì)胞是農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。外植體在含有外源激素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)細(xì)胞分裂高峰期的出現(xiàn)，利于傷口的酚類物質(zhì)釋放與積累，T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到植物細(xì)胞基因組中。以往的小黑楊轉(zhuǎn)基因效率低的一個(gè)原因是侵染后直接產(chǎn)生不定芽，傷口愈合過快，不利于T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，致使農(nóng)桿菌感染后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量少，轉(zhuǎn)化效率也降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因效率低的問題，提供一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，按以下步驟進(jìn)行一、取抽莖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的高度為1 2cm的無根苗，移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待苗長到5 8cm時(shí)，取苗上2 3cm的頂端移入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行二次生根，選取苗高4 5cm的二次生根后的植株作為外植體；二、取步驟一的外植體上長度為1 3cm的新生的葉片，在葉片基部和葉片中間各切一刀，棄掉葉尖兒部位，接種于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2 3d ；三、挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 Mh， 培養(yǎng)溫度為^°C，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，得菌液，向菌液中加入含有50mg/L卡那霉素的LB 培養(yǎng)基使菌液稀釋100倍，然后在^°C、220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到0. 4 0. 6，然后用無菌水將OD值為0. 4 0. 6的菌液稀釋到OD值為0. 1 0. 2 ；將步驟二中預(yù)培養(yǎng)后的葉片放入OD值為0. 1 0. 2的菌液中浸泡5 lOmin，然后取出葉片用無菌濾紙吸去多余菌液；四、然后將葉片接種在分化培養(yǎng)基上，在25°C暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1 2d ；五、 取出葉片，放在無菌吸水紙上將水分吸干，然后將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 10d，產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 20d后產(chǎn)生抗性芽，即完成小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法；其中步驟一所述抽莖培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 2mg/L 6-BA的MH培養(yǎng)基；步驟一所述生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/LIBA的MH培養(yǎng)基；步驟二和步驟四所述的分化培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 5mg/L6-BA的MS培養(yǎng)基；步驟五所述的選擇培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA,0. 5mg/L 6_BA、40mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基?，F(xiàn)有的小黑楊轉(zhuǎn)基因體系是從傷口處直接誘導(dǎo)抗性芽，轉(zhuǎn)化效率低。本發(fā)明是侵染后先通過誘導(dǎo)愈傷組織，然后再誘導(dǎo)抗性芽，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明方法操作簡單，易于掌握，可有效的提高小黑楊花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化效率，用攜帶毛果楊A(yù)P2基因的農(nóng)桿菌侵染能夠獲得約70個(gè)抗性芽，用攜帶檉柳bZIP基因的農(nóng)桿菌侵染能夠獲得約100個(gè)抗性芽。本方法特別適用于小黑楊花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化。


圖1為具體實(shí)施方式
十一步驟五中形成的愈傷組織照片；圖2為具體實(shí)施方式
十一將愈傷組織放入新的選擇培養(yǎng)基中的照片；圖3為具體實(shí)施方式
十一形成的抗性芽照片。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，按以下步驟進(jìn)行一、 取抽莖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的高度為1 2cm的無根苗，移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待苗長到 5 8cm時(shí)，取苗上2 3cm的頂端移入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行二次生根，選取苗高4 5cm的二次生根后的植株作為外植體；二、取步驟一的外植體上長度為1 3cm的新生的葉片，在葉片基部和葉片中間各切一刀，棄掉葉尖兒部位，接種于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2 3d ； 三、挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 Mh，培養(yǎng)溫度為，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，得菌液，向菌液中加入含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基使菌液稀釋100倍，然后在、220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到0. 4 0. 6，然后用無菌水將OD值為0. 4 0. 6的菌液稀釋到OD值為 0. 1 0.2 ；將步驟二中預(yù)培養(yǎng)后的葉片放入OD值為0. 1 0.2的菌液中浸泡5 lOmin，然后取出葉片用無菌濾紙吸去多余菌液；四、然后將葉片接種在分化培養(yǎng)基上，在25°C暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1 2d ；五、取出葉片，放在無菌吸水紙上將水分吸干，然后將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 10d，產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 20d后產(chǎn)生抗性芽，即完成小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法；其中步驟一所述抽莖培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 2mg/L 6-BA的MH培養(yǎng)基；步驟一所述生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/L IBA 的MH培養(yǎng)基；步驟二和步驟四所述的分化培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 5mg/L 6-BA的 MS培養(yǎng)基；步驟五所述的選擇培養(yǎng)基為含有0. lmg/LNAA、0. 5mg/L 6_BA、40mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基。步驟三中攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105的制備方法是通過三親交配法將攜帶有外源基因毛果楊A(yù)P2基因或檉柳bZIP基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。農(nóng)桿菌EHA105為購買得到。NAA為萘乙酸；6-BA為6_芐基腺嘌呤；IBA為吲哚丁酸。現(xiàn)有的小黑楊轉(zhuǎn)基因體系是從傷口處直接誘導(dǎo)抗性芽，轉(zhuǎn)化效率低。本實(shí)施方式是侵染后先通過誘導(dǎo)愈傷組織，然后再誘導(dǎo)抗性芽，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。本實(shí)施方式方法操作簡單，易于掌握，可有效的提高小黑楊花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化效率，用攜帶毛果楊A(yù)P2基因的農(nóng)桿菌侵染能夠獲得約70個(gè)抗性芽，用攜帶檉柳bZIP基因的農(nóng)桿菌侵染能夠獲得約 100個(gè)抗性芽。本方法特別適用于小黑楊花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中取步驟一的外植體上長度為2cm的新生的葉片。其它與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟三所述攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105中的外源基因?yàn)槊麠預(yù)P2基因或檉柳bZIP基因。其它與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至三之一不同的是挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 18 22h。其它與具體實(shí)施方式
一至三之一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至四之一不同的是步驟三中在 ^°C、220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到0.5。其它與具體實(shí)施方式
一至四之一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至五之一不同的是步驟三中浸泡8min。其它與具體實(shí)施方式
一至五之一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟五中將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 9d。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至六之一不同的是步驟五中將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 8d。其它與具體實(shí)施方式
一至六之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟五中將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 19d后產(chǎn)生抗性芽。其它與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一至八之一不同的是步驟五中將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)17 18d后產(chǎn)生抗性芽。其它與具體實(shí)施方式
一至八之一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，按以下步驟進(jìn)行 一、取抽莖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的高度為2cm的無根苗，移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待苗長到 6cm時(shí)，取苗上2cm的頂端移入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行二次生根，選取苗高km的二次生根后的植株作為外植體；二、取步驟一的外植體上長度為2cm的新生的葉片，在葉片基部和葉片中間各切一刀，棄掉葉尖兒部位，接種于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3d;三、挑取攜帶檉柳bZIP 基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 20h，培養(yǎng)溫度為^°C，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，得菌液，向菌液中加入含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基使菌液稀釋100倍，然后在^°C、220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到 0. 4 0. 6，然后用無菌水將OD值為0. 5的菌液稀釋到OD值為0. 2 ；將步驟二中預(yù)培養(yǎng)后的葉片放入OD值為0. 2的菌液中浸泡5min，然后取出葉片用無菌濾紙吸去多余菌液；四、然后將葉片接種在分化培養(yǎng)基上，在25°C暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)Id ；五、取出葉片，放在無菌吸水紙上將水分吸干，然后將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15d后產(chǎn)生抗性芽，即完成小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法；其中步驟一所述抽莖培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 2mg/L 6-BA的MH培養(yǎng)基；步驟一所述生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/L IBA的MH培養(yǎng)基；步驟二和步驟四所述的分化培養(yǎng)基為含有0. Img/ L NAA和0. 5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基；步驟五所述的選擇培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA,0. 5mg/ L 6-BA、40mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基。步驟三中攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105的制備方法是通過三親交配法將攜帶有外源基因檉柳bZIP基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。農(nóng)桿菌EHA105為購買得到。本實(shí)施方式最終獲得60個(gè)抗性芽。本實(shí)施方式步驟五中形成的愈傷組織如圖1所示，將愈傷組織放入新的選擇培養(yǎng)基中的照片如圖2所示，形成的抗性芽如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，按以下步驟進(jìn)行一、取抽莖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的高度為1 2cm的無根苗，移入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，待苗長到5 8cm時(shí)，取苗上2 3cm的頂端移入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行二次生根，選取苗高4 5cm的二次生根后的植株作為外植體；二、取步驟一的外植體上長度為1 3cm的新生的葉片，在葉片基部和葉片中間各切一刀，棄掉葉尖兒部位，接種于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)2 3d ；三、挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 Mh，培養(yǎng)溫度為，搖床轉(zhuǎn)速為220r/min，得菌液，向菌液中加入含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基使菌液稀釋100倍，然后在^°C、220r/min 轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到0. 4 0. 6，然后用無菌水將OD值為0. 4 0. 6的菌液稀釋到OD值為0. 1 0. 2 ；將步驟二中預(yù)培養(yǎng)后的葉片放入OD值為0. 1 0. 2的菌液中浸泡5 lOmin，然后取出葉片用無菌濾紙吸去多余菌液；四、然后將葉片接種在分化培養(yǎng)基上，在25°C暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1 2d ；五、取出葉片，放在無菌吸水紙上將水分吸干，然后將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 10d，產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 20d后產(chǎn)生抗性芽，即完成小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法；其中步驟一所述抽莖培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA和0. 2mg/L 6-BA的MH培養(yǎng)基；步驟一所述生根培養(yǎng)基為含有0. 2mg/L IBA的MH培養(yǎng)基；步驟二和步驟四所述的分化培養(yǎng)基為含有0. lmg/LNAA和 0. 5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基；步驟五所述的選擇培養(yǎng)基為含有0. lmg/L NAA,0. 5mg/L 6-BA, 40mg/L卡那霉素和300mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟二中取步驟一的外植體上長度為2cm的新生的葉片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟三所述攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105中的外源基因?yàn)槊麠預(yù)P2基因或檉柳bZIP基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 18 22h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟三中在 28°C>220r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD值達(dá)到0. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟三中浸泡 8min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟五中將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 9d。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟五中將葉片移至選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 8d。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟五中將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 19d后產(chǎn)生抗性芽。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于步驟五中將愈傷組織切下放入新的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)17 18d后產(chǎn)生抗性芽。
全文摘要
一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法，涉及一種小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因方法。是要解決現(xiàn)有小黑楊花粉植株轉(zhuǎn)基因效率低的問題。方法取抽莖培養(yǎng)基中的無根苗，移入生根培養(yǎng)基，植株作為外植體；取外植體上葉片，在基部和中間各切一刀，棄掉葉尖兒部位，接種于分化培養(yǎng)基上；挑取攜帶外源基因的農(nóng)桿菌EHA105接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)得菌液，菌液用無菌水稀釋；將預(yù)培養(yǎng)后的葉片放入菌液中浸泡，取出葉片吸去多余菌液；將葉片接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)；取出葉片將水分吸干，將葉片移至選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，將愈傷組織放入選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生抗性芽，即完成。本方法獲得的抗性芽多，轉(zhuǎn)基因效率高。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102392046SQ20111038517
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者劉桂豐, 劉玲, 姜靜, 李園園, 李慧玉 申請人:東北林業(yè)大學(xué)