專利名稱：用于鑒定或輔助鑒定小麥新疆拉面品質(zhì)性狀基因的pcr體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質(zhì)性狀基因的PCR體系及其應(yīng)用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測新疆冬小麥的拉面色澤性狀相關(guān)基因和面筋品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
面條是我國北方居民的傳統(tǒng)食品，是人們?nèi)粘Ｖ魇持?。?000多年的發(fā)展過程中，面條在不同地域形成了其特色形式。在新疆地區(qū)，拉面是當(dāng)?shù)厝粘Ｖ魇持唬钍苋藗兿矏?。作為鮮濕白鹽面條，新疆拉面以其制作、食用方便，口感彈韌、光滑，拌菜豐富、美味等諸多優(yōu)點(diǎn)，已逐漸走出新疆地區(qū)，被全國各地的人們所接受和喜愛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆地區(qū)小麥面粉年產(chǎn)量的80%用于制作拉面。但是，與新疆拉面在人們?nèi)粘ｏ嬍持腥找嬷匾牡匚幌啾龋陆嫫焚|(zhì)的評(píng)價(jià)仍以傳統(tǒng)儀器分析和成品感官評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法為主，直接限制了其發(fā)展。因此，創(chuàng)建微量、快速的優(yōu)質(zhì)拉面評(píng)選方法，對(duì)于拉面專用品種的栽培、選育和優(yōu)質(zhì)拉面的加工、評(píng)價(jià)具有重要意義。近年來，隨著生活水平的提高，人們對(duì)新疆拉面品質(zhì)的要求越來越高，品質(zhì)相關(guān)研究已得到重視。目前研究主要集中于與優(yōu)質(zhì)拉面相關(guān)的磨粉、蛋白質(zhì)、淀粉、面團(tuán)流變學(xué)特性等品質(zhì)品指標(biāo)的篩選，評(píng)價(jià)方法的改良和拉面專用品種的選育方面。因?yàn)樾陆嫫焚|(zhì)構(gòu)成因素較復(fù)雜，與其相關(guān)的指標(biāo)較多，所以通過新疆拉面品質(zhì)評(píng)價(jià)方法的研究，將篩選出的指標(biāo)有效應(yīng)用于其品質(zhì)評(píng)價(jià)，成為新疆拉面品質(zhì)改良的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。新疆拉面評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括面條色澤和感官評(píng)價(jià)兩部分。面條色澤除受小麥出粉率、蛋白質(zhì)含量及面粉顆粒指數(shù)等磨粉品質(zhì)指標(biāo)的影響外，黃色素(YP)含量和多酚氧化酶 (PPO)活性對(duì)其也有顯著影響(胡鳳靈，何中虎，葛建貴等小麥品種黃色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子標(biāo)記檢測·麥類作物學(xué)報(bào)[J]. 2011,31 (1) :47-53.)。根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(穆培源，桑偉，王亮，等.新疆市售小麥面粉制作新疆拉面的加工品質(zhì)特性及其專用粉品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究.麥類作物學(xué)報(bào)[J]. 2007，27 (6) :1034-1041.),優(yōu)質(zhì)新疆拉面最佳色澤為亮白色，而低的YP含量和PPO活性低的品種，具有較好的白度和顏色性狀。籽?；蛎娣踄P含量主要受八氫番茄紅素合酶(PSY)基因影響，與面粉和面團(tuán)的白度高度負(fù)相關(guān)(Kruger J EiMatsuo R R,Presten K. A comparison of methods for the prediction of Cantonese noodle colour [J]. Canadian Journal of Plant Science，1992，72 :1021—1029.)，與其黃度高度正相關(guān)，低的YP含量基因型為Psy-Alb和Psy-Blb ；PPO活性主要受Ppo基因影響， 可以解釋面條(團(tuán))顏色褐變變異的50% 70%，是引起面條(團(tuán))顏色變褐的主要原因(Kruger J E,Hatcher D W,De Pauw R. A whole seed assay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulness as a measure of noodle darkening [J], Cereal Chemistry, 1994，71 :324-326.)，籽?；蛎娣?PPO 低活性基因型為 Ppo-Alb和Ppo-Dla。因此，對(duì)低YP含量和PPO低活性目標(biāo)基因型的鑒定，可作為新疆拉面色澤快速預(yù)測的方法。Psy-Ala為高黃色素含量基因型，Psy-Alb為低黃色素含量基因型， I^y-Alc基因型品種較罕見，其中Psy-Alb有利于提高對(duì)新疆拉面的白度，為拉面優(yōu)質(zhì)基因。PpoDl位點(diǎn)的Ppo-Dla為中等低PPO活性的基因型，可以減緩面條顏色褐變。拉面感官評(píng)價(jià)主要包括拉面手感、面條質(zhì)地、口感等項(xiàng)目。研究表明，蛋白質(zhì)特性、 淀粉特性和籽粒硬度等品質(zhì)性狀，可通過對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性和淀粉糊化特性的影響在一定程度上決定拉面的感官評(píng)價(jià)結(jié)果(Yun S H,Quail K,Moss R. Physicochemical properties of Australian wheat flours for white salted noodles[J]. Journal of Cereal Sciences,1996,23 :181-189.)。蛋白質(zhì)的數(shù)量與質(zhì)量對(duì)面條品質(zhì)有重要影響，其質(zhì)量主要是指面粉中醇溶蛋白與麥谷蛋白的構(gòu)成及比例，不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成賦予了小麥籽粒蛋白質(zhì)不同的質(zhì)量，其中，高分子量谷蛋白亞基(HMW-GQ和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GQ的組成與面團(tuán)的粘彈性及延伸性密切相關(guān)，在一定程度上決定了面條的品質(zhì)。適合新疆拉面制作的面粉一般為中筋，且具有較好的延伸性。盧靜等人研究發(fā)現(xiàn)(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及 1B/1R易位系對(duì)新疆拉面品質(zhì)性狀的影響[J],新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47 (10) 1909-1917.)， HMW-GS 7+8,5+10,2+10等對(duì)新疆拉面的品質(zhì)有正向效應(yīng)，但未對(duì)Glu-Al位點(diǎn)的優(yōu)質(zhì) HMW-GS和優(yōu)質(zhì)LMW-GS予以說明。對(duì)優(yōu)質(zhì)拉面品種的HMW-GS和LMW-GS的分子標(biāo)記檢測發(fā)現(xiàn)，除已發(fā)現(xiàn)的優(yōu)質(zhì)拉面亞基類型外，2*和Glu-B3a等亞基類型對(duì)新疆拉面的品質(zhì)也有一定的正向效應(yīng)。Glu-Al位點(diǎn)的Ax2*基因表達(dá)的2*亞基通過提高面筋強(qiáng)度(Payne P I， Lawrence G J. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-Al,Glu-Bl, and Glu-Dl which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat [J]. Cereal Research Communications, 1983，11 :29-35.)，對(duì)拉面品質(zhì)有一定的貢獻(xiàn)。此外，1B/1R易位對(duì)小麥的蛋白特性也有顯著影響。小麥的IB染色體短臂被黑麥的 IR染色體短臂取代而形成小麥-黑麥1B/1R易位系。易位使普通小麥IB染色體短臂上 LMW-GS(Glu-B3位點(diǎn))和醇溶蛋白(Gli-Bl位點(diǎn))缺失，或被品質(zhì)較差的黑麥堿(secalin 基因編碼)取代，導(dǎo)致面團(tuán)粘性增大、強(qiáng)度降低，對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性和面條品質(zhì)都有極顯著的負(fù)面影響(Wieser H, Kieffer R, Lelley T. The influence of 1B/1R chromosome translocation on gluten protein composition and technological properties of bread wheat [J]. J Sci Food Agric，2000，80 :1640-1647.)。蘆靜(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及1B/1R易位系對(duì)新疆拉面品質(zhì)性狀的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010,47(10) :1909-1917.)等研究發(fā)現(xiàn)，與非1B/1R易位系(不含有co-secalin基因)相比，1B/1R易位系(含有ω-secalin基因)的各項(xiàng)加工品質(zhì)均顯著降低，大多不能滿足優(yōu)質(zhì)拉面制作的要求，在新疆拉面品質(zhì)育種中應(yīng)當(dāng)淘汰。籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色體短臂，分為Pina和Pinb兩種類型，其不同變異對(duì)小麥磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)有重要的影響。Chen等(陳鋒，尚曉麗，董中東，等.中國小麥歷史品種puroindoline基因等位變異檢測[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2011， 31 (3) =389-394)研究表明，Pinb-Dlb比Pina-Dlb類型出粉率高、灰份低，具有更好的磨粉品質(zhì)，同時(shí)前者的饅頭、面條和面包加工品質(zhì)也均優(yōu)于Pina-Dlb和野生型。新疆拉面的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法需要多種分析儀器、樣品用量大、測定周期長，且很難實(shí)現(xiàn)大量材料、多個(gè)指標(biāo)的同時(shí)檢測，制約了新疆拉面的品質(zhì)改良和評(píng)價(jià)。隨著與小麥加工品質(zhì)相關(guān)基因的克隆及其分子標(biāo)記的開發(fā)，利用特異性引物對(duì)品質(zhì)基因進(jìn)行快速PCR檢測的方法得到廣泛應(yīng)用。但新疆拉面的品質(zhì)改良涉及多個(gè)基因，傳統(tǒng)的PCR方法一般一次只能檢測一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因，很難滿足拉面專用品種的選育及其后續(xù)篩選、加工、評(píng)價(jià)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對(duì)組鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀的方法。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR 引物對(duì)組為如下al)或a2)的引物對(duì)組al)由引物對(duì)組A和引物對(duì)組B組成的弓丨物對(duì)組；3幻引物對(duì)組A;所述引物對(duì)組A中的引物對(duì)均特異于拉面色澤相關(guān)基因，具體由特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)，和特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組B中的引物對(duì)均特異于拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因，具體由特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組A中，所述特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)分別為序列表中序列1 和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3 ；所述引物對(duì)組B中，所述特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列7和序列 8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)4 ；所述特異于PinbDlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)5 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)6。其中，序列1由20個(gè)核苷酸組成；序列2由22個(gè)核苷酸組成；序列3由20個(gè)核苷酸組成；序列4由20個(gè)核苷酸組成；序列5由20個(gè)核苷酸組成；序列6由20個(gè)核苷酸組成；序列7由21個(gè)核苷酸組成；序列8由20個(gè)核苷酸組成；序列9由21個(gè)核苷酸組成 ’序列10由18個(gè)核苷酸組成；序列11由20個(gè)核苷酸組成；序列12由20個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明中，所述Psy-Al基因有三個(gè)等位基因，分別是Psy-Ala、Psy-Alb和 Psy-Alc ；所述Ppo-Dl基因有兩個(gè)等位基因，分別是Ppo-Dla和Ρρο-Dlb。所述引物對(duì)組A中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)1，所述引物對(duì)2和所述引物對(duì)3在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 4 1;所述特異引物對(duì)組B中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)4，所述引物對(duì)5和所述引物對(duì)6在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1。含有所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括將所述用于鑒定或輔助鑒定CN 102382895 A
說明書
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待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括如下步驟將所述用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Psy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種、含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種，以及是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為60°C ；B)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組B進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行1個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)下降0. 1°C，在本發(fā)明的實(shí)施例中，用所述引物對(duì)組B進(jìn)行PCR反應(yīng)共進(jìn)行了 35個(gè)循環(huán)。(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有I^sy-Ala、Psy-Alb和I3Sy-Alc這三種基因中哪一種、含有Ρρο-Dla和Ppo-Dlb 這兩種基因中哪一種，以及是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果同時(shí)含有大小為1686bp和194bp 的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^y-Ala基因或候選含有I^y-Ala基因；如果同時(shí)含有大小為1686bp和231bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^y-Alb基因或候選含有 I^sy-Alb基因；如果同時(shí)含有大小為IOOlbp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有 I^y-Alc基因或候選含有I^y-Alc基因；如果含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dla基因或候選含有Ppo-Dla基因；如果不含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因；以所述引物對(duì)組B的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有ω-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Psy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種，以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟(1)以待測小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為60°C ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有I^sy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種，以及含有Ppo-Dla和 Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種以所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果同時(shí)含有大小為1686bp和194bp 的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^y-Ala基因或候選含有I^y-Ala基因；如果同時(shí)含有大小為1686bp和231bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^y-Alb基因或候選含有 I^sy-Alb基因；如果同時(shí)含有大小為IOOlbp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有 I^y-Alc基因或候選含有I^y-Alc基因；如果含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dla基因或候選含有Ppo-Dla基因；如果不含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育拉面小麥品種的方法。該方法包括采用如下a)_e)中至少一種的小麥作為親本進(jìn)行育種的步驟a)含有或候選含有I^y-Alb基因；b)含有或候選含有Ppo-Dla基因；c)含有或候選含有Ax2*基因；d)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；
e)不含或候選不含有ω -secal in基因。從眾多小麥品種中選擇滿足a)_e)中至少一項(xiàng)的小麥的方法，即為上述鑒定或輔助鑒定待測小麥含有I^sy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種、含有Ppo-Dla和 Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種，以及是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法。所選擇的小麥滿足上述a)-e)五項(xiàng)中的項(xiàng)數(shù)越多，表示所選擇的小麥越適合制作拉面。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述待測小麥具體為新疆冬小麥，如小麥品種(系)新冬16 號(hào)、新冬20號(hào)、冀麥26、小偃54、巴冬2號(hào)、新烏克蘭83、新烏克蘭84、北系11、燕大1885、 新冬M號(hào)、新冬27號(hào)、新冬28號(hào)、奎冬4號(hào)、冀麥M、冀麥31、石冬8號(hào)、89-2012、新冬22 號(hào)、新冬 23 號(hào)、藁優(yōu) 8901、HD04-23、79-18、新冬 14 號(hào)、新冬 18 號(hào)、85 (1)、89 (35)、80182、花 9146和89-44等。利用本發(fā)明對(duì)上述小麥品種(系)進(jìn)行鑒定或輔助鑒定后，發(fā)現(xiàn)小麥品種冀麥31同時(shí)具有拉面色澤優(yōu)質(zhì)基因Psy-Alb和Ppo-Dla，小麥品種石冬8號(hào)具有拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)優(yōu)質(zhì)基因Ax2*和Pinb-Dlb的同時(shí)，又不含有影響拉面品質(zhì)的 ω -secalin 基因。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組A或引物對(duì)組B的各引物對(duì)之間不存在相互抑制作用和錯(cuò)配，檢測品種(系)的結(jié)果可靠、重復(fù)性好，成本低。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組A或引物對(duì)組B均選用同樣的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且特異性強(qiáng)， 檢測過程耗時(shí)短。將本發(fā)明含有引物對(duì)組A或引物對(duì)組B的多重PCR體系用于小麥品質(zhì)育種的親本評(píng)價(jià)和雜交后代優(yōu)質(zhì)基因的聚合，將會(huì)提高優(yōu)質(zhì)拉面專用小麥品種評(píng)價(jià)和選育的效率，加快拉面專用小麥品種的加工品質(zhì)改良。


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圖1為Psy-Ala、Psy-Alb、Psy-Alc和Ppo-Dla基因標(biāo)記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為Ax2*、Pinb-Dlb和ω-secalin基因標(biāo)記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、拉面色澤相關(guān)基因的多重PCR檢測本實(shí)施例的多重PCR引物對(duì)組由特異于Psy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)，和特異于 Pp0-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)組成；其中，所述特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6 所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3。本實(shí)施例的多重PCR引物對(duì)組可同時(shí)檢測I^sy-Al和Pp0-Dl兩個(gè)基因位點(diǎn)的5種基因型 Psy-Ala、Psy-Alb、Psy-Alc、Ppo_Dla 和 Ppo-Dlb。含有 Psy-Ala 基因的材料，PCR 同時(shí)擴(kuò)增出1686bp和194bp的兩個(gè)條帶；含有I^sy-Alb基因的材料，PCR同時(shí)擴(kuò)增出1686bp 和231bp的兩個(gè)條帶；含有Psy-Alc基因的材料，PCR同時(shí)擴(kuò)增出IOOlbp和194bp的兩個(gè)條帶；含有Ppo-Dla基因的材料，PCR擴(kuò)增出713bp的一條帶；含有Pp0-Dlb基因的材料，PCR 擴(kuò)增無71!3bp的條帶。一、已知基因型小麥品種拉面色澤相關(guān)基因的多重PCR擴(kuò)增1、小麥基因組的制備采用CTAB法對(duì)4份已知基因型的小麥品種(系)進(jìn)行基因組DNA的提取，得到對(duì)應(yīng)于4份已知基因型的小麥品種(系)的基因組DNA，作為拉面色澤相關(guān)基因多重PCR擴(kuò)增的模板。其中，4份已知基因型的小麥品種(系)為新冬16號(hào)、新冬20號(hào)、冀麥沈和小偃M，王亮等(王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥品種黃色素含量基因(Psy-Al)等位變異的分子檢測[J]·麥類作物學(xué)報(bào)，2009, ) =782-786.王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥品種中多酚氧化酶(PPO)活性基因等位變異的分布[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2008，觀(5) 766-771.)對(duì)這四個(gè)小麥品種(系)的Psy-Al和Pp0-Dl基因的基因型進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測，詳見表1。表1已知基因型小麥品種(系)拉面色澤相關(guān)基因的基因型
權(quán)利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組，所述拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因?yàn)镻sy-Al基因、Ppo-Dl基因、Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin 基因，其特征在于所述多重PCR引物對(duì)組由引物對(duì)組A和引物對(duì)組B組成；所述引物對(duì)組 A由特異于所述I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)，和特異于所述Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)組成； 所述引物對(duì)組B由特異于所述Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于所述Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于所述ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組A中，所述特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3 ；所述引物對(duì)組B中，所述特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)4 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)5 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)6。
2.用于鑒定或輔助鑒定待測小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組，為權(quán)利要求1中的所述引物對(duì)組A，由特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)，和特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述特異于I^sy-Al基因的兩個(gè)引物對(duì)分別為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1，以及序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于Ppo-Dl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)組，其特征在于所述引物對(duì)組A中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)1，所述引物對(duì)2和所述引物對(duì)3在 PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 4 1 ；所述特異引物對(duì)組B中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在 PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)4，所述引物對(duì)5和所述引物對(duì)6在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1。
4.含有權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組的試劑盒。
5.權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
6.權(quán)利要求4所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-3中任一所述的引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
7.鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Psy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種、 含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種，以及是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和 ω-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法，其特征在于所述方法包括下述(1)和的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1或3所述引物對(duì)組中的所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為60°C ；B)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1或3所述引物對(duì)組中所述引物對(duì)組B 進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行1個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)下降0. 1°C ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有I^sy-Ala、Psy-Alb和I3Sy-Alc這三種基因中哪一種、含有Ρρο-Dla和Ρρο-Dlb這兩種基因中哪一種，以及是否含有Ax2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果同時(shí)含有大小為1686bp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有by-Ala基因或候選含有I^y-Ala基因；如果同時(shí)含有大小為1686bp和231bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^sy-Alb基因或候選含有I^sy-Alb 基因；如果同時(shí)含有大小為IOOlbp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有Psy-Alc 基因或候選含有by-Ale基因；如果含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有 Ppo-Dla基因或候選含有Ppo-Dla基因；如果不含有大小為71!3bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因；以所述引物對(duì)組B的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。
8.鑒定或輔助鑒定待測小麥含有Psy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種， 以及含有Ppo-Dla和Ppo-Dlb這兩種基因中哪一種的方法，其特征在于所述方法包括下述 ⑴和⑵的步驟(1)以待測小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2或3所述引物對(duì)組中的所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為60°C ；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測小麥含有I^sy-Ala、Psy-Alb和Psy-Alc這三種基因中哪一種，以及含有Ρρο-Dla和Ppo-Dlb 這兩種基因中哪一種以所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果同時(shí)含有大小為1686bp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有by-Ala基因或候選含有I^y-Ala基因；如果同時(shí)含有大小為1686bp和231bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^sy-Alb基因或候選含有I^sy-Alb 基因；如果同時(shí)含有大小為IOOlbp和194bp的兩個(gè)DNA片段，所述待測小麥含有I^sy-Alc 基因或候選含有by-Ale基因；如果含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有 Pp0-Dla基因或候選含有Ρρο-Dla基因；如果不含有大小為713bp的DNA片段，所述待測小麥含有Ppo-Dlb基因或候選含有Ppo-Dlb基因。
9.一種培育拉面小麥品種的方法，包括采用通過權(quán)利要求7的方法鑒定得到的如下 a)-e)中至少一種的小麥作為親本進(jìn)行育種的步驟a)含有或候選含有by-Alb基因；b)含有或候選含有Ppo-Dla基因；c)含有或候選含有Ax2*基因；d)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；e)不含有或候選不含有ω-secalin基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為新疆冬小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質(zhì)性狀基因的PCR體系及其應(yīng)用。本發(fā)明的PCR體系中的引物對(duì)組為下述1)或2)1)引物對(duì)組A和引物對(duì)組B；2)引物對(duì)組A；所述引物對(duì)組A中的三個(gè)引物對(duì)分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈，序列3和序列4所示兩條DNA單鏈，序列5和序列6所示兩條DNA單鏈組成；所述引物對(duì)組B三個(gè)引物對(duì)分別由序列7和序列8所示兩條DNA單鏈，序列9和序列10所示兩條DNA單鏈，序列11和序列12所示兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組各引物對(duì)間不存在抑制和錯(cuò)配，實(shí)現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且結(jié)果可靠、重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，成本低，耗時(shí)短，為優(yōu)質(zhì)拉面小麥品種選育及加工品質(zhì)改良提供依據(jù)。
文檔編號(hào)A01H1/00GK102382895SQ20111039810
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者崔鳳娟, 張曉科, 徐紅軍, 桑偉, 王曉龍, 相吉山, 穆培源, 聶迎彬, 鄒波, 韓新年 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院