專利名稱：具有殺蟲活性的小分子肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有殺蟲活性的小分子肽。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的不斷進(jìn)步，人們的生活水平得到明顯提高，環(huán)保意識(shí)也逐年增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)豐富、綠色、污染小的農(nóng)副產(chǎn)品得到人們的喜愛。長(zhǎng)期以來人們一直使用化學(xué)農(nóng)藥控制病蟲害，但是化學(xué)農(nóng)藥的毒性較大且殘留量也較高，長(zhǎng)時(shí)間使用對(duì)環(huán)境及人們的健康都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響，還會(huì)嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡。因此，人們逐漸研究并開發(fā)出生物農(nóng)藥?，F(xiàn)如今，生物農(nóng)藥已快速發(fā)展，許多新的品種不斷涌現(xiàn)，并已逐步取代化學(xué)農(nóng)藥，成為新農(nóng)藥發(fā)展的有效途徑之一。傳統(tǒng)的生物農(nóng)藥定義是指利用活體性生物如細(xì)菌、病毒來防治病蟲等有害生物的一類制劑?，F(xiàn)在生物農(nóng)藥的定義已不局限于此，范圍逐漸擴(kuò)大，通常是指利用活體性生物或其發(fā)酵產(chǎn)物、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物來防治病蟲等有害生物的一類制劑，包括生物化學(xué)農(nóng)藥、轉(zhuǎn)基因農(nóng)藥、微生物農(nóng)藥等等。傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥一般是消滅害蟲；而生物農(nóng)藥則是控制和殺滅害蟲，生物農(nóng)藥具有長(zhǎng)效作用，針對(duì)性強(qiáng)，毒性小，殘留量低，殺蟲效果好，抗藥性小，對(duì)作物產(chǎn)量影響也小的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供了一種具有殺蟲活性的小分子肽。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列為SerGluProAlaGlnIIeValIIeVal AspGlyValAspTyrTrp。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽由15個(gè)氨基酸組成，分子量為1691. 3。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽具有對(duì)人畜無毒性和環(huán)保性。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)試可知，本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽針對(duì)性強(qiáng)，對(duì)蚜蟲的防治效果達(dá)100%，對(duì)紅蜘蛛的防治效果可達(dá)90%，對(duì)木虱、白粉虱等均有殺滅作用，且常溫下3年內(nèi)持久有效。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，在pH = 2. 0 11. 0、溫度為20 80°C條件下均具有殺蟲活性。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽是一種廣譜性的殺蟲劑，不產(chǎn)生藥害，無殘留。成本低，與化學(xué)藥劑比較，可節(jié)省90%的成本；而且用量少，每畝用量?jī)H為2克。


圖1是具體實(shí)施方式
一中所需樣品粗品初步分離的結(jié)果圖。圖2是具體實(shí)施方式
一中峰IB12-IC1組分進(jìn)一步分離的結(jié)果圖。圖3是具體實(shí)施方式
一中具有殺蟲活性的小分子肽的純度結(jié)果檢測(cè)圖。圖4是具體實(shí)施方式
一中本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽的獲取方法一、將鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008 經(jīng) LB 培養(yǎng)基活化后，按 10%接種量將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，pH值7. 2士0. 05)，于 28°C搖床培養(yǎng)48h后，按10%接種量將種子液接入IOL發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉 5.0%,黃豆餅粉3.0%，酵母粉1. 6 %，α -淀粉酶0.3%，消泡劑0.05%，硫酸鎂0.05%，和余量蒸餾水配制，pH值7. 5士0.05，121°C高壓滅菌30min)的發(fā)酵罐中，置于121r/min、培養(yǎng)基中溶解氧含量為60%、起始pH值為8. 0、發(fā)酵溫度為28°C條件下攪拌發(fā)酵培養(yǎng)96h。二、取 IOOmL 鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU, 2008H008 發(fā)酵液用 4 層紗布過濾，加入IOOmL的丙酮溶液，攪拌均勻，30分鐘后2000r/min離心10分鐘，棄沉淀，取上清清液于30°C旋蒸除去丙酮，得所需樣品粗品。三、采用反相高效液相色譜法，C18柱，運(yùn)用紫外檢測(cè)器，以甲醇-水(甲醇與水的體積比10 90)作為流動(dòng)相，進(jìn)行樣品的一級(jí)制備；C18柱柱高25cm，柱體積4.155mL，柱壓13MP，最大流速1. 5mL/min，初步分離的結(jié)果如圖1所示，收集峰IB12-IC1組分。四、將收集到的峰IB12-IC1組分進(jìn)一步分離純化離子交換分析，C18柱，pH值為 8. 5的TBS緩沖液，214nm反相色譜，柱高:25cm，柱體積4. 155mL,柱壓13MP，最大流速 1. 5mL/min，進(jìn)一步分離的結(jié)果如圖2所示，收集峰2Di_2D2組分，即得到本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽。本實(shí)施方式所用的鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008在中國(guó)發(fā)明專利“一株具有高效殺蟲作用的菌株”(申請(qǐng)公布日2011年11月23日，申請(qǐng)?zhí)?201110179632. 5)中公布，其保藏編號(hào)為CCTCC No =M 2011028，保藏日期為2011年01月21曰。取5mL本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽進(jìn)行純度測(cè)定，避開疏水差異，電荷差異的分離手段，采用分子量大小差異分離分析，判斷純度。純度結(jié)果如圖3所示，本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽的純度大于95%。(純度測(cè)定方法將本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽用高效液相色譜HPLC測(cè)定柱體C18柱，流動(dòng)相體積濃度為35%的甲醇， 柱壓76 78kgf/cm2，波長(zhǎng)=A265，保留時(shí)間為4分55秒，柱箱溫度:30°C )取5mL本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽進(jìn)行濃度測(cè)定。測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，測(cè)定結(jié)果為0. 8mg/mL。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定，其分子量為1691. 377。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽用氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列為15個(gè)氨基酸組成的小肽，理論分子量為1691. 3與質(zhì)譜測(cè)定的分子量值相符?？刹捎梅肿由飳W(xué)手段合成本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽殺蟲活性鑒定(根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部(NY/T1154，14-2008) 2008，07，01起實(shí)施的規(guī)程進(jìn)行操作)將新鮮生菜，剪成與平皿(直徑9mm)底部大小一致，平鋪在平皿的底部。在每個(gè)鋪有生菜的平皿中加入2mL的本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽，浸泡生菜葉子2min 后，將葉子取出，用棉花蘸去表面液體。陰性對(duì)照為水。分別在每片經(jīng)過處理后的葉片上接種20頭蚜蟲，保證每頭蚜蟲的個(gè)體大小一致，處理后置于溫度25士0.5°C、光周期L D = 14 10、相對(duì)濕度為75% 85%的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)48h后檢查幼蟲死亡率殺蟲死亡率(％)；校正公式=(實(shí)驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1_對(duì)照組死亡率)X 100。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽對(duì)蚜蟲的殺蟲率為100%。將新鮮生菜，剪成與平皿(直徑9mm)底部大小一致，平鋪在平皿的底部。在每個(gè)鋪有生菜的平皿中加入2mL的本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽，浸泡生菜葉子2min后， 將葉子取出，用棉花蘸去表面液體。陰性對(duì)照為水。分別在每片經(jīng)過處理后的葉片上接種 20頭紅蜘蛛，保證每頭紅蜘蛛的個(gè)體大小一致，處理后置于溫度25士0.5°C、光周期L D =14 10、相對(duì)濕度為75% 85%的培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)48h后檢查幼蟲死亡率。殺蟲死亡率(％)；校正公式=(實(shí)驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1_對(duì)照組死亡率)X 100。本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽對(duì)紅蜘蛛的殺蟲率為90%。而且本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽對(duì)木虱、白粉虱均有殺滅作用。將本實(shí)施方式獲得的具有殺蟲活性的小分子肽凍干，每畝本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽凍干粉用量?jī)H為2克。將本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽凍干粉加入水中配置成濃度為50 60ppm的生物藥液，即可使用，有效殺滅害蟲。與使用化學(xué)藥劑相比， 可節(jié)省農(nóng)藥成本約90%。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng)，在pH = 2. 0 11. 0、溫度為20 80°C條件下均保持較高殺蟲活性。與未遭受蟲害的作物進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，使用本實(shí)施方式具有殺蟲活性的小分子肽的作物產(chǎn)量無明顯變化。
權(quán)利要求
1.具有殺蟲活性的小分子肽，其特征在于具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如 SEQID NO 1 所示。
全文摘要
具有殺蟲活性的小分子肽，它涉及一種有殺蟲活性的小分子肽。本發(fā)明是提供了一種具有殺蟲活性的小分子肽。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明具有殺蟲活性的小分子肽可用于蟲害防治。
文檔編號(hào)A01P7/00GK102492025SQ20111043938
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者余瓊, 張巍, 張朝暉, 穆丹, 馬東升, 高金勝 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)