專利名稱：一種用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法。
背景技術(shù)：
石斛屬是蘭科植物中的最大的屬之一，為多年生草本植物，原產(chǎn)地主要分布在亞熱帶和熱帶地區(qū)，全球有1500余種，我國約76種。石斛屬植物是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材， 最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中即有記載，此外在明代李時珍的《本草綱目》中也有詳細記載。我國約有40種石斛蘭可做藥用。其中比較著名的有金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛等。古籍上記載石斛具有強陰益精，補腎益力，輕身延年等作用，此外還有益胃生津，滋陰清熱，止咳潤肺的功效?，F(xiàn)代研究也表明石斛中含有抗腫瘤，抗衰老和增加人體免疫力的成分。同時石斛蘭花姿優(yōu)美，花色艷麗，花期較長，且大部分都有芳香性，也是深受人們喜愛的觀賞花卉。由于石斛蘭集藥用和觀賞于一體的價值，自然繁殖力極低，生長緩慢，加之掠奪性采挖，致使野生石斛蘭資源已經(jīng)嚴重枯竭，我國已將其列為瀕于絕滅的受保護的植物之一。 目前幾乎所有用作觀賞植物栽培的石斛蘭都是雜交種，種子小，數(shù)目多且發(fā)育不完全，同時種子繁殖無法保持其品種特性，結(jié)實率低，分株能力弱，因而繁殖系數(shù)低，繁殖速度慢，很難滿足市場對植株品質(zhì)的要求，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖石斛蘭，能夠克服其種子繁殖與分株繁殖技術(shù)上的缺點，因此石斛蘭的組培快繁研究非常必要，且具有較高的實用價值。原球莖誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，目前石斛植物原球莖誘導(dǎo)效率不高，已成為制約石斛蘭快速繁殖的關(guān)鍵步驟之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效利用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法，主要是用石斛莖尖進行原球莖誘導(dǎo)，為石斛蘭的快速繁殖和工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)創(chuàng)造條件。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法，所述方法包括(1)取石斛組織進行常規(guī)無菌處理，所述石斛組織來自石斛莖尖、根尖或者幼嫩莖段；(2)無菌處理的石斛組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，先于黑暗條件下23 25°C培養(yǎng)一周后，再進行光照培養(yǎng)20 30d，光照周期為12h/天、溫度23 25°C，至誘導(dǎo)獲得原球莖；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成如下瓊脂糖3 4g/L，萘乙酸0. 5 aiig/L，6-BA 0. 3 lmg/L，溶劑為V2MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)20d時原球莖增大到合適程度，并開始發(fā)綠，若進行繼代培養(yǎng)，可以選擇這個階段進行繼代培養(yǎng)，可以有效保證繼代效果；25d左右為最適移栽時間，此時原球莖開始分化出根和芽，分化速度和順序有培養(yǎng)基主城有關(guān)；30d左右培養(yǎng)基營養(yǎng)成分減少，漸漸開始影響原球莖的生長，最好在此之前移栽。MS為常用的基本培養(yǎng)基，其無機鹽與離子的濃度較高，是較為穩(wěn)定的平衡培養(yǎng)液，但是硝酸鹽含量較高，而1/2MS是將MS的大量元素減半其他不變而配制的培養(yǎng)基，主要是降低無機鹽濃度，作用和MS大致相同只是不同植物不同要求而已。1/2MS培養(yǎng)基的成分如下大量元素:KN03 950mg/L, NH4NO3 825mg/L, KH2PO4 85mg/L, MgSO4. 7H20185mg/L, CaCl2. 2H20 220mg/L ；微量元素KI 0· 415mg/L，H3BO3 3. lmg/L，MnSO4. 4H20 11. 15mg/L, ZnSO4. 7H20 4. 3mg/L, Na2MoO4. 2H200. 125mg/L, CuSO4. 5H20 0. 0125mg/L, CoCl2. 0. 0125mg/L, Na2. EDTA37. 3mg/L, FeSO4. 7H20 27. 8mg/L ；有機成分肌醇 100mg/L，甘氨酸 ang/L，鹽酸硫胺素(VBl) 0. lmg/L，鹽酸吡哆醇(VB6)0. 5mg/L，煙酸 VB5 或 VPP 0. 5mg/L，蔗糖 40g/L，瓊脂 7g/L，溶劑為水。優(yōu)選的所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成如下瓊脂糖3. 8g/L，萘乙酸0. 5mg/L,6-BA 0. 66mg/ L，溶劑為1/2MS培養(yǎng)基，pH5. 8 ；具體的，所述無菌處理為先用75%乙醇漂洗2 3次，然后用0. 升汞溶液浸泡處理5 IOmin (莖尖、根尖5min，莖段IOmin)，最后再用無菌水沖洗2 3次。實驗發(fā)現(xiàn)莖尖的誘導(dǎo)成功率最高，因此所述石斛組織優(yōu)選來自莖尖。本發(fā)明石斛優(yōu)選為鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、束花石斛、齒瓣石斛和霍山石斛中的一種。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，環(huán)境污染低；(2) 誘導(dǎo)成功率高，用莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)率一般在50 %左右，根尖可以達到60 % 70 %，莖尖具有最好的誘導(dǎo)成功率可以達到75%左右；C3)培養(yǎng)周期短，可以在較短時間內(nèi)獲得大量原球莖，誘導(dǎo)出的原球莖可直接進行無菌培養(yǎng)獲得大量幼苗；(4)直接利用組織培養(yǎng)，良好保持親本性狀。


圖1為誘導(dǎo)出的原球莖；圖2為原球莖開始分化成苗；圖3為原球莖分化成苗。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 a、石斛外植體選擇及無菌處理1、選取云南鐵皮石斛(產(chǎn)地云南)幼嫩莖尖，切取約0.3cm左右的尖端部分，先用自來水沖洗，除去表面污物，再用蒸餾水漂洗；2、將尖端置于75% (ν/ν)乙醇中處理30 60s，漂洗兩次；3、將乙醇漂洗后的莖尖置于0. 1% (w/w)升汞溶液中浸泡5min ；4、取出后用無菌水漂洗3次，除去表面吸附的升汞溶液；b、原球莖誘導(dǎo)1、將無菌處理后的石斛莖尖置于石斛原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行原球莖誘導(dǎo)。培養(yǎng)基組成為l/2MS+3. 8g/L 瓊脂糖 + 萘乙酸 0. 5mg/L+6-BA0. 66mg/L ；pH5. 8 ；2、在黑暗環(huán)境培養(yǎng)一周，溫度保持在23 25°C ；
3、將暗培養(yǎng)后的材料(圖1)轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，溫度保持在23 25°C，光照周期12h/ day,光照培養(yǎng)20d時原球莖增大到合適程度，并開始發(fā)綠(圖2)，第25d開始分化出根和芽 (圖3)，此時可進行移栽；按照上述方法，原球莖誘導(dǎo)成功率約75%。C、大規(guī)模繁殖將誘導(dǎo)出的原球莖進行繼代培養(yǎng)后進行分株，組織培養(yǎng)至形成新的植株即可進行分栽。以金釵石斛、鼓槌石斛、束花石斛、齒瓣石斛和霍山石斛分別按上述方法進行原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)，原球莖誘導(dǎo)成功率均在60%以上。
權(quán)利要求
1.一種用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法，所述方法包括(1)取石斛組織進行無菌處理，所述石斛組織來自石斛莖尖、根尖或者幼嫩莖段；(2)無菌處理的石斛組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，先于黑暗條件下23 25°C培養(yǎng)一周后，再進行光照培養(yǎng)20 30d，光照周期為12h/天、溫度23 25°C，至誘導(dǎo)獲得原球莖；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成如下瓊脂糖3 4g/L，萘乙酸0. 5 ang/L，6-BA0. 3 lmg/L， 溶劑為1/2MS培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成如下瓊脂糖3.8g/L，萘乙酸 0. 5mg/L，6-BA 0. 66mg/L，溶劑為 1/2MS 培養(yǎng)基，pH5. 8。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述無菌處理為先用75%乙醇漂洗2 3 次，然后用0. 升汞溶液處理5 lOmin，最后再用無菌水沖洗2 3次。
4.如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述石斛組織來自莖尖。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用石斛組織誘導(dǎo)原球莖的方法，所述方法包括(1)取石斛組織進行常規(guī)無菌處理，所述石斛組織來自石斛莖尖、根尖或者幼嫩莖段；(2)無菌處理的石斛組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，先于黑暗條件下23～25℃培養(yǎng)一周后，再進行光照培養(yǎng)20～30d，光照周期為12h/天，溫度23～25℃，至誘導(dǎo)獲得原球莖；本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)方法操作簡單，生產(chǎn)成本低，環(huán)境污染低；(2)誘導(dǎo)成功率高，用莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)率一般在50％左右，根尖可以達到60％～70％，莖尖具有最好的誘導(dǎo)成功率可以達到75％左右；(3)培養(yǎng)周期短，可以在較短時間內(nèi)獲得大量原球莖，誘導(dǎo)出的原球莖可直接進行無菌培養(yǎng)獲得大量幼苗；(4)直接利用組織培養(yǎng)，良好保持親本性狀。
文檔編號A01H4/00GK102428874SQ201110445130
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者朱涵毅, 王慧中, 薛大偉 申請人:杭州師范大學(xué)