專利名稱：用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默的方法，利用該方法能夠研究小麥穗和發(fā)育種子中表達(dá)基因的生物學(xué)功能。
背景技術(shù)：
分子克隆和新一代DNA測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，極大促進(jìn)了禾谷類作物大量基因及轉(zhuǎn)錄本的分離和分子操作(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/guide/dna-rna/)。此外，主要農(nóng)作物包括水稻、玉米基因組測(cè)序已經(jīng)完成，小麥基因組測(cè)序正在進(jìn)行之中。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的快速發(fā)展使得用于基因功能分析，特別是農(nóng)藝性狀相關(guān)基因功能分析的有效方法成為基因功能研究的瓶頸。在模式植物擬南芥和水稻中，建立的基因功能研究技術(shù)，如利用T-DNA 插入方法構(gòu)建基因敲除突變體庫(kù)(Kaiser et al. ,2002)和利用T-DNA激活標(biāo)簽方法構(gòu)建基因激活突變體庫(kù)(Weigel et al.，2000)，已經(jīng)極大促進(jìn)了其基因功能的研究。然而，這些方法都不適用于小麥，因?yàn)樾←湹倪z傳轉(zhuǎn)化率很低；加之，基因組很大，構(gòu)建突變體庫(kù)需要轉(zhuǎn)化子的數(shù)目非常龐大。對(duì)于重要糧食作物小麥，目前尚缺乏用于功能基因研究的有效方法。近年來(lái)，建立和發(fā)展的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)方法可以通過(guò)在一些植物中快速創(chuàng)建基因沉默或抑制的表型，已逐漸成為基因功能鑒定的有效工具。迄今，適用于單子葉作物小麥VIGS的病毒載體僅有唯一的大麥條斑花葉病毒(the Barley stripe mosaic virus, BSMV)載體，它由 α、β、γ 3 條 RNA 正鏈組成；經(jīng)過(guò)改造的重組BSMV載體已逐漸被廣泛用于小麥苗期基因沉默及基因功能鑒定 (Scofield et al. ,2005 ；Tai and Bragg，2007)。迄今，尚沒(méi)有關(guān)于小麥穗部和籽粒基因沉默BSMV-VIGS方法技術(shù)的報(bào)道。小麥穗部和籽粒表達(dá)基因與產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性等重要農(nóng)藝性狀密切相關(guān)；揭示穗部和籽粒表達(dá)基因的功能將極大促進(jìn)禾谷類作物產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的改良。因此，建立小麥穗部和籽?；蚬δ芊治龅墓ぞ叻浅１匾?。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默(BSMV-VIGQ的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案予以實(shí)現(xiàn)一種用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默方法，其特征在于，將攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV的α、β、Ypds CDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥，接種時(shí)期在抽穗期 揚(yáng)花期，接種部位為小麥穗，接種方法為用拇指和食指上下摩擦穗部5次，即可實(shí)現(xiàn)小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因的有效沉默。經(jīng)發(fā)明人驗(yàn)證，采用本發(fā)明的方法能夠用于小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默的應(yīng)用，按下列步驟進(jìn)行
(a)構(gòu)建攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV的γ cDNA ；(b)按照權(quán)利要求1所述的接種時(shí)期、接種部位和接種方法，用重組BSMV的α、 β、Y cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合接種小麥穗，即可實(shí)現(xiàn)小麥穗或種子靶標(biāo)基因沉默。采用本發(fā)明的方法，在小麥穗部和籽粒發(fā)育時(shí)期就可以實(shí)現(xiàn)發(fā)育穗部和籽粒靶標(biāo)基因的瞬時(shí)沉默，快速創(chuàng)制靶標(biāo)基因沉默或抑制的表型，以分析靶標(biāo)基因的生物學(xué)功能。


圖1 顯示用于本發(fā)明的大麥條斑花葉病毒(BSMV)的α、β、y RNA(a)及用于小麥穗部和籽粒種子PDS或1Βχ14基因沉默的重組BSMV插入片段的組織結(jié)構(gòu)(b)示意圖。 圖中矩形框表示開放閱讀框，框中的符號(hào)表示基因名稱；MCS表示多克隆位點(diǎn)；hsl和分別表示插入片段。圖2 顯示在抽穗期和揚(yáng)花期向小麥穗部接種攜帶PDS片段的重組BSMV導(dǎo)致小麥穗部(a)和種子(b)內(nèi)源PDS基因沉默的表型。圖中顯示的均為接種22天后的小麥穗或種子；BSMV 00表示用未攜帶插入片段的空病毒BSMV接種(對(duì)照)；BSMV =PDS表示用攜帶 185bp的PDS基因片段的重組病毒BSMV接種(內(nèi)源PDS沉默表型)。圖3 顯示在小偃6號(hào)和陜優(yōu)225小麥品種的揚(yáng)花期向穗部接種攜帶1Βχ14片段的重組BSMV導(dǎo)致發(fā)育種子的HMW-GS基因1Βχ14沉默的蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜。圖中BSMV 00表示用未攜帶插入片段的空病毒BSMV接種后所得種子(對(duì)照)；BSMV:lBxl4表示用攜帶176bp的1Βχ14片段的重組病毒BSMV接種后所得種子(HMW-GS 1Βχ14基因表達(dá)抑制)。 左側(cè)的IAxl, 1Dx2, 1Βχ14, lByl5和lDyl2分別為各HMW-GS的名稱。箭頭指示接種重組病毒的種子中因1Βχ14基因沉默導(dǎo)致HMW-GS 1Βχ14的量比對(duì)照(左側(cè)泳道相應(yīng)條帶)極顯著減少。下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 申請(qǐng)人:采用攜帶185bpPDS片段的重組病毒BSMV (Scofield et al.，2005)對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行驗(yàn)證，具體方法是首先，用本領(lǐng)域共知的體外轉(zhuǎn)錄方法轉(zhuǎn)錄BSMV的α、β、Ypds cDNA獲得其轉(zhuǎn)錄子 α、β、γ PDS RNA ；其次，取三種轉(zhuǎn)錄子α、β、yPDS RNA各300ng，分別與25 μ 1的FES Buffer (含 1 %甘氨酸、0. 75% K2HPO4,1 %硅藻土、1 %澎潤(rùn)土、1 %的Na3PO4. IOH2O)于拇指和食指尖間混合均勻；然后，在處于抽穗 揚(yáng)花期小麥穗部上下輕輕摩擦5次。13天后即可觀察到穗部和種子的種皮漂白的表型，即內(nèi)源PDS基因沉默的表型， PDS基因沉默的表型可持續(xù)至接種后35天。可以預(yù)見，按照本發(fā)明所述的小麥穗部和籽粒BSMV-VIGS方法，可以實(shí)現(xiàn)小麥穗部和發(fā)育籽粒的任何已知序列靶標(biāo)基因表達(dá)的沉默。附圖1顯示了重組BSMV的α、β、y RNA(a)和用于小麥穗部和種子PDS基因CN 102533850 A11Βχ14基因沉默的重組BSMV的γ PDS或Y 1Bxl4中插入片段(b)的組織結(jié)構(gòu)示意圖。其中， 圖1的a為BSMV的α、β、γ RNA組織結(jié)構(gòu)示意圖；b的上部是用于小麥穗部和種子PDS基因沉默的重組BSMV的Ypds中的插入片段組織結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了在抽穗期和揚(yáng)花期的小麥穗部接種攜帶PDS片段的重組BSMV α、β、γ PDS RNA產(chǎn)生的小麥穗部和種子內(nèi)源PDS 基因沉默的表型。實(shí)施例2 申請(qǐng)人:構(gòu)建了攜帶176bp的小麥種子高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GQ編碼基因 1Βχ14片段的重組Y 1Bxl4 cDNA。構(gòu)建方法如下根據(jù)本領(lǐng)域公知的小麥HMW-GS編碼基因1Βχ14序列(GenBank accession AY367771. 1)及其與其它HMW-GS編碼基因的同源性，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了上游引物和下游引物， 其中上游引物5‘ -CGAAGGCGTAGTCTCGCTGGGG-3 ‘；下游引物5' -GCGAGCTCCGGAAGCGCG-3‘；用申請(qǐng)人研究小組已克隆和構(gòu)建的含1Βχ14基因的質(zhì)粒載體PHMWlBxl4(Liu et al. 2011)為模板，通過(guò)本領(lǐng)域公知的PCR擴(kuò)增方法，得到1Βχ14基因特異的176bp片段(位于1Βχ14基因編碼區(qū)的第98至27!3bp)。其序列如下5 ‘ -GCGAGCTCCGGAAGCGCGAGCTCGAGGCATACCAACAGGTGGTGGACCAGCAACTCCGAGACGT TAGCCCCGGGTACCGCCCCATCACCGTCAGCCCGGGCACGAGACAATACGAGCAGCAACCTGTGGTGCCGCCCAAGG CCGGATCCTTCTACCCCAGCGAGACTACGCCTTCG-3‘。將該176bp片段連接到線性化的BSMV的γ cDNA質(zhì)粒ρ Y (Scofield etal.， 2005)，即得到Y(jié)ibx14 cDNA，圖Ib的下部是本發(fā)明構(gòu)建的Yibx14中的插入片段組織結(jié)構(gòu)示意圖。通過(guò)本領(lǐng)域共知的方法體外轉(zhuǎn)錄BSMV的α、β、γ 1Bxl4 cDNA獲得3種轉(zhuǎn)錄子α、 β、Y 1Bxl4 RNA,取三種轉(zhuǎn)錄子 α、β、γ 1Βχ14 RNA 各 300ng，分別與 25 μ 1 的 FES Buffer (含 1 %甘氨酸、0. 75% K2HPO4,1 %硅藻土、1 %澎潤(rùn)土、1 %的Na3PO4 IOH2O)于拇指和食指尖間混合均勻；然后，在處于揚(yáng)花期小麥穗部上下輕輕摩擦5次；接種22天后，用本領(lǐng)域共知的小麥種子蛋白質(zhì)SDS-PAGE方法在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)抑制。本實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了小麥發(fā)育種子中胚乳高分子量蛋白亞基(HMW-GQ編碼基因 1Βχ14的沉默，并分析了 HMW-GS 1BX14在麥谷蛋白大聚合體形成中的作用。圖3顯示了在揚(yáng)花期小偃6號(hào)和陜優(yōu)225小麥品種的穗部接種攜帶176bp的1Βχ14 片段的重組BSMV α、β、γ 1Bxl4 RNA,產(chǎn)生的種子HMW-GS基因1Βχ14沉默的SDS-PAGE圖譜。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有的用于小麥幼苗的BSMV-VIGS技術(shù)和通過(guò)小麥轉(zhuǎn)基因的 RNA干擾(RNAi)技術(shù)相比，經(jīng)驗(yàn)證表明，具有的特點(diǎn)和效果如下1、與現(xiàn)有用于小麥幼苗的BSMV-VIGS技術(shù)相比，本發(fā)明在小麥的抽穗期 揚(yáng)花期向穗部摩擦接種本領(lǐng)域公知的攜帶I^bpPDS片段的重組病毒BSMV(Scofield et al., 2005)(在穗部上下滑動(dòng)5次)，接種后13天在穗部和籽粒出現(xiàn)穗部和種子種皮漂白的表型，即為內(nèi)源PDS基因沉默的表型；PDS基因沉默表型可持續(xù)至接種后35天。2、與通過(guò)小麥轉(zhuǎn)基因的RNA干擾(RNAi)技術(shù)相比，本發(fā)明無(wú)需進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化(小麥的遺傳轉(zhuǎn)化率非常低)，只需用攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV病毒的α、β、Y cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物在抽穗期 揚(yáng)花期的小麥穗部摩擦接種，就可以實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)基因的有效沉默，能快速創(chuàng)制靶標(biāo)基因表達(dá)被抑制的表型。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，大大縮短了獲得小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因表達(dá)被抑制的表型的周期。3.首次利用PDS作為標(biāo)記基因，利用重組BSMV的α、β、Y PDS cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物在抽穗期 揚(yáng)花期的小麥穗部摩擦接種，實(shí)現(xiàn)了小麥穗部和籽粒內(nèi)源PDS基因的有效沉默。4.首次構(gòu)建了攜帶176bp的小麥種子高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)編碼基因 1Βχ14片段的重組BSMV ；利用本發(fā)明建立的上述小麥穗部和籽粒表達(dá)基因快速有效沉默的 BSMV-VIGS方法，實(shí)現(xiàn)了發(fā)育小麥種子胚乳HMW-GS基因1Βχ14的沉默。因此，本發(fā)明的小麥穗部和籽粒表達(dá)基因快速有效沉默的BSMV-VIGS方法，可以用于快速有效地鑒定小麥穗部和籽粒發(fā)育相關(guān)基因(涉及產(chǎn)量和品質(zhì)性狀)的功能。
權(quán)利要求
1.一種用重組大麥條斑花葉病毒介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默方法，其特征在于，將攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV的α、β、Ypds CDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種小麥，接種時(shí)期在抽穗期 揚(yáng)花期，接種部位為小麥穗，接種方法為用拇指和食指上下摩擦穗部5次，即可實(shí)現(xiàn)小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因的有效沉默。
2.權(quán)利要求1所述的方法用于小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，按下列步驟進(jìn)行(a)構(gòu)建攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV的γcDNA ；(b)按照權(quán)利要求1所述的接種時(shí)期、接種部位和接種方法，用重組BSMV的α、β、 Y cDNA的體外轉(zhuǎn)錄物等量混合接種小麥穗，即可實(shí)現(xiàn)小麥種子靶標(biāo)基因沉默。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的攜帶靶標(biāo)基因片段是176bp的小麥種子高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)編碼基因1Βχ14片段的重組γ 1Bxl4 cDNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用重組大麥條斑花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的小麥穗部和籽粒靶標(biāo)基因沉默的方法，主要通過(guò)用攜帶靶標(biāo)基因片段的重組BSMV的α、β、γcDNA體外轉(zhuǎn)錄物等量混合后接種抽穗期～揚(yáng)花期小麥穗，實(shí)現(xiàn)穗部和種子靶標(biāo)基因表達(dá)的沉默。相對(duì)于現(xiàn)有的基于轉(zhuǎn)基因的小麥穗部和種子RNAi技術(shù)方法，其具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)性好的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102533850SQ20111045060
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者趙惠賢, 馬猛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)