專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，具體涉及一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。
背景技術(shù)：
：棉花是世界性的重要經(jīng)濟(jì)作物。中國(guó)是棉花的生產(chǎn)大國(guó)，消費(fèi)大國(guó)和紡織大國(guó)。作為棉花生產(chǎn)大國(guó)，我國(guó)主產(chǎn)棉區(qū)覆蓋16個(gè)省、市(自治區(qū))，常年植棉面積7000-8000萬(wàn)畝，總產(chǎn)約600萬(wàn)噸，占世界總產(chǎn)的四分之一。然而在棉花的生長(zhǎng)期內(nèi)受到各種不同病害的威脅，如被稱(chēng)為棉花“癌癥”的黃萎病，它在全球都有分布且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(CaiYF,HeXH,MoJC,etal.MolecularresearchandgeneticengineeringofresistancetoVerticilliumwiltincotton:Areview[J].AfrJBiotech，2009，8:7363-7372.)。棉花黃萎病是黃萎病菌經(jīng)土壤傳播、侵染到棉花植株最終引發(fā)維管束疾病的一種真菌性病害，具有危害嚴(yán)重、分布范圍大、寄主種類(lèi)多及存活時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)，可造成棉花大量減產(chǎn)甚至絕收(YangC,GuoWZ,LiGY,etal.QTLsmappingforVerticilliumwiltresistanceatseedlingandmaturitystagesforinG.barbadenseL[J].PlantSci,2008,174290-298)ο黃萎病菌屬于真菌的半知菌亞門(mén)(Deutermycotina)淡色孢科(Monilaceae)輪枝菌屬(Verticillium)，屬內(nèi)有若干種；其中危害棉花的有黑白輪枝菌(VerticilliumalboatrumReinke&Berthier)和大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKlebahn)，它們?cè)谛螒B(tài)、特征、寄主范圍以及生長(zhǎng)特征方面都有所差異。應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病品種是目前最有效和可行的控制棉花黃萎病危害的方法。陸地棉是4個(gè)栽培種中種植最廣泛的棉種，它的產(chǎn)量占到當(dāng)年棉花產(chǎn)量的95%，所以是遺傳研究和育種的主要對(duì)象，但是大部分的陸地棉品種均感或耐黃萎病(ChenZJ,SchefflerBE,Dennis,Eetal.Towardsequencingcotton(Gossypium)genomes[J],PlantPhysiol,2007,145:1303-1310.)。海島棉是另一個(gè)四倍體栽培種，它的纖維比陸地棉“長(zhǎng)、強(qiáng)、細(xì)”，同時(shí)它高抗或抗黃萎病，因此海島棉是重要的棉優(yōu)質(zhì)纖維和抗黃萎病基因的重要來(lái)源。育種家們一直想通過(guò)海陸種間雜交的方式把海島棉中抗黃萎病的基因?qū)氲疥懙孛拗腥?，但是由于連鎖累贅和雜交后代不容易穩(wěn)定等原因限制了抗病品種的培育。分子標(biāo)記技術(shù)在提高棉花抗黃萎病育種中的應(yīng)用大大減少了育種過(guò)程中選擇的盲目性，快速實(shí)現(xiàn)外源優(yōu)良種質(zhì)向栽培品種滲透，拓寬了品種的遺傳基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)黃萎病抗性進(jìn)行了大量的QTL定位研究，有的已經(jīng)用于標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐。'^^W^^i^AM(Chromosomesegmentintrogressionlines,CSIL)交，回交和分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection,MAS)構(gòu)建的覆蓋作物整個(gè)基因組的一系列近等基因系。它的基因組內(nèi)只有來(lái)自供體親本的一個(gè)純合的染色體片段，而基因組的其余部分與輪回親本相同。它是進(jìn)行基因組研究，特別是QTL定位和分子設(shè)計(jì)育種的理想材料。萬(wàn)建民(萬(wàn)建民.作物分子設(shè)計(jì)育種.作物學(xué)報(bào)，2006，32(3)=455-462.)已利用由粳稻Asominori(輪回親本)和秈稻IR24(非輪回親本)構(gòu)建的染色體片段置換系進(jìn)行了分子育種的實(shí)踐。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，包含如下步驟(1)以保藏號(hào)為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號(hào)為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；(2)分子標(biāo)記輔助第一次選擇=F2種植，應(yīng)用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記引物對(duì)NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記引物對(duì)BNL1034、NAU1366、BNL3171進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇同時(shí)含有上述7個(gè)來(lái)源于海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標(biāo)記引物對(duì)NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6,BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標(biāo)記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標(biāo)記引物對(duì)NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366,BNL3171確定F3單株的基因型，同時(shí)具有7個(gè)來(lái)源于上述海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個(gè)黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進(jìn)行抗病性篩選獲得抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。有益效果本發(fā)明所提供的一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，與傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)傳統(tǒng)的回交聚合育種技術(shù)存在雜交工作量大、選擇可靠性差、育種周期長(zhǎng)的缺陷。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，可在2-3年內(nèi)快速高效培育出多抗的棉花新品系。本發(fā)明以海島棉染色體片段導(dǎo)入系——IL095和ILlM為材料，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇獲得了抗多個(gè)黃萎病菌種的棉花新品系“南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)”，“南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)”抗棉花黃萎病的相對(duì)病指為15.51%-20.97%。圖1分子標(biāo)記輔助選擇抗多個(gè)黃萎病菌種的棉花新品系。圖2IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)接種3個(gè)落葉型的黃萎病菌株后的相對(duì)病指。A為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)接種黃萎病菌株V991后的相對(duì)病指，B為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)接種黃萎病菌株V07DF2后的相對(duì)病指，C為IL095、IL154和南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)接種黃萎病菌株D8092后的相對(duì)病指。生物材料保藏證明IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNO.5574；ILlM為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNO.5575。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1選擇親本南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花研究所以陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-I為輪回親本，抗病、優(yōu)質(zhì)的海島棉海71M品系為供體親本(非輪回親本)，在回交高世代結(jié)合覆蓋全基因組的SSR分子標(biāo)記輔助選擇，培育了國(guó)內(nèi)首套陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-I背景的海島棉染色體片段導(dǎo)入系174個(gè)，其基因組的覆蓋率達(dá)83.5%。黃萎病菌株V991和V07DF2是長(zhǎng)江棉區(qū)致病力不同的2個(gè)落葉型菌株(菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存)，黃萎病菌株D8092是黃河棉區(qū)的中等致病力的落葉型菌株(菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所保存)。利用V991、V07DF2和D80923個(gè)不同致病力的菌株在溫室接菌海島棉染色體片段導(dǎo)入系，篩選出抗V991、V07DF2和D80923個(gè)菌種的導(dǎo)入系IL095和抗V07DF2和D80922個(gè)菌株的導(dǎo)入系IL154。導(dǎo)入系IL095抗3個(gè)菌種的相對(duì)病指分別是24.55%(V991),27.45%(V07DF2)和25.16%(D8092)。導(dǎo)入系IL154抗3個(gè)菌種的相對(duì)病指分別是35.60%(V991)、19.56%(V07DF2)和14.05%(D8092)。導(dǎo)入系IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCNO.5574；導(dǎo)入系IL154為陸地棉(Gossypiumhirsutum.),2011年12月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCN0.5575。實(shí)施例2(1)2008年夏季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站分別種植IL095和ILlM各一行，IL095(CGMCCN0.5574)為母本，ILlM(CGMCCN0.5575)為父本配制雜交組合產(chǎn)生F1,成熟后全部混收。2008年冬季在海南三亞種植3行F1，自交獲得F2，成熟后全部混收。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。(2)分子標(biāo)記輔助選擇2009年夏季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站種植50行F2,每行10-12株，每株采集3-4片未展開(kāi)的葉片放入1.5ml的印pendorf管中，并加入預(yù)冷的新鮮配制的提取緩沖液600μ1，電鉆研磨，應(yīng)用CTAB法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis[J].PlantMolBiolR印，1993，11，2:122-127)提取DNA，采用IL095(CGMCCNO.5574)和IL154(CGMCCNO.5575)導(dǎo)入片段上的分子標(biāo)記(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10μ1，DNA模板1μ1，94°C預(yù)變性5min，94°C變性0.5min，57°C復(fù)性0.5min，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為0.5倍TBE，170V恒壓電泳1.5小時(shí)。選擇含有7個(gè)分子標(biāo)記的50個(gè)單株自交獲得F3，種子按單株收獲。(3)2009年冬季在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室將每一F3種植1行，每行15_25株，每株采集葉片，提取DNA后，利用表1提供的分子標(biāo)記確定F3株行的基因型，選擇7個(gè)標(biāo)記都是純合的株行(同時(shí)具有表1中來(lái)源于上述海島棉的7個(gè)分子標(biāo)記條帶)。表1IL095和IL154導(dǎo)入片段的SSR分子標(biāo)記權(quán)利要求1.一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于包含如下步驟(1)以保藏號(hào)為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號(hào)為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2,每代都是單株收獲；(2)分子標(biāo)記輔助第一次選擇F2種植，應(yīng)用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記引物對(duì)NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導(dǎo)入系ILlM對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記引物對(duì)BNL1034、NAU1366、BNL3171進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇同時(shí)含有上述7個(gè)來(lái)源于海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標(biāo)記引物對(duì)NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6，BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標(biāo)記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標(biāo)記引物對(duì)NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366、BNL3171確定F3單株的基因型，同時(shí)具有7個(gè)來(lái)源于上述海島棉的分子標(biāo)記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用海島棉染色體片段導(dǎo)入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個(gè)黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進(jìn)行抗病性篩選獲得抗多個(gè)黃萎病菌種的育成品系。全文摘要本發(fā)明屬于分子育種領(lǐng)域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。該方法是以保藏號(hào)為CGMCCNo.5574的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL095為母本，保藏號(hào)為CGMCCNo.5575的海島棉染色體片段導(dǎo)入系IL154為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；再以分子標(biāo)記輔助選擇獲得抗多菌種的棉花新品系。利用這一方法，已經(jīng)培育出抗多菌種的棉花新品系“南農(nóng)海導(dǎo)5號(hào)”。通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀，可在2-3年內(nèi)快速高效培育出抗多菌種的棉花新品系?！澳限r(nóng)海導(dǎo)5號(hào)”抗棉花黃萎病的相對(duì)病指為15.51％-20.97％。文檔編號(hào)A01H1/02GK102517396SQ20111045096公開(kāi)日2012年6月27日申請(qǐng)日期2011年12月29日優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日發(fā)明者張?zhí)煺?王鵬,郭旺珍申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)