專利名稱：在經(jīng)遺傳修飾的生物體中切除轉(zhuǎn)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及用于生成轉(zhuǎn)基因植物的組合物和方法。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物包含一種或多種感興趣的轉(zhuǎn)基因。在某些實(shí)施方案中，在花粉和/或種子中指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的切除，使得由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物生成的花粉和/或種子基本上沒(méi)有轉(zhuǎn)基因。在一些實(shí)施方案中，例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可用于實(shí)現(xiàn)感興趣的轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的生物限制(bioconfinement)。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因的切除針對(duì)特定表達(dá)盒,諸如選擇標(biāo)志，使得僅自轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因植物后代除去此表達(dá)盒。
背景技術(shù)：
許多植物用來(lái)自其它物種的基因遺傳轉(zhuǎn)化以導(dǎo)入期望的性狀，諸如以經(jīng)由例如改善營(yíng)養(yǎng)價(jià)值質(zhì)量、提高產(chǎn)量、賦予有害物或疾病抗性、提高干旱和應(yīng)激耐受性、改善園藝質(zhì)量諸如色素沉著和生長(zhǎng)、和/或賦予除草劑抗性；實(shí)現(xiàn)自植物生成工業(yè)上有用的化合物和/或材料；和/或?qū)崿F(xiàn)藥物的生成來(lái)改善農(nóng)業(yè)價(jià)值?？寺』?qū)χ参锛?xì)胞的導(dǎo)入和穩(wěn)定的能育轉(zhuǎn)基因植物的回收可以用于進(jìn)行植物的此類修飾，并且已經(jīng)容許經(jīng)由遺傳工程(例如作物改良)將期望的感興趣的性狀或質(zhì)量摻入植物中。在這些方法中，通常將外來(lái)DNA導(dǎo)入真核植物細(xì)胞的核或質(zhì)體DNA中，接著分離含有整合入細(xì)胞的DNA中的外來(lái)DNA的細(xì)胞，以生成經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。關(guān)于使用轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)的一項(xiàng)缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因逃脫至野生物種和非轉(zhuǎn)化物種的可能性。這些性狀可以增加異型雜交、持久性、和轉(zhuǎn)基因?qū)︵徑后w的基因滲入(introgression)的風(fēng)險(xiǎn)。轉(zhuǎn)基因自遺傳改良(GM)作物的逃脫通常經(jīng)由基因流動(dòng)，主要通過(guò)異花傳粉發(fā)生(Lu(2003)Eviron. Biosafety Res. 2:3-8),但是也可以經(jīng)由基因滲入發(fā)生。Stewart Jr.等(2003)Nat. Reviews Gen. 4:806-17。作物間基因流動(dòng)會(huì)導(dǎo)致對(duì)非 GM品種(variety)的污染，影響給定農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因作物品種的策略開(kāi)發(fā)。用轉(zhuǎn)基因材料對(duì)非GM作物的顯著污染由于許多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)口的法律限制而在國(guó)際貿(mào)易中造成困難。若轉(zhuǎn)基因賦予多種抗性(例如，針對(duì)除草劑、有害物和/或疾病)，則作物間基因流動(dòng)可以引起轉(zhuǎn)基因在可能潛在地變?yōu)樽陨s草的雜種中疊加。另外，作物間基因流動(dòng)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因逃脫至雜草似的群體或相關(guān)野生物種中，若轉(zhuǎn)基因經(jīng)由有性生殖和/或無(wú)性繁殖在雜草似的/野生的群體中持續(xù)并建立，則這會(huì)造成嚴(yán)重的雜草問(wèn)題和其它生態(tài)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)。這在逃脫的基因增強(qiáng)雜草似的/野生的物種的生態(tài)學(xué)適合度時(shí)是一項(xiàng)特別的憂慮。作物轉(zhuǎn)基因的基因滲入在牽涉幾個(gè)連續(xù)雜種世代的步驟中發(fā)生?；驖B入是一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，其在轉(zhuǎn)基因在接受物種的遺傳背景中固定前可能花費(fèi)多年和多代，并且如此呈現(xiàn)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的困難。然而，若選擇是強(qiáng)的和/或群體大小較小，則可以快速發(fā)生基因滲入基因的固定。
遺傳修飾植物內(nèi)特定表達(dá)盒，尤其是選擇標(biāo)志表達(dá)盒的污染是一項(xiàng)易忘的目的。選擇標(biāo)志基因通常抗生素抗性或除草劑耐受性基因，但是可以包括報(bào)告基因(即，葡糖醛酸糖苷酶(Graham 等(1989) Plant Cell Tiss. Org. 20 (I) : 35-39)。共轉(zhuǎn)移入植物的基因組中的選擇標(biāo)志提供選擇優(yōu)勢(shì)，并且容許鑒定經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物?？梢杂糜谵D(zhuǎn)化植物的功能性選擇標(biāo)志基因的利用度稍微受到限制。發(fā)表的關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物植物的科學(xué)文獻(xiàn)的綜述揭示了抗生素抗性的最廣泛使用的選擇劑是卡那霉素(由新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II型基因編碼(Bevan等(1983)Nature 304:184-187))或潮霉素(由潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因編碼(Waldron等，Plant Mol. Biol. 5:103-108))，并且除草劑耐受性是草胺勝(phosphinothricin)抗性(由 pat (Wohlleben 等(1988) Gene 70:25-37)或 bar 基因(DeBlock 等(1987), EMBO J. 6 (9) :2513-2518)編碼)。見(jiàn) Sundar 等(2008) J. PlantPhysiol. 165:1698-1716。鑒于有限數(shù)目的選擇標(biāo)志基因和通常使用這些性狀的亞組，容許切除并再使用轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的選擇標(biāo)志的解決辦法會(huì)消除在對(duì)同一植物的基因轉(zhuǎn)移或基因疊加的后續(xù)輪次中對(duì)其它選擇標(biāo)志的需要。此外，切除選擇標(biāo)志的能力可以克服對(duì)植物轉(zhuǎn)錄物組(transcriptome)的無(wú)意改變,其通過(guò)表達(dá)標(biāo)志物引起(Abdeen等(2009)PlantBiotechnol. J. 7(3):211-218)。
目前用于阻止GM作物與其它物種和品種間的基因流動(dòng)或使其最小化的策略包括(1)物理分離轉(zhuǎn)基因作物；(2)轉(zhuǎn)基因的葉綠體工程化；(3)緩解基因(mitigationgene)及轉(zhuǎn)基因的共工程化改造；(4)遺傳用途限制技術(shù)(genetic use restrictiontechnology, GURT) ； (5) CRE/loxP和FLP/FRT重組酶介導(dǎo)的基因刪除。見(jiàn)例如Lee和Natesan (2006) TRENDS Biotech. 24 (3) : 10914; Lu (2003),見(jiàn)上文；及 Luo 等(2007), PlantBiotech. J. 5:263-74;和(6)大范圍核酸酶介導(dǎo)的基因刪除。見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)No. 11/910, 515 ;和美國(guó)專利申請(qǐng) No. 12/600,902。已經(jīng)利用CRE、FLP、和R重組酶自植物切除不想要的遺傳物質(zhì)。Hare和Chua(2002)Nat. Biotech. 20:575-80。Luo等(2007)，見(jiàn)上文報(bào)告了花粉和種子特異性“GM基因刪除物(deletor) ”系統(tǒng)，其中使用IoxP FRT融合序列作為CRE或FLP重組酶切除轉(zhuǎn)基因的識(shí)別位點(diǎn)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因自轉(zhuǎn)基因煙草植物的花粉或自花粉和種子兩者的刪除。顯示在植物中發(fā)揮功能的所有這些位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)是整合酶家族的成員。至少部分由于其它重組酶可能需要輔助蛋白和可以對(duì)重組效率賦予拓?fù)鋵W(xué)限制的更復(fù)雜的識(shí)別位點(diǎn)的實(shí)情，已經(jīng)選擇這些系統(tǒng)進(jìn)行使用。同上文。這些系統(tǒng)具有幾個(gè)重大的缺點(diǎn)整合酶型重組酶也可以識(shí)別“假序列”，其可以與特定的靶序列高度趨異，并且因此導(dǎo)致不想要的非特異性DNA刪除；并且靶序列的切除留下殘留的識(shí)別序列，其可以是后續(xù)暴露于重組酶后染色體重排的位點(diǎn)，或者激活基因沉默機(jī)制。同上文。此外，這些系統(tǒng)進(jìn)一步受到限制，因?yàn)楸仨毚嬖诠δ苄灾亟M酶，并且其在親本植物之一中表達(dá)，其存在需要花粉和/或種子內(nèi)刪除的其它策略。盡管有這些限制，CRE/loxP系統(tǒng)被認(rèn)為是用于優(yōu)化植物中的基因刪除的最合適的策略。同上文。定制設(shè)計(jì)的鋅指核酸酶(ZFN)是為了遞送DNA中靶定位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂，隨后重組切割末端設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)。ZFN組合FokI限制性內(nèi)切核酸酶的非特異性切割域與鋒指 DNA 結(jié)合蛋白。見(jiàn)例如 Huang 等(1996) J. Protein Chem. 15:481-9; Kim 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20 ; Kim 等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:1156-60;Kim 等(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-7;Kim 等(1997b)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 94:12875-9;Kim 等(1997c)Gene 203:43-9;Kim 等(1998)Biol.Chem. 379:489-95;Nahon 和 Raveh(1998)Nucleic Acids Res. 26:1233-9;Smith 等(1999)Nucleic Acids Res. 27:674-81。各個(gè)鋅指基序可以設(shè)計(jì)為靶向并結(jié)合大范圍的DNA位點(diǎn)。Cys2His2鋅指蛋白通過(guò)將α -螺旋插入雙螺旋的大溝中結(jié)合DNA。鋅指對(duì)DNA的識(shí)別是模塊的每個(gè)指主要接觸靶物中的三個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)，并且蛋白質(zhì)中的幾個(gè)關(guān)鍵殘基介導(dǎo)識(shí)另O。已經(jīng)顯示了 FokI限制性內(nèi)切核酸酶必須經(jīng)由核酸酶域二聚化以切割DNA，誘導(dǎo)雙鏈斷裂。類似地，ZFN也需要核酸酶域的二聚化以切割DNA。Mani等(2005) Biochem. Biophys.Res. Commun. 334:1191-7; Smith 等(2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-9。ZFN 的二聚化由兩個(gè)相鄰的、相反取向的結(jié)合位點(diǎn)促進(jìn)。同上文。另外，由鋅指核酸酶引起的雙鏈斷裂通過(guò)植物DNA修復(fù)機(jī)器經(jīng)由非同源末端連接(NHEJ)或同源性指導(dǎo)的修復(fù)(HDR)解決，由此生成沒(méi)有殘留識(shí)別序列的植物。發(fā)明概述依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于刪除植物中的DNA區(qū)的方法，其中 能活植物(viable plant)含有基因組DNA，所述基因組DNA包含DNA區(qū)；在含有所述基因組DNA的所述能活植物中導(dǎo)入或表達(dá)工程化改造成在識(shí)別序列處切割所述基因組DNA的鋅指核酸酶；由此導(dǎo)致在識(shí)別序列處對(duì)所述基因組DNA的切割，導(dǎo)致所述基因組DNA的切除，其中所述DNA區(qū)不存在于所述基因組DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于刪除植物中的DNA區(qū)的方法包括提供含有基因組DNA的第一能活植物，所述基因組DNA包含所述DNA區(qū)及在所述DNA區(qū)的3’端側(cè)翼的第一識(shí)別序列和在5’端側(cè)翼的第二識(shí)別序列。提供含有基因組DNA的第二能活植物，所述基因組DNA包含編碼工程化改造為在所述識(shí)別序列處切割所述基因組DNA的鋅指核酸酶的DNA。將所述第一和第二能活植物雜交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成Fl種子。種植含有基因組DNA的所得Fl植物，其中所述DNA區(qū)不存在于所述基因組DNA。在某些實(shí)施方案中，所述第一識(shí)別序列和所述第二識(shí)別序列是相同的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含由鋅指核酸酶識(shí)別的第一核酸序列；感興趣的基因；和由鋅指核酸酶識(shí)別的第二核酸序列，其中所述感興趣的基因側(cè)翼有由鋅指核酸酶識(shí)別的所述第一和第二核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一識(shí)別序列和第二識(shí)別序列側(cè)翼可以有同源序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，生成轉(zhuǎn)基因植物的方法包括用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織，并再生全植物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，用于降低感興趣的基因?qū)ζ渌参飩鞑サ姆椒ò▽⑷参锱c自用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織再生的植物雜交，所述分離的核酸分子包含與鋅指核酸酶可操作連接的花粉特異性啟動(dòng)子，其中在源自所述雜交的后代的花粉中特異性切除所述感興趣的基因。栽培源自所述雜交的后代。在此實(shí)施方案中，分離的核酸分子包含啟動(dòng)子和編碼鋅指核酸酶的核酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述編碼鋅指核酸酶的核酸序列可操作連接，且生成轉(zhuǎn)基因植物的方法包括用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織，并再生全植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于在含有核酸分子的植物中刪除DNA區(qū)的方法，所述核酸分子包含由鋅指核酸酶識(shí)別的第一核酸序列；選擇標(biāo)志基因表達(dá)盒；和由鋅指核酸酶識(shí)別的第二核酸序列，其中所述選擇標(biāo)志側(cè)翼有由鋅指核酸酶識(shí)別的所述第一和第二核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列側(cè)翼有同源序列。另夕卜，在能活植物細(xì)胞中表達(dá)或?qū)牍こ袒脑斐稍谧R(shí)別序列處切割基因組DNA的鋅指核酸酶，由此導(dǎo)致在識(shí)別序列處對(duì)所述基因組DNA的切割，導(dǎo)致所述基因組DNA的切除，其中所述選擇標(biāo)志不存在于所述基因組DNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鋅指核酸酶單體的每一半分開(kāi)表達(dá)，并且在彼此聯(lián)合配對(duì)時(shí)形成功能性復(fù)合物。例如，將表達(dá)一個(gè)鋅指核酸酶單體(其由與FokI內(nèi)切核酸酶可操作連接的鋅指結(jié)合基序組成)的植物轉(zhuǎn)錄單元穩(wěn)定整合入一個(gè)親本Pl中，并將表達(dá)第二單體的植物轉(zhuǎn)錄單元穩(wěn)定整合入第二親本P2中。Plx P2的有性雜交生成含有這兩個(gè)鋅指單體的后代植物。所得的鋅指核酸酶二聚體能夠結(jié)合鋅指結(jié)合位點(diǎn)，并且形成具有切割活性的復(fù)合物。鑒于FokI內(nèi)切核酸酶作為二聚體是有活性的(Bitinaite等(1998)Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95:10，570 10，575)，切割活性僅能夠在含有這兩個(gè)功能性表達(dá)單體的后代內(nèi)出現(xiàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，鋅指核酸酶在識(shí)別序列處的切除導(dǎo)致形成切割連接，其沒(méi) 有殘留的識(shí)別序列。切割連接可以不被初始鋅指核酸酶結(jié)合并切割。另外，切割連接可以是非同源末端連接(NHEJ)的結(jié)果或位于5’識(shí)別序列上游和3’識(shí)別序列下游的兩個(gè)DNA同源區(qū)間的同源性指導(dǎo)的修復(fù)的結(jié)果或另一種未描述的DNA修復(fù)機(jī)制的結(jié)果?？梢詫⑼葱蛄蟹胖玫浇Y(jié)合位點(diǎn)外部，使得在切割后，可以發(fā)生同源性指導(dǎo)的修復(fù)。這是重組酶系統(tǒng)的改善，所述重組酶系統(tǒng)總是留下用于得到切除的位點(diǎn)的殘留。在又一個(gè)實(shí)施方案中，切除植物中感興趣的天然基因的方法包括用包含編碼鋅指核酸酶的核酸序列的分離的核酸分子或編碼鋅指核酸酶的分離的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)化包含感興趣的基因的植物細(xì)胞或組織，其中所述鋅指核酸酶識(shí)別在所述感興趣的天然基因側(cè)翼的核酸序列，并特異性切除感興趣的天然基因。然后，再生全植物。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)將表達(dá)鋅指核酸酶的植物與靶植物雜交實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因切除。附圖簡(jiǎn)述 圖I包括質(zhì)粒pDAS5380的質(zhì)粒圖。圖2包括質(zhì)粒pDAS5381的質(zhì)粒圖。圖3a是T-DNA插入物的示意圖和限制圖。圖3b包括幾幅小圖，其描繪了用于鑒定含有來(lái)自依照本發(fā)明的實(shí)施方案的質(zhì)粒PDAS5380的全長(zhǎng)完整PTU的事件的TO Southern印跡分析。TO Southern印跡分析圖像使用限制酶MfeI和NsiI消化pDAS5380事件,通過(guò)⑶S和PAT的共雜交顯示顯示完整的T-DNA插入物。圖4A是T-DNA插入物的示意圖和限制圖。圖4b包括幾幅小圖，其描繪了用于鑒定含有來(lái)自依照本發(fā)明的實(shí)施方案的質(zhì)粒PDAS5381的全長(zhǎng)完整PTU的事件的TO Southern印跡分析。TO Southern印跡分析圖像使用限制酶MfeI和NsiI消化pDAS5381事件,通過(guò)HptII雜交顯示顯示完整的T-DNA插入物。圖5包括對(duì)代表依照本發(fā)明的實(shí)施方案的較大樣品的選擇組的事件的Southern印跡分析。選擇這些樣品以例示切除的片段(即，較低分子片段)、非切除片段(即，較高分子量片段)、和含有切除的和非切除的片段兩者的嵌合事件。另外，包括野生型基因組DNA對(duì)照和IOOpg pDAS5380質(zhì)粒。此數(shù)據(jù)與⑶S表達(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。經(jīng)由組織化學(xué)染色在⑶S方面不呈陽(yáng)性染色的事件不含全長(zhǎng)的完整的⑶S PTU表達(dá)盒。
圖6包括含有依照本發(fā)明的實(shí)施方案的Southern印跡實(shí)驗(yàn)中使用的基因組DNA樣品的PCR擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠的圖像。這些PCR擴(kuò)增子顯示切除的片段(即，較低分子量片段)、非切除片段(即，較高分子量片段)、和含有切除的和非切除的片段兩者的嵌合事件。另外，包括野生TO植物對(duì)照；這些反應(yīng)中擴(kuò)增較大的完整⑶S PTU表達(dá)盒。還包括陰性對(duì)照，其中使用野生型基因組DNA和無(wú)DNA (H20)進(jìn)行PCR反應(yīng)。此數(shù)據(jù)與⑶S表達(dá)數(shù)據(jù)和Southern印跡數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。圖7a和7b包括2. 4kb條帶的序列分析的比對(duì)，其顯示依照本發(fā)明的實(shí)施方案的GUS表達(dá)盒的刪除。粗體序列標(biāo)示At肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和MAR基因元件。用下劃線和斜體鑒定CCR5結(jié)合位點(diǎn)。雖然每種事件將多種擴(kuò)增子生成并測(cè)序，但是在圖中僅比對(duì)一種擴(kuò)增子。圖8包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“完整”Fl雜種的F2后代的PCR分析。圖9包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“完整"Fl雜種的F2后代的Southern分析。


圖10包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“切除”Fl雜種的F2后代的PCR分析。
圖11包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“切除”Fl雜種的F2后代的Southern分析。
圖12包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“嵌合”Fl雜種的F2后代的PCR分析。
圖13包括對(duì)依照本發(fā)明的實(shí)施方案的“嵌合”Fl雜種的F2后代的Southern分析。序列表使用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫顯示所附序列表中所列的核酸序列。僅顯示每種核酸序列的一條鏈，但是互補(bǔ)鏈理解為通過(guò)任意參考展示鏈而包括在內(nèi)。在所附序列表中SEQ ID NO: I 顯示了 CCR5ZFN 結(jié)合位點(diǎn)。SEQ ID N0:2顯示了 CCR5鋅指核酸酶基因序列。SEQ ID NO:3 顯示了 TQPATS 引物。SEQ ID NO:4 顯示了 TQPATA 引物。SEQ ID NO:5 顯示了 TQPATFQ 引物。SEQ ID NO:6 顯示了 TQPALS 引物。SEQ ID NO:7 顯示了 TQPALA 引物。SEQ ID NO:8 顯示了 TQPALFQ 引物。SEQ ID NO:9 顯示了 HPT2S 引物。SEQ ID NO: 10 顯示了 HPT2A 引物。SEQ ID NO: 11 顯示了 HPTFQ 引物。SEQ ID NO: 12 顯示了 Fokl_UPL_F 引物。SEQ ID NO: 13 顯示了 Fokl_UPL_R 引物。SEQ ID NO: 14 顯示了 BY2ACT89S 引物。SEQ ID NO: 15 顯示了 BY2ACT89A 引物。SEQ ID NO: 16顯示了用于PTU PCR分析的正向PCR引物。SEQ ID NO: 17顯示了用于PTU PCR分析的反向PCR引物。
SEQ ID NO: 18 顯示了 BYACTFQ 引物。發(fā)明詳述本文中公開(kāi)了一種自經(jīng)遺傳修飾的生物體中的特定植物組織切除基因的方法。在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種ZFN(鋅指核酸酶)自特定植物組織除去轉(zhuǎn)基因作為降低基因?qū)Ψ荊M作物流動(dòng)的手段。在一些實(shí)施方案中，除去的轉(zhuǎn)基因是選擇標(biāo)志基因盒。在某些實(shí)施方案中，特定的植物組織是花粉。在一些實(shí)施方案中，一種或多種ZFN可以與不同組織特異性啟動(dòng)子可操作連接。在這些和其它實(shí)施方案中，可以將與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的所述一種或多種ZFN之一轉(zhuǎn)化入一個(gè)親本植物系中，并可以將與不同組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的所述一種或多種ZFN之另一種轉(zhuǎn)化入第二親本植物系中。含有一種或多種ZFN之每種的親本系間雜交可以生成Fl系，其含有在識(shí)別序列處切割DNA的功能性ZFN。識(shí)別序列可以在植物DNA中轉(zhuǎn)基因側(cè)翼(flank)。
組織特異性基因切除可以通過(guò)組織特異性植物啟動(dòng)子與ZFN的可操作連接實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，組織特異性啟動(dòng)子與一種或多種ZFN的可操作連接導(dǎo)致組織特異性一種或多種ZFN的表達(dá)，由此切除位于特定組織中識(shí)別序列間的ZFN、選擇標(biāo)志、和/或任何基因或核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，在同一植物內(nèi)表達(dá)一種或多種ZFN。ZFN可以與在植物的較晚發(fā)育階段期間驅(qū)動(dòng)ZFN表達(dá)的啟動(dòng)子可操作連接。在這些和其它實(shí)施方案中，一種或多種功能性ZFN可以切割在一種或多種轉(zhuǎn)基因側(cè)翼的特異性識(shí)別序列，由此在植物發(fā)育的較晚階段期間自植物組織除去一種或多種轉(zhuǎn)基因?？s寫GM經(jīng)遺傳修飾的PTU植物轉(zhuǎn)錄單元ZF 鋅指ZFN鋅指核酸酶ZFP鋅指蛋白術(shù)語(yǔ)基因表達(dá)將核酸轉(zhuǎn)錄單元(包括例如，基因組DNA或cDNA)的編碼信息轉(zhuǎn)化成細(xì)胞的操作的、非操作的、或結(jié)構(gòu)的部分的過(guò)程，經(jīng)常包括蛋白質(zhì)的合成?；虮磉_(dá)可以受到外部信號(hào)影響；例如，將細(xì)胞、組織、或生物體暴露于提高或降低基因表達(dá)的媒介物?；虮磉_(dá)也可以在從DNA至RNA至蛋白質(zhì)的途徑中的任何地方受到調(diào)節(jié)。例如經(jīng)由對(duì)轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和加工、對(duì)中間分子諸如mRNA的降解起作用的控制，或者經(jīng)由特定蛋白質(zhì)分子在它們生成后的活化、滅活、區(qū)室化(compartmentalization)、或降解,或者通過(guò)其組合發(fā)生基因表達(dá)的調(diào)節(jié)?；虮磉_(dá)可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白質(zhì)水平測(cè)量基因表達(dá)，包括但不限于Northern印跡、RT-PCR> Western印跡、或體外、原位、或體內(nèi)蛋白質(zhì)活性測(cè)定法。雜交寡核苷酸及其類似物通過(guò)互補(bǔ)堿基間的氫鍵合(其包括沃森-克里克(Watson Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵合)雜交。一般地，核酸分子由作為卩密唳(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G))的含氮堿基組成。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤間形成氫鍵，并且嘧啶與嘌呤的鍵合稱為“堿基配對(duì)”。更具體地，A或與T或U氫鍵合，而G會(huì)與C鍵合?！盎パa(bǔ)的”指兩種獨(dú)特的核酸序列或相同核酸序列的兩個(gè)獨(dú)特區(qū)間發(fā)生的堿基配對(duì)?！翱商禺愋噪s交的”和“特異性互補(bǔ)的”是指足夠的互補(bǔ)性程度，使得在寡核苷酸和DNA或RNA靶物間發(fā)生穩(wěn)定的且特異性的結(jié)合的術(shù)語(yǔ)。寡核苷酸與要可特異性雜交的其靶序列不需要是100%互補(bǔ)的。在寡核苷酸對(duì)靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能，并且有足夠的互補(bǔ)性程度以避免寡核苷酸在期望特異性結(jié)合的條件下，例如，在體內(nèi)測(cè)定法或系統(tǒng)的情況中在生理學(xué)條件下與非靶序列的非特異性結(jié)合時(shí)，寡核苷酸是可特異性雜交的。此類結(jié)合稱為特異性雜交。導(dǎo)致特定嚴(yán)格性程度的雜交條件會(huì)隨選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸序列的組成和程度而有所變化。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是Na+和/或Mg2+濃度)會(huì)促成雜交的嚴(yán)格性，盡管清洗次數(shù)也影響嚴(yán)格性。關(guān)于獲得特定的嚴(yán)格性程度需要的雜交條件的計(jì)算在 Sambrook 等(編)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989，第9章和第11章中討論。出于本公開(kāi)內(nèi)容的目的，“嚴(yán)格條件”涵蓋若雜交分子與靶序列間存在有小于25%錯(cuò)配會(huì)發(fā)生雜交的條件?！皣?yán)格條件”可以進(jìn)一步限定成特定的嚴(yán)格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等嚴(yán)格性”條件是具有超過(guò)25%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；“中間嚴(yán)格性”條件是具有超過(guò)15%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件，而“高嚴(yán)格性”條件是具有超過(guò)10%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件。“極高嚴(yán)格性”條件是具有超過(guò)6%錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件。在具體的實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件是于65° C雜交，接著于65° C用
O.lxSSC/0. 1%SDS連續(xù)清洗40分鐘。分離的“分離的”生物組分(諸如核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)與該組分天然存在的生物體細(xì)胞中的其它生物組分，即，其它染色體和染色體外DNA和RNA及蛋白質(zhì)基本上分開(kāi)、離開(kāi)其生成、遠(yuǎn)離其純化。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。核酸分子核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈兩者，和上述物質(zhì)的合成形式和混合聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一類核苷酸的修飾形式。如本文中使用的，“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義的。該術(shù)語(yǔ)包括單和雙鏈形式的DNA。核酸分子可以包括通過(guò)天然存在的和/或非天然存在的核苷酸聯(lián)接連接在一起的天然存在的和經(jīng)修飾的核苷酸中的任一種或兩種。核酸分子可以是經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾的，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易領(lǐng)會(huì)的。此類修飾包括例如，標(biāo)記、甲基化、用類似物替代一種或多種天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，諸如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電荷的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂的模塊(例如，肽)、插入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素(psoralen)等)、螯合劑、烷化齊U、和經(jīng)修飾的連接(例如，α異頭核酸等)。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”還包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾的、環(huán)狀、和掛鎖的構(gòu)象。
可操作連接的在第一核酸序列在與第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可存在連接。例如，在啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列可操作連接。在重組生成時(shí)，可操作連接的核酸序列一般是連續(xù)的，且在必需連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的情況中，處于相同閱讀框中。然而，元件不需要為了是可操作連接的而是連續(xù)的。啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄需要的一般位于上游(朝向基因的5’區(qū))的DNA區(qū)。啟動(dòng)子容許其控制的基因的正確活化或阻抑。啟動(dòng)子含有轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的特定序列。這些因子結(jié)合啟動(dòng)子DNA序列，并且導(dǎo)致RNA聚合酶，即自基因的編碼區(qū)合成RNA的酶的募集。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用組織特異性啟動(dòng)子，例如，花粉特異性啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子是在相對(duì)于生物體的其它組織而言啟動(dòng)子是特異性的組織中指導(dǎo)關(guān)聯(lián)基因的較高水平轉(zhuǎn)錄的DNA序列。組織特異性啟動(dòng)子的例子包括絨氈層特異性啟動(dòng)子；花藥特異性啟動(dòng)子；花粉特異性啟動(dòng)子(見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 7，141，424和國(guó)際PCT公開(kāi)文本No. WO99/042587);胚珠特異性啟動(dòng)子(見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)No. 2001/047525 Al);果實(shí)特異性啟動(dòng)子(見(jiàn)例如美國(guó)專利No. 4，943，674和5，753，475);和種子特異性啟動(dòng)子(見(jiàn)例如，美國(guó)專利No. 5，420，034和5，608，152)。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中使用發(fā)育階段 特異性啟動(dòng)子，例如，在較晚的發(fā)育階段有活性的啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)化的在病毒或載體將核酸分子轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中時(shí)其“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”細(xì)胞。在核酸分子通過(guò)將核酸分子整合入細(xì)胞基因組中，或者通過(guò)附加體復(fù)制被細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制時(shí)，細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸分子“轉(zhuǎn)化”。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”涵蓋可以將核酸分子導(dǎo)入此類細(xì)胞中的所有技術(shù)。例子包括但不限于用病毒載體轉(zhuǎn)染、用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、電穿孔(Fromm 等(1986) Nature 319:791-3)、脂轉(zhuǎn)染(Feigner 等(1987) Proc. Natl. Acad.Sci.USA84:7413-7)、微注射(Mueller 等(1978)Cell 15:579-85)、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(Fraley 等(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)、直接的 DNA 攝取、和微粒轟擊(Klein 等(1987)Nature 327:70)。轉(zhuǎn)基因外源核酸序列。在一個(gè)例子中，轉(zhuǎn)基因是基因序列(例如，除草劑抗性基因)、編碼工業(yè)或藥學(xué)上有用的化合物的基因、或編碼期望的農(nóng)業(yè)性狀的基因。在又一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因是反義核酸序列，其中反義核酸序列的表達(dá)展現(xiàn)出靶核酸序列的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可以含有與轉(zhuǎn)基因可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。載體如導(dǎo)入細(xì)胞中，由此生成經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的核酸分子。載體可以包括容許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制起點(diǎn)。例子包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、或?qū)⑼庠碊NA攜帶到細(xì)胞中的病毒。載體還可以包含一種或多種基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志基因和本領(lǐng)域中已知的其它遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、或感染細(xì)胞，由此引起細(xì)胞表達(dá)由載體編碼的核酸分子和/或蛋白質(zhì)。任選地，載體包含幫助實(shí)現(xiàn)核酸分子進(jìn)入細(xì)胞中的材料(例如，脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)編碼等)。Zn指核酸酶介導(dǎo)的自植物切除轉(zhuǎn)基因本文中公開(kāi)了用于生成具有降低的轉(zhuǎn)基因逃脫的植物的方法以及通過(guò)此類方法生成的植物，和自其衍生的植物材料，例如種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使植物與載體接觸，其中所述載體包含與一種或多種組織特異性啟動(dòng)子(例如花粉特異性啟動(dòng)子)可操作連接的一種或多種鋅指核酸酶(ZFN)。此載體的表達(dá)導(dǎo)致ZFN在特定組織中的生成，其中其可操作連接的啟動(dòng)子是有活性的?？梢詫FN設(shè)計(jì)或工程化改造為識(shí)別在期望切割的核酸序列側(cè)翼的切割序列。然后，ZFN在啟動(dòng)子有活性的特定組織中生成，導(dǎo)致在由ZFN識(shí)別的切割序列間的核酸序列的切除，由此生成含有沒(méi)有殘留識(shí)別序列的切割連接的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使植物與載體接觸，其中載體包含與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的一種或多種ZFN ;感興趣的基因；任選地，可以與感興趣的基因可操作連接的一種或多種調(diào)節(jié)元件；和在感興趣的基因和一種或多種調(diào)節(jié)元件側(cè)翼的由ZFN識(shí)別的一種或多種切割序列。此載體的表達(dá)導(dǎo)致ZFN在其可操作連接的啟動(dòng)子有活性的特定組織中的生成。然后，ZFN在啟動(dòng)子有活性的特定組織中生成，導(dǎo)致切割在由ZFN識(shí)別的切割序列間的核酸序列，其包含感興趣的基因和任選地，一種或多種調(diào)節(jié)元件。在又一些實(shí)施方案中，所述方法包括使植物與載體接觸，其中載體包含與在植物發(fā)育的特定時(shí)期有活性的啟動(dòng)子(例如，在相對(duì)晚期的發(fā)育階段驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子)可操作連接的一種或多種鋅指核酸酶(ZFN)。此載體的表達(dá)導(dǎo)致ZFN在特定發(fā)育期期間的生成，其中其可操作連接的啟動(dòng)子是有活性的?？梢詫FN設(shè)計(jì)并工程化改造為識(shí)別在期望切除 的核酸序列側(cè)翼的切割序列。ZFN在啟動(dòng)子有活性的發(fā)育階段的生成導(dǎo)致切除由ZFN識(shí)別的切割序列間的核酸序列。在又一些實(shí)施方案中，所述方法包括使植物與載體接觸，其中所述載體包含與在植物發(fā)育的特定時(shí)期有活性的啟動(dòng)子可操作連接的一種或多種ZFN ;感興趣的基因；任選地，可以與感興趣的基因可操作連接的一種或多種調(diào)節(jié)元件；和在感興趣的基因和一種或多種調(diào)節(jié)元件側(cè)翼的由ZFN識(shí)別的一種或多種切割序列。此載體的表達(dá)導(dǎo)致ZFN在特定發(fā)育期期間的生成，其中其可操作連接的啟動(dòng)子是有活性的。ZFN在其可操作連接的啟動(dòng)子有活性的特定發(fā)育期期間的生成導(dǎo)致切除由ZFN識(shí)別的切割序列間的核酸序列，其包含感興趣的基因和一種或多種調(diào)節(jié)元件。ZFN核酸酶在具體的實(shí)施方案中，自經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中的核酸分子表達(dá)ZFN以指導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中的核酸序列切除?？梢允褂冒邢蚬こ袒脑鞛樵谔囟ê怂嵝蛄?例如，轉(zhuǎn)基因、感興趣的基因、或選擇標(biāo)志基因)側(cè)翼的識(shí)別序列的ZFN或者ZFN可以設(shè)計(jì)為靶向在要切割的特定核酸序列側(cè)翼的天然存在的核酸序列。ZFN系統(tǒng)的精致的柔性和特異性提供先前通過(guò)已知的重組酶介導(dǎo)的基因切除策略不可實(shí)現(xiàn)的控制水平?？梢匀菀椎貞{實(shí)驗(yàn)操作ZFN的識(shí)別特異性。Wu等(2007) Cell. Mol. LifeSci. 64:2933-44。鋅指識(shí)別殘基的密碼子的隨機(jī)化容許選擇對(duì)任意選擇的DNA序列具有高親和力的新指。此外，已經(jīng)顯示了鋅指和天然的DNA結(jié)合分子及經(jīng)工程化改造的鋅指對(duì)活細(xì)胞中其設(shè)計(jì)的靶物起作用。如此，基于鋅指的核酸酶可靶向特異性的但任意的識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)嵌合鋅指核酸酶的切割域的二聚化的需要賦予高水平的序列特異性。因?yàn)槿齻€(gè)指的每組結(jié)合9個(gè)連續(xù)的堿基對(duì)，所以若每個(gè)鋅指域具有完全的特異性，則兩個(gè)嵌合核酸酶有效要求18bp靶物。此長(zhǎng)度的任何給定序列預(yù)測(cè)為在單一基因組內(nèi)是獨(dú)特的(假設(shè)約109bp) ο Bibikova 等(2001)Mol. Cell. Biol. 21 (I) :289-97;Wu 等(2007)，見(jiàn)上文。此外，其它指提供增強(qiáng)的特異性，Beerli 等(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14628-33;Kim和 Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2812-7; Liu 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci.USA94:5525-30,因此可以增加每個(gè)DNA結(jié)合域中的鋅指數(shù)目以提供甚至進(jìn)一步的特異性。例如，可以通過(guò)使用識(shí)別24bp序列的一對(duì)4指ZFN來(lái)進(jìn)一步提高特異性。Urnov等(2005)Nature 435:646-51。相對(duì)于α -螺旋的起始在ZFN中第I位、第2位、第3位和第6位的關(guān)鍵氨基酸通過(guò)鋅指基序貢獻(xiàn)大多數(shù)特異性相互作用。Pavletich和Pabo (1991)Science252:80917;Shi 和 Berg(1995)Chem. Biol. 2:83 9。可以改變這些氨基酸，而將剩余的氨基酸作為共有主鏈維持，以生成具有不同和/或新型序列特異性的ZFP。見(jiàn)例如Choo和 Klug(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 91:11163-7;Desjarlais 和 Berg(1992)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89: 7345-9 ; Des jarIais 和 Berg (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2256-60;Greisman 和 Pabo (1997)Science275:657-61;Isalan 等(1998)Biochemistry37:12026-33;Jamieson等(1994)Biochemistry 33:5689-95; Rebar和 Pabo(1994)Science263:671-3;Segal等(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2758-63;Wolfe等(1999)J. Mol.Biol. 285:1917-34;Wu 等(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:344-8。此外，可以設(shè)計(jì)至少兩個(gè)具有不同序列特異性的3指ZFN，使得它們協(xié)作以產(chǎn)生切割。Smith等(2000)，見(jiàn)上文。可以通過(guò)確定一種或多種合適于識(shí)別特定核酸序列的ZF基序開(kāi)始用于構(gòu)建本發(fā)明的ZFN的設(shè)計(jì)和選擇方法?；蛘?，可以使用識(shí)別特定核酸序列的ZFN來(lái)構(gòu)建核酸分子，其包含特定核酸序列(例如，其中特定核酸序列在感興趣的基因側(cè)翼)和其它元件(在需要時(shí))。已經(jīng)綜述了 ZFP的設(shè)計(jì)和各種選擇方法，包括噬菌體展示方法。Mani等(2005)，見(jiàn)上文；Durai 等(2005) Nucleic Acids Res. 33:5978-90; Isalan 等(2001) Nat.Biotechnol.19:65660;Kandavelou 等(2005)Nat.Biotechnol. 23:686-87;Pabo 等(2001)Annu. Rev. Biochem. 70:313-40; Segal 等(2003)Biochemistry 42:2137-48?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何設(shè)計(jì)和/或選擇方法來(lái)得到ZFN以在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用。例如，使用細(xì)菌單雜交和雙雜交系統(tǒng)的基于細(xì)胞的選擇策略可以用于生成高度特異性ZFP。Durai等(2006) Comb. Chem. High Throughput Screen. 9:301-11; Hurt 等(2003) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 100:12271-6; Joung 等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7。也可以通過(guò)定向域改組和基于細(xì)胞的選擇(其提供用于優(yōu)化多指ZFP的通用方法)獲得高度特異性ZFP。Hurt 等(2003)，見(jiàn)上文。基于設(shè)計(jì)和噬菌體展示方法的大量數(shù)據(jù)可用于特異性識(shí)別5’GNN 3’和5’ANN 3’三聯(lián)體的ZF模塊，并且較小程度上，5’ CNN 3’和5’ TNN 3’三聯(lián)體的ZF基序偏愛(ài)是已知的。見(jiàn)例如 Durai 等(2005)，見(jiàn)上文；Dreier 等(2001) J. Biol. Chem. 276:29466-78; Dreier等(2005)J. Biol. Chem. 280:35588-97;Dreier 等(2000)J. Mol. Biol. 303:489-502;Liu 等(2002) J. Biol. Chem. 277:3850-6。目前，兩種基于網(wǎng)絡(luò)的ZF設(shè)計(jì)軟件包是可獲得的(例如于zincfingertools. org)。前述物使基因組中編碼的幾乎所有基因可適應(yīng)于ZFN介導(dǎo)的基因革巴向。Katada 和 Komiyama (2009) Chembiochem. 10(8) : 1279-88。在具體的實(shí)施方案中，使用結(jié)合HIV共受體CCR5的ZFN。Perez等(2008)Nat.Biotechnol. 26:808-16。此ZFN稱作“CCR5ZFN”。在具體的實(shí)施方案中，CCR5ZFN編碼區(qū)包含不透明 2核定位序列(Maddaloni 等(1989)Nucleic Acids Res. 17(18) :7532) ；rl62yll鋒指結(jié)合域、FokI 核酸酶域(Looney 等(1989) Gene 80:193 208);源自 Thesoa assigna 病毒的 T2A stutter 序列(Mattion 等(1996) J. Virol. 70:8124-7);第二不透明 2 核定位序列、168FA vE鋅指結(jié)合域；和第二 FokI核酸酶域。核酸分子在一些實(shí)施方案中，所述方法包括具有一種或多種感興趣的基因(其可以賦予期望的性狀或表型)，諸如兩種或更多種感興趣的基因的第一植物與第二植物雜交。第二植物也可以具有一種或多種感興趣的基因。第一植物可以包含載體，其中該載體包含與一種或多種感興趣的基因可操作連接的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。編碼感興趣的基因的核酸序列側(cè)翼可以有ZFN識(shí)別位點(diǎn)。任選地，與感興趣的基因可操作連接的啟動(dòng)子和任何其它核酸序列(例如，調(diào)節(jié)序列)側(cè)翼也可以有ZFN識(shí)別位點(diǎn)。第二植物可以包含另一種載體，其可以包含與編碼ZFN的核酸序列可操作連接的組織特異性或發(fā)育特異性啟動(dòng)子?？梢詫⑤d體穩(wěn)定整合入這兩個(gè)植物的基因組中。在雜交第一和第二植物后，組織特異性或發(fā)育特異性啟動(dòng)子特異性驅(qū)動(dòng)ZFN在此類雜交的所得后代中的表達(dá)。ZFN在這些后代中的表達(dá)導(dǎo)致切除側(cè)翼有ZFN識(shí)別位點(diǎn)的核酸序列，由此減少或消除后代的特定組織和/或發(fā)育階段中感興趣的基因和任選地其它序列(諸如選擇標(biāo)志基因)。在一些實(shí)施 方案中，ZFN識(shí)別位點(diǎn)側(cè)翼可以進(jìn)一步有同源核酸序列以進(jìn)一步促進(jìn)同源DNA重組。感興趣的基因通常會(huì)以足夠的量與驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的一種或多種植物啟動(dòng)子可操作連接以賦予期望的性狀或表型。適合于這種和其它用途的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中公知的。描述此類啟動(dòng)子的非限制性例子包括美國(guó)專利No. 6，437，217 (玉米R(shí)S81啟動(dòng)子)；5，641，876 (稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子);6，426，446 (玉米R(shí)S324啟動(dòng)子);6，429，362 (玉米PR-I啟動(dòng)子);6，232，526 (玉米A3啟動(dòng)子);6，177，611 (組成性玉米啟動(dòng)子);5，322，938、5，352，605,5, 359，142、和 5，530，196 (35S 啟動(dòng)子)；6，433，252 (玉米 L3 油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)；6，429，357(稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子和稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)；5，837，848 (根特異性啟動(dòng)子);6，294，714(光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子);6，140，078 (鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子);6，252，138(病原性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6，175，060(磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)；6，388，170(雙向啟動(dòng)子)；6，635，806 (gamma-薏苡辛(coixin)啟動(dòng)子)；和美國(guó)專利申請(qǐng)流水號(hào)09/757，089 (玉米葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)。其它啟動(dòng)子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (16) : 5745-9);章魚(yú)堿合酶(OCS)啟動(dòng)子(其在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒(caulimovirus)啟動(dòng)子，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S 啟動(dòng)子(Lawton 等(1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24)；CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等(1985)Nature 313:810-2 ;玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子(Walker 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (19) : 6624-8);鹿糖合酶啟動(dòng)子(Yang 和Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8) ;R 基因復(fù)合物啟動(dòng)子(Chandler等(1989)Plant Cell 1:1175-83);葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子；CaMV35S (美國(guó)專利 No. 5，322，938，5，352，605，5，359，142 和 5，530，196) ；FMV35S (美國(guó)專利 No. 6，051，753和5，378，619) ；PC1SV啟動(dòng)子(美國(guó)專利No. 5，850, 019) ；SCP1啟動(dòng)子(美國(guó)專利No. 6, 677, 503);和 AGRtu. nos 啟動(dòng)子(GenBank 登錄號(hào) V00087; Depicker 等(1982) J. Mol.Appl. Genet. 1:56173;Bevan 等(1983)Nature 304:184-7)等?？梢匀芜x地與感興趣的基因可操作連接的其它遺傳元件包括編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。例如，已經(jīng)顯示了合適的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，諸如擬南芥(A. thaliana)EPSPS CTP(Klee等(1987)Mol. Gen. Genet. 210:437-42)和矮牽牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della Cioppa等(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:6873-7)的摻入將異源EPSPS蛋白序列靶向至轉(zhuǎn)基因植物中的葉綠體。也可以將麥草畏單加氧酶(Dicamba monooxygenase, DMO)祀向至葉綠體,如記載于國(guó)際PCT公開(kāi)文本No. WO 2008/105890的?？梢匀芜x地與感興趣的基因可操作連接的其它遺傳元件還包括位于啟動(dòng)子序列和功能為翻譯前導(dǎo)序列的編碼序列間的5’ UTR0翻譯前導(dǎo)序列存在于在翻譯起始序列上游的完全加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響前轉(zhuǎn)錄物(primary transcript)加工成mRNA、mRNA穩(wěn)定、和/或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導(dǎo)物(美國(guó)專利No. 5，362，865)、植物病毒殼體蛋白前導(dǎo)物、植物1*111^%0前導(dǎo)物等。見(jiàn)例如 Turner 和 Foster (1995)Molecular Biotech. 3 (3) : 225-36。5’UTR 的非限制性例子包括 GmHsp (美國(guó)專利 No. 5，659，122) ;PhDnaK (美國(guó)專利 No. 5，362，865) ；AtAntI ；TEV(Carrington 和 Freed(1990)J. Virol. 64:1590-7)；和 AGRtunos(GenBank 登錄號(hào)V00087 ;和 Bevan 等(1983)Nature 304:184-7)。可以任選地與感興趣的基因可操作連接的其它遺傳元件還包括3’非翻譯序列、 3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于多核苷酸分子下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號(hào)的多核苷酸、和/或能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、或基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)信號(hào)。多腺苷酸化信號(hào)在植物中發(fā)揮功能以引起多腺苷酸化核苷酸添加至mRNA前體的3’端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因、多種植物基因、或T-DNA基因。3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的非限制性例子是胭脂氨酸合成酶3’區(qū)(nos 3，;Fraley等(1983)Proc. Natl. Acad. Sci.USA80:4803-7)。在Ingelbrecht等，(1989)植物細(xì)胞1:671-80中提供使用不同3，非翻譯區(qū)的例子。多腺苷酸化信號(hào)的非限制性例子包括來(lái)自豌豆(Pisum sativum) RbcS2基因(Ps. RbcS2E9; Coruzzi 等(1984) EMBO J. 3:1671-9)和 AGRtu. nos (GenBank 登錄號(hào) E01312)的。植物轉(zhuǎn)化可以使用用于將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参镏械谋绢I(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)生成依照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物。認(rèn)為適合于轉(zhuǎn)化植物的方法實(shí)質(zhì)上包括可以將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的任何方法，諸如通過(guò)電穿孔，如美國(guó)專利No. 5，384，253中例示的；通過(guò)微粒轟擊，如美國(guó)專利No. 5，015，580,5, 550，318,5, 538，880,6, 160，208,6, 399，861 和 6，403，865 中例示的；通過(guò)土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，如美國(guó)專利No. 5，635，055，5，824，877，5，591，616; 5，981，84O和6，384，301中例示的；及通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如美國(guó)專利No. 5，508，184中列出的，等等。經(jīng)由應(yīng)用諸如這些技術(shù)，可以將實(shí)際上任何植物物種的細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)將這些細(xì)胞開(kāi)發(fā)成轉(zhuǎn)基因植物?？梢栽诿揶D(zhuǎn)化背景中特別有用的技術(shù)披露于美國(guó)專利No. 5，846，797，5，159，135，5，004，863和6，624，344 ;特別地，用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬(Brassica)植物的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 5，750，871 ;用于轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 6，384，301 ;并且用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)披露于例如美國(guó)專利No. 7，060，876、美國(guó)專利 No. 5，591，616 和國(guó)際 PCT 公開(kāi)文本 WO 95/06722。在實(shí)現(xiàn)外源DNA對(duì)接受細(xì)胞的投遞后，一般地，下一步關(guān)注鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以進(jìn)一步培養(yǎng)和植物再生。為了改善鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可以期望與用于生成轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化載體一起采用選擇或篩選標(biāo)志基因。在此情況中，可以通過(guò)將細(xì)胞暴露于一種或多種選擇劑來(lái)測(cè)定潛在轉(zhuǎn)化細(xì)胞群體，或者可以對(duì)細(xì)胞篩選期望的標(biāo)志基因性狀。
可以將幸免于對(duì)選擇劑暴露的細(xì)胞，或在篩選測(cè)定法中得分為正的細(xì)胞在支持植物再生的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)包含其它物質(zhì)，諸如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物修飾任何合適的植物組織培養(yǎng)基(例如，MS和N6培養(yǎng)基)?？梢詫⒔M織在具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上維持，直至足夠的組織可用于開(kāi)始植物再生努力，或者在手工選擇的重復(fù)輪次后，直至組織的形態(tài)學(xué)適合于再生(例如，至少2周)，然后轉(zhuǎn)移至進(jìn)行枝條形成的培養(yǎng)基。周期性轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直至已經(jīng)發(fā)生足夠的枝條形成。一旦形成枝條，便將它們轉(zhuǎn)移至進(jìn)行根形成的培養(yǎng)基。一旦形成足夠的根，可以將植物轉(zhuǎn)移至土壤以進(jìn)一步生長(zhǎng)和成熟。為了確認(rèn)感興趣的基因(例如，轉(zhuǎn)基因)在再生植物中的存在，可以實(shí)施多種測(cè)定法。此類測(cè)定法包括例如分子生物學(xué)測(cè)定法，諸如Southern和Northern印跡和PCR ;生物化學(xué)測(cè)定法，諸如檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如，通過(guò)免疫學(xué)手段(ELISA和/或Western印跡)或者通過(guò)酶功能；植物部分測(cè)定法，諸如葉或根測(cè)定法；和分析再生的全植物的表型。轉(zhuǎn)基因植物的培養(yǎng)和使用 依照本發(fā)明的展現(xiàn)出核酸切除的植物可以具有一種或多種期望的性狀，諸如兩種或更多種期望的性狀。此類性狀可以包括例如對(duì)昆蟲(chóng)和其它有害物和引起疾病的媒介物的抗性；對(duì)除草劑的耐受性；增強(qiáng)的穩(wěn)定性、產(chǎn)量、或貨架期；環(huán)境耐受性；藥物生成；工業(yè)產(chǎn)品生成；和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)。期望的性狀可以由側(cè)翼有由展現(xiàn)出期望性狀的植物中表達(dá)的ZFN識(shí)別的核酸序列的基因賦予，使得ZFN在植物中的表達(dá)經(jīng)由限制其根本的基因降低或消除性狀轉(zhuǎn)送至其它植物或植物的后續(xù)世代。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，期望的性狀可以是由于植物中存在轉(zhuǎn)基因所致，所述轉(zhuǎn)基因側(cè)翼可以有ZFN識(shí)別序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可以經(jīng)由常規(guī)育種獲得期望的性狀，該性狀可以由側(cè)翼有ZFN識(shí)別序列的一種或多種基因賦予。依照本發(fā)明的展現(xiàn)出核酸切除的植物可以是能夠用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的任何植物。因而，植物可以是雙子葉植物或單子葉植物。在本方法中可用的雙子葉植物的非限制性例子包括苜猜、豆、花莖甘藍(lán)(broccoli)、甘藍(lán)(cabbage)、胡蘿卜、花椰菜、療菜、白菜(Chinese cabbage)、棉、黃瓜、爺子、萵苣、甜瓜(melon)、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜、蘿卜、油菜籽、菠菜、大豆、南瓜、甜菜、向日葵、煙草、番茄和西瓜。本方法中可用的單子葉植物的非限制性例子包括玉米、洋蔥、稻、高粱、小麥、黑麥、黍(millet)、甘蔗、燕麥、黑小麥、柳枝稷和草地草(turfgrass)?？梢砸匀魏畏绞绞褂没蛟耘嘁勒毡景l(fā)明的展現(xiàn)出核酸切除的植物，其中切除的核酸序列對(duì)其它植物的轉(zhuǎn)送是不想要的。因而，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法將已經(jīng)工程化改造為具有一種或多種期望的性狀等的GM植物用依照本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化，種植并栽培。
實(shí)施例包括以下實(shí)施例以例示本發(fā)明的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本發(fā)明中運(yùn)行良好的技術(shù)。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會(huì)可以在不偏離本發(fā)明范圍的前提下對(duì)公開(kāi)的具體實(shí)施方案做出許多變化，并且仍獲得相似或類似的結(jié)果。更具體地，會(huì)顯而易見(jiàn)的是，可以用化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的某些藥劑本文中描述的藥劑，同時(shí)會(huì)實(shí)現(xiàn)相同或類似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有此類相似替代和修改視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如所附權(quán)利要求書(shū)限定的。實(shí)施例I :質(zhì)粒設(shè)計(jì)和構(gòu)建。設(shè)計(jì)并構(gòu)建含有側(cè)翼有鋅指結(jié)合位點(diǎn)的靶報(bào)告基因表達(dá)盒的靶構(gòu)建體(PDAS5380)和含有鋅指核酸酶基因表達(dá)盒的切除構(gòu)建體(PDAS5381)。構(gòu)建體設(shè)計(jì)為分開(kāi)轉(zhuǎn)化入煙草中。通過(guò)雜交兩種煙草系實(shí)施靶報(bào)告基因切除，其中功能性鋅指核酸酶識(shí)別在靶報(bào)告基因盒側(cè)翼的鋅指結(jié)合位點(diǎn)，并且切割基因組DNA。將含有靶報(bào)告基因構(gòu)建體的植物系與含有切除構(gòu)建體的植物系雜交導(dǎo)致自植物基因組除去/刪除報(bào)告基因。靶構(gòu)律體DDAS5380的構(gòu)律和設(shè)計(jì)構(gòu)建pDAS5380(圖I)作為二元質(zhì)粒載體。此構(gòu)建體含有下列植物轉(zhuǎn)錄單元(PTU)表達(dá)盒和遺傳元件RB7-MAR((基質(zhì)附著區(qū)(Thompson等(1997) W09727207)) : :CCR5結(jié)合位點(diǎn)重復(fù) 4x (Perez 等(2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16) : : AtuORFl 3，UTR (根癌土壤桿菌讀碼框 1，3’ 非翻譯區(qū)(Huang 等(1990) J. Bacteriol. 172:1814-22))/⑶S ( β-D-葡 糖醛酸糖苷酶(Jefferson (1989)Nature 342:837-8))/AtUbilO (擬南芥泛素 10 啟動(dòng)子(Callis 等(1990) J. Biol. Chem. 265:12486-93)) : :CCR5 結(jié)合位點(diǎn)重復(fù) 4x: :AtAct2(擬南芥肌動(dòng)蛋白 2 啟動(dòng)子(An 等(1996)Plant J. 10:107-21))/Turbo GFP(turbo 綠色熒光蛋白(Evdokimov 等(2006) EMBO Rep. 7(10) : 1006-12))/Atu 0RF23 3’UTR (根癌土壤桿菌讀碼框23，3，非翻譯區(qū)(Gelvin等(1987)EP222493)) : :AtUbilO/PAT(草胺膦乙?；D(zhuǎn)移酶(Wohlleben 等(1988) Gene 70:25-37))/Atu ORFl 3’UTR。將⑶S PTU 表達(dá)盒與 GFP 和 PATPTU表達(dá)盒以反式放置。另外，⑶SPTU表達(dá)盒側(cè)翼有CCR5鋅指核酸酶結(jié)合位點(diǎn)。此序列(SEQ ID NO: I)直接在⑶S PTU表達(dá)盒的上游和下游重復(fù)4x。鋅指結(jié)合位點(diǎn)的位置在圖I中鑒定為“CCR5結(jié)合位點(diǎn)”。由切除物(excisor)構(gòu)建體pDAS5381編碼的鋅指核酸酶蛋白識(shí)別并結(jié)合這些位點(diǎn)。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)完成此二元載體的裝配。經(jīng)由限制酶消化和DNA測(cè)序確認(rèn)最終的質(zhì)粒。切除物構(gòu)津體PDAS5381的構(gòu)津和設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)并構(gòu)建含有特異性設(shè)計(jì)為結(jié)合CCR5結(jié)合位點(diǎn)(SEQ ID NO:2)的鋅指核酸酶基因的二兀質(zhì)粒，如記載于Perez等，(2008) Nature Biotechnol. 26:808-16的。pDAS5381 (圖2)含有下列PTU表達(dá)盒CsVMV(木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(Verdaguer等(1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-39))/CCR5鋅指核酸酶編碼區(qū)(含有不透明2核定位序列(Maddaloni 等(1989)Nucleic Acids Res. 17 (18) : 7532) ;rl62yll 鋒指結(jié)合域；FokI 核酸酶域(Looney 等(1989) Gene 80:193-208);源自 Thesoa assigna 病毒的 T2A stutter序列(Mattion 等(1996) J. Virol. 70:8124-7);第二不透明 2 核定位序列；168FA vE 鋒指結(jié)合域；和第二 FokI核酸酶域/Atu 0RF23 3’UTR: :AtUbi3啟動(dòng)子(擬南芥泛素3啟動(dòng)子(Callis 等(1995) Genetics 139 (2) : 921-39))/HPTII (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 II (Gritz 等(1983) Gene 25 (2-3) : 179-88))/Atu 0RF24 3’UTR (根癌土壤桿菌讀碼框 24，3’ 非翻譯區(qū)(Gelvin等(1987)EP222493))。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)完成此二元載體的裝配。經(jīng)由限制酶消化和DNA測(cè)序確認(rèn)最終的質(zhì)粒。實(shí)施例II :土壤桿菌屬介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。用DDAS5380和PDAS5381轉(zhuǎn)化土壤桿菌屬。電感受態(tài)根癌土壤桿菌(菌株LBA4404)細(xì)胞獲自Invitrogen (Carlsbad, CA),并使用自 Weigel 和 Glazebrook (2002)“How to Transform Arabidopsis,，，于 Arabidopsis: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, U. S. A改編的電穿孔方法轉(zhuǎn)化。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落在含有壯觀霉素(50 μ g/mL)和鏈霉素(125 μ g/mL)的酵母提取物蛋白胨培養(yǎng)基(YEP)上獲得，并經(jīng)由限制酶消化確認(rèn)。將展現(xiàn)出正確的限制酶顯帶樣式的克隆于-80° C作為甘油儲(chǔ)液貯存。土壤桿菌屬介導(dǎo)的煙草(Nicotiana tabacum)轉(zhuǎn)化。使用含有pDAS5381和pDAS5380的根癌土壤桿菌(菌株LBA4404)轉(zhuǎn)化煙草(PetitHavana栽培種)葉盤(leaf disc)。將含有這些質(zhì)粒的土壤桿菌屬的單一菌落接種入4mL含有壯觀霉素(50 μ g/mL)和鏈霉素(125 μ g/mL)的YEP中，并于28° C在搖動(dòng)器上以190rpm溫育過(guò)夜。隨后，使用4mL種子培養(yǎng)物接種在125mL帶擋板的錐形瓶中培養(yǎng)的含有壯觀霉素(50 μ g/mL)和鏈霉素(125 μ g/mL)的YEP培養(yǎng)基的25mL培養(yǎng)物。將此培養(yǎng)物于28° C在以190rpm搖動(dòng)的情況中溫育，直至它達(dá)到0D_為約I. 2。將IOmL 土壤桿菌屬懸浮液放入無(wú)菌60x20mm培養(yǎng)皿中。
將自在具有PhytaTraysTM(Sigma, St. Louis, MO)中的 30g/L 蔗糖的 MS 培養(yǎng)基(Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS, #M524)上無(wú)菌培養(yǎng)的植物切出的 25 個(gè)新鮮切出的葉盤(O. 5cm2)在IOmL 土壤桿菌屬的過(guò)夜培養(yǎng)物中浸泡幾分鐘，在無(wú)菌濾紙上干印跡，然后放到具有添加的lmg/L吲哚乙酸和lmg/L芐氨基腺嘌呤的相同培養(yǎng)基上。在共培養(yǎng)48小時(shí)后，將與含有PDAS5380的土壤桿菌共培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)移至具有5mg/L Basta 和250mg/L頭孢噻肟的相同培養(yǎng)基上。將與含有pDAS5381的土壤桿菌共培養(yǎng)的葉盤轉(zhuǎn)移至具有10mg/L潮霉素和250mg/L頭孢噻肟的相同培養(yǎng)基上。在3周后，將各個(gè)Ttl小植物轉(zhuǎn)移至具有10mg/L Basta 和250mg/L頭孢噻肟(對(duì)于pDAS5380)，或具有10mg/L潮霉素和250mg/L頭孢噻肟(對(duì)于pDAS5381)的MS培養(yǎng)基，再3周后，移植到土壤，并轉(zhuǎn)移至溫室?？截悢?shù)、全長(zhǎng)PTU和對(duì)TO棺物的表汰分析?？截悢?shù)測(cè)定法。實(shí)施Invader 和水解探針測(cè)定法以篩選Basta 抗性植物的樣品，從而鑒定那些含有pDAS5380和pDAS5381中T-DNA的單拷貝整合的。使用對(duì)基因表達(dá)盒特異性的引物和探針進(jìn)行詳細(xì)分析。鑒定單一拷貝事件以進(jìn)行別的分析。將組織樣品在96孔板中收集，并且凍干2天。用Kleco 組織粉碎機(jī)和鎢珠(Visalia，CA)實(shí)施組織浸潰。在組織浸潰后，使用DNeasy 96植物試劑盒 (Qiagen, Germantown, MD)依照制造商提示的方案以高通量形式分離基因組DNA。通過(guò)Quant-IT Pico Green DNA測(cè)定試劑盒 (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA)量化基因組DNA。使用Biorobot3000 自動(dòng)化液體處理器(Qiagen, Germantown, MD)將量化的基因組DNA調(diào)節(jié)至9ng/ μ L (對(duì)于丨nvader 測(cè)定法)或5ng/ μ L (對(duì)于水解探針測(cè)定法)。Hologic(Madison, WI)開(kāi)發(fā)出定制的Invader 測(cè)定法以在煙草中進(jìn)行PAT基因分析。首先，通過(guò)于95° C溫育10分鐘將基因組DNA樣品(于9ng/μ L為7.5 μ L)在96孔板形式中變性，然后在冰上冷卻。接著，將7. 5μ L Master混合物(3 μ L針對(duì)pat和內(nèi)部參照基因(苯丙氨酸銨裂合酶(PalA) ；GenBank ID:AB008199)的探針混合物、3. 5 μ L Cleavase XI FRET混合物、和I μ LCleavase XI Enzyme/MgCl2溶液)添加至每孔，并用礦物油覆蓋樣品。將板密封，并于63° C在BioRad Tetrad 熱循環(huán)儀中溫育I小時(shí)。將板冷卻至周圍溫度，之后在熒光讀板儀上閱讀。所有板都含有I個(gè)拷貝、2個(gè)拷貝和4個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品及野生型對(duì)照樣品和不含樣品的空白孔。對(duì)FAM( λ 485-528nm)和RED( λ 560-620nm)通道兩者收集讀數(shù)，并通過(guò)這些，通過(guò)用樣品原始信號(hào)(raw signal)除以無(wú)模板原始信號(hào)對(duì)每份樣品測(cè)定每個(gè)通道的相對(duì)于零(即，背景)的倍增(fold over zero)。通過(guò)此數(shù)據(jù)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)線性回歸分析確定最佳擬合。使用自此擬合鑒定的參數(shù)，然后，對(duì)每份樣品評(píng)估表觀pat拷貝數(shù)。使用LightCycler 480 系統(tǒng)(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR實(shí)施通過(guò)與TaqMan 測(cè)定法類似的水解探針測(cè)定法進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因拷貝測(cè)定。使用LightCycler 探針設(shè)計(jì)軟件2.0對(duì)HPTii、pat和內(nèi)部參照基因苯丙氨酸銨裂合酶(palA)設(shè)計(jì)測(cè)定法。對(duì)于擴(kuò)增,在含有O. 4 μ M每種引物和O. 2 μ M每種探針(表I)的10 μ L體積多重反應(yīng)中以Ix終濃度制備LightCycler1 480探針Master混合物(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)。在突光采集的情況中實(shí)施兩步擴(kuò)增反應(yīng),其中于58° C延伸38秒。將所有樣品一式三份運(yùn)行，并使用平均循環(huán)閾值(Ct)數(shù)值來(lái)分析每份樣品。使用LightCycler 軟件第I. 5版使用相對(duì)定量模塊實(shí)施對(duì)實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的分析，并且其基于Λ ACt方法。對(duì)于這點(diǎn)，來(lái)自單拷貝校準(zhǔn)物和已知的2個(gè)拷貝檢驗(yàn)(check)的基因組DNA的樣品包含在每次運(yùn)行(與用于上述.Invader 測(cè)定法的那些運(yùn)行相同)中。表I :關(guān)于PAT、HPTII和內(nèi)部參照(palA)的水解探針測(cè)定法的引物和探針信息。
引物序列檢測(cè)
名稱
TQPATS SEQ ID NO:3； 5‘ ACAAGAGTGGATTGA丁GATCTAGAGAGGT 3'
TQPATA SEQ ID N0:4: 5, CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT 3'
TQPATFQ SEQIDNO:5; 5'Cy5
CYS-GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG-BHC^y
TQPALS SEQ 丨D NO:6: 5' TACTATGACTTGATGTTGTGTGGTGACTGA /
TQPALA SEQ ID N'0:7: 5, GAGCGGTCTAAATTCCGACCCTTATTTC V
TQPALFQ SEQ IDNO:8; 5r6FAM
6FAM-AA.ACGATGGCAGGAGTGCCCTTTTTCTATCAAT-BHQ1
3,
HPT2S SFX') 3D NO:9; 5' ArACTArATGGC'GTGATTTHPT2A SEQ 丨DN〇:10; 5'AGCATCAGCTCATCGAGA 3,
HPTFQ SEQ ID NO: 11; 5f Cy5/ ACTGTGATGGACGACACCG/3BHQ2/ V Cy5經(jīng).由Southern印女亦分析的全長(zhǎng)PTU泖I定法。使用Southern印跡分析建立插入DNA片段的整合樣式，并鑒定含有全長(zhǎng)PTU的PDAS5380和pDAS5381事件。產(chǎn)生數(shù)據(jù)以表明插入煙草基因組中的轉(zhuǎn)基因的整合和完整性。使用Southern印跡數(shù)據(jù)鑒定來(lái)自pDAS5380和pDAS5381的T-DNA的完整拷貝的簡(jiǎn)單整合。使用對(duì)基因表達(dá)盒特異性的探針進(jìn)行詳細(xì)的Southern印跡分析。這些探針與已經(jīng)用特定限制酶消化的基因組DNA的雜交鑒定出某些分子量的基因組DNA片段，其樣式可以進(jìn)行分析以鑒定推進(jìn)到T1的事件。這些分析還顯示已經(jīng)在未重排PTU的情況中將質(zhì)粒片段插入煙草基因組DNA中。將組織樣品在50mL圓錐管(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中收集,并且凍干2天。用油漆混合器(paint mixer)組織粉碎機(jī)和鎢珠實(shí)施組織浸潰。在組織浸潰后，使用DNeasy 植物Maxi試劑盒(Qiagen, Germantown, MD)依照制造商提示的方案分離基因組DNA。將純化的基因組DNA沉淀，并在500 μ L TE緩沖液中重懸。使用Qiagen基因組Tips 試劑盒進(jìn)一步純化基因組DNA。通過(guò)Quant-IT Pico Green DNA測(cè)定試劑盒(MolecularProbes, Invitrogen, Carlsbad, CA)量化基因組DNA。將量化的基因組DNA以一致的體積調(diào)節(jié)至8 μ g。對(duì)于每份樣品，用限制酶MfeI 和 NsiI (New England Biolabs, Beverley, MA)徹底消化8yg基因組DNA。將樣品于37° C溫育過(guò)夜。通過(guò)用快速沉淀溶液(QuickPrecipitation Solution) (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD)依照制造商提不的方案的沉淀濃縮消化的DNA。然后，將基因組DNA在25 μ L水中于65° C重懸I小時(shí)。將重懸 的樣品加載到在Ix TAE中制備的O. 8%瓊脂糖凝膠上，并以I. lV/cm在Ix TAE緩沖液中電泳過(guò)夜。將凝膠連續(xù)序貫變性(O. 2MNa0H/0. 6M NaCl) 30分鐘和中和(0. 5M Tris HCl (pH7. 5)/1. 5M NaCl) 30 分鐘。通過(guò)使用層析紙芯和紙巾將20x SSC溶液過(guò)夜通過(guò)凝膠被動(dòng)芯吸到經(jīng)處理的Immobi Ion NY+轉(zhuǎn)移膜(Mi 11 ipore，Billerica, MA)上來(lái)實(shí)施DNA片段的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，將膜用 2x SSC短暫清洗，與 Stratalinker 1800 (Stratagene, LaJolla, CA)交聯(lián)，并于 80。C真空烘焙3小時(shí)。使用400 型雜交培養(yǎng)箱(Robbins Scientif ic, Sunnyvale, CA)將印跡于 65。C 在玻璃滾瓶中與預(yù)雜交溶液(Perfect Hyb plus , Sigma, St. Louis, MO) 一起溫育I小時(shí)。自含有整個(gè)編碼序列的PCR片段制備探針。將PCR擴(kuò)增子使用QIAEX II 凝膠提取試劑盒純化，并經(jīng)由隨機(jī)RT Prime IT 標(biāo)記試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)用 a32P_dCTP標(biāo)記。將印跡于65° C與對(duì)雜交緩沖液直接添加的變性探針雜交過(guò)夜至每mL每個(gè)印跡約200萬(wàn)次計(jì)數(shù)。雜交后，將印跡于65° C用0. Ix SSC/0. 1%SDS序貫清洗40分鐘。最終，將印跡暴露于化學(xué)發(fā)光膜(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN),并使用 Molecular DynamicsStorm860 成像系統(tǒng)成像。圖3和4中標(biāo)示基于pDAS5380或pDAS5381片段的已知限制酶位點(diǎn)的在特定消化和探針情況中預(yù)期的和觀察到的片段大小。使用此研究中完成的Southern印跡分析鑒定如下事件，其含有插入煙草基因組中的來(lái)自質(zhì)粒PDAS5380或pDAS5381的全長(zhǎng)完整PTU (分別是圖3和4)。GUS表汰測(cè)定法。為了測(cè)試PDAS5380轉(zhuǎn)基因植物是否含有功能性⑶S PTU表達(dá)盒，將葉樣品收獲，并在⑶S表達(dá)方面組織化學(xué)染色。將葉盤(約0. 25cm2)切出，并在含有250 μ L⑶S測(cè)定溶液(Jefferson (1989) Nature 342:837-8)的24孔盤(每孔I個(gè)葉盤)中放置。將24孔盤用NescoHlm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)包裹，并于 37。C 溫育 24 小時(shí)。在24小時(shí)后，自每孔除去⑶S測(cè)定溶液，并用250 μ lioo%乙醇更換。將該盤用Nescofilm 包裹，并于室溫溫育2-3小時(shí)。將乙醇除去，并用新鮮乙醇替換。然后，在解剖顯微鏡下觀察葉盤。將染色為藍(lán)色的葉盤評(píng)分為含有功能性GUS PTU表達(dá)盒。GFP表汰測(cè)定法。使用ELISA對(duì)煙草葉樣品分析GFP表達(dá)。用純化的兔抗GFP抗體將板于4° C包被過(guò)夜。分析當(dāng)天，將板用PBST中的O. 5%BSA封閉。通過(guò)在Kleco 組織研磨機(jī)(grinder)中用2個(gè)不銹鋼珠以最大速度用珠打擊冷凍的葉塊達(dá)3分鐘來(lái)提取重復(fù)的葉樣品。將樣品以3000rcf離心10分鐘，并收集上清液。將提取樣品以1:5和1:50稀釋加載到ELISA板上。將大腸桿菌(E. coli)重組GFP標(biāo)準(zhǔn)曲線以12. 5ng/mL至O. 195ng/mL的濃度在每塊板上運(yùn)行。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在ELISA板上溫育I小時(shí)。將板清洗，并添加辣根過(guò)氧化物酶綴合的兔抗GFP抗體。I小時(shí)溫育后，將板清洗，并添加底物。容許顯色，之后用H2SO4停止反應(yīng)。在讀板儀上于450nm用650nm參照濾器閱讀吸光度。通過(guò)相對(duì)于OD擬合大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)品的濃度產(chǎn)生二次標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)線性回歸測(cè)定未知樣品的濃度。詵擇L棺物以講行靶Tl牛成。 再生總共68個(gè)Basta 抗性⑶S+/GFP+植物，并且基于PAT Invader 測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)38個(gè)植物具有1-2個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝。Southern分析鑒定出14個(gè)單拷貝事件，其中8個(gè)展現(xiàn)出與完整的PAT、⑶S和GFP PTU 一致的條帶。將展示單拷貝全長(zhǎng)PTU并表達(dá)⑶S和GFP的三個(gè)PDAS5380事件，即pDAS5380-3、pDAS5380-18和pDAS5380_46自花傳粉以生成Tl種子。FokI表汰測(cè)定法。使用定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)量化用pDAS5381轉(zhuǎn)化的TO煙草植物中鋅指核酸酶的mRNA表達(dá)。開(kāi)發(fā)測(cè)定法以通過(guò)相對(duì)于來(lái)自輸入mRNA的mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化這些水平量化來(lái)自煙草葉樣品的相對(duì)FokI mRNA表達(dá)。相對(duì)于總mRNA標(biāo)準(zhǔn)化FokI mRNA容許比較不同樣品間的FokI表達(dá)，并且可以用于鑒定表現(xiàn)為高度表達(dá)的事件。表I. I中列出了相對(duì)ZFN表達(dá)。表I. I :量化用pDAS5381轉(zhuǎn)化的Ttl煙草植物中鋅指核酸酶的mRNA表達(dá)。*相對(duì)于總RNA標(biāo)準(zhǔn)化的FoklmRNA的qRT-PCR。4份重復(fù)樣品的均值。
權(quán)利要求
1.一種用于刪除植物中的DNA區(qū)的方法，該方法包括 提供含有基因組DNA的能活植物，該基因組DNA包含所述DNA區(qū)；并在含有所述基因組DNA的所述能活植物中導(dǎo)入或表達(dá)鋅指核酸酶，其中將所述鋅指核酸酶工程化改造為在識(shí)別序列處切割所述基因組DNA ； 其中所述方法導(dǎo)致在識(shí)別序列處對(duì)所述基因組DNA的切割，而且導(dǎo)致所述基因組DNA的切除，其中所述DNA區(qū)不存在于所述基因組DNA。
2.通過(guò)權(quán)利要求I的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物。
3.一種用于刪除植物中的DNA區(qū)的方法，該方法包括 提供含有基因組DNA的第一能活植物，所述基因組DNA包含所述DNA區(qū)及在所述DNA區(qū)的3’端側(cè)翼的第一識(shí)別序列和在5’端側(cè)翼的第二識(shí)別序列； 提供含有基因組DNA的第二能活植物，所述基因組DNA包含編碼工程化改造為在所述識(shí)別序列處切割所述基因組DNA的鋅指核酸酶的DNA; 將所述第一和第二能活植物雜交，使得在所述第一或所述第二能活植物上生成Fl種子；并 種植含有基因組DNA的所得Fl植物，其中所述DNA區(qū)不存在于所述基因組DNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述第一識(shí)別序列和所述第二識(shí)別序列是相同的。
5.由權(quán)利要求3的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物。
6.一種分離的核酸分子，其包含 由鋅指核酸酶識(shí)別的第一核酸序列； 感興趣的基因；和 由鋅指核酸酶識(shí)別的第二核酸序列，其中所述感興趣的基因側(cè)翼有由鋅指核酸酶識(shí)別的所述第一和第二核酸序列。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其進(jìn)一步包含與所述感興趣的基因可操作連接的啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列側(cè)翼有同源序列。
9.一種生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括 用權(quán)利要求I的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織；并 再生全植物。
10.由權(quán)利要求9的方法生成的轉(zhuǎn)基因植物。
11.一種分離的核酸分子，其包含 啟動(dòng)子；和 編碼鋅指核酸酶的核酸序列，其中所述啟動(dòng)子與所述編碼鋅指核酸酶的核酸序列可操作連接，其中所述核酸序列側(cè)翼有鋅指核酸酶切割位點(diǎn)。
12.—種生成轉(zhuǎn)基因植物的方法,包括 用權(quán)利要求11的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織；并 再生全植物。
13.權(quán)利要求11的分離的核酸分子，其中所述啟動(dòng)子選自下組花粉特異性啟動(dòng)子、種子特異性啟動(dòng)子和發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子。
14.一種切除植物中感興趣的基因的方法，包括 將權(quán)利要求9的植物與權(quán)利要求11的植物雜交，其中源自所述雜交的后代展現(xiàn)出鋅指核酸酶介導(dǎo)的感興趣基因的切除。
15.一種用于降低感興趣的基因?qū)ζ渌参锏膫鞑サ姆椒?，包? 將權(quán)利要求9的植物與自用分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織再生的植物雜交，所述分離的核酸分子包含與鋅指核酸酶可操作連接的花粉特異性啟動(dòng)子，其中在源自所述雜交的后代的花粉中特異性切除所述感興趣的基因，并切除天然的感興趣基因；并栽培源自所述雜交的后代。
16.一種切除植物中感興趣的天然基因的方法，包括 用包含編碼鋅指核酸酶的核酸序列的分離的核酸分子或編碼鋅指核酸酶的分離的蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)化包含感興趣的基因的植物細(xì)胞或組織，其中所述鋅指核酸酶識(shí)別在所述感興趣的天然基因側(cè)翼的核酸序列；并再生全植物。
17.一種用于在含有核酸分子的植物中刪除DNA區(qū)的方法，包括 提供由鋅指核酸酶識(shí)別的第一核酸序列； 提供選擇標(biāo)志基因表達(dá)盒；并 提供由鋅指核酸酶識(shí)別的第二核酸序列，其中所述選擇標(biāo)志側(cè)翼有由鋅指核酸酶識(shí)別的所述第一和第二核酸序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列側(cè)翼有同源序列。
19.權(quán)利要求17的方法，其中在能活植物細(xì)胞中表達(dá)或?qū)牍こ袒脑鞛樵谧R(shí)別序列處切割基因組DNA的鋅指核酸酶，由此導(dǎo)致在識(shí)別序列處對(duì)所述基因組DNA的切割，導(dǎo)致所述基因組DNA的切除，其中所述選擇標(biāo)志不存在于所述基因組DNA。
20.權(quán)利要求17的方法，其中鋅指核酸酶單體的每一半分開(kāi)表達(dá)，并且在彼此聯(lián)合配對(duì)時(shí)形成功能性復(fù)合物。
全文摘要
一種用于刪除植物中的DNA區(qū)的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括用核酸分子轉(zhuǎn)化植物，其中所述核酸分子編碼與一種或多種組織特異性啟動(dòng)子，例如花粉特異性啟動(dòng)子可操作連接的一種或多種鋅指核酸酶(ZFN)。方法包括切除植物中的天然基因。因而，在一些實(shí)施方案中，工程化改造識(shí)別在天然植物基因側(cè)翼的序列的ZFN。在又一些實(shí)施方案中，將ZFN在發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，使得例如在相對(duì)晚期的發(fā)育階段期間在植物中特異性切除核酸序列。包括可用于實(shí)施公開(kāi)的方法的核酸分子和由該方法生成的植物。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102843904SQ201180015327
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者S.拉塞爾, J.F.佩托里諾 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司