專利名稱：花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及通過將外源基因轉(zhuǎn)入百合而使花瓣內(nèi)含有藍色色素(花翠素)的百合的生產(chǎn)方法。更具體地說，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)在花瓣內(nèi)含有藍色色素的百合的方法及通過該方法生產(chǎn)的百合，其中，為了在將花翠素合成所必需的來自風鈴草的類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)基因轉(zhuǎn)入百合的同時用RNAi法抑制對紅色色素(花青素)合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)的表達，轉(zhuǎn)入百合的F3’ H基因的片段，使花翠素在百合花瓣內(nèi)合成。
背景技術(shù)：
至今為止，已報道了通過在康乃馨(參照專利文獻I)、菊花(參照專利文獻I)、月季(參照專利文獻1、專利文獻2)、蝴蝶蘭(參照專利文獻3)、惠蘭(參照專利文獻3)中轉(zhuǎn)入外源基因，而在植物細胞中制造花翠素的方法。

但是，至今還沒有通過所轉(zhuǎn)入的外源基因的作用而在百合花瓣內(nèi)合成花翠素，以培育出具有藍色花瓣的百合的成功案例的報道。作為植物的品種改良,具有(I)使雄蕊和雌蕊交配雜交，(2)自然或人為產(chǎn)生的突變，(3)基因重組等的方法。其中，利用(3)基因重組的技術(shù)時，可不受對象種所具有的遺傳性制約的限制，使有用基因在該植物中表達，并由此可賦予該植物原本不具有的新的性狀。使用基因重組技術(shù)培育出的基因重組植物現(xiàn)在已在全世界廣泛栽培。作為花色的顏色素成分，有花色苷、類胡蘿卜素、甜菜素等?；ㄉ諡榻y(tǒng)稱為類黃酮的次級代謝產(chǎn)物之一，如圖1所示，通過由苯丙氨酸經(jīng)過香豆酰-CoA并通過很多酶的作用合成?；ㄉ盏念伾蕾囉谄浣Y(jié)構(gòu)。即作為花色苷的發(fā)色團的花色素B環(huán)的羥基數(shù)越增多，越會變得更藍，作為主要花色素的花翠素、花青素、花葵素按此順序羥基增多。在很多藍色花中，積累了來自花翠素的花色苷。此外，已知修飾花色苷的芳香族酰基(香豆?；?、咖啡酰基等)的數(shù)量增多時，花色苷的顏色變得更藍(即最大吸收波長向長波方向移動)，花色苷的穩(wěn)定性增加。特別是復數(shù)的芳香族?；Y(jié)合的花色苷被稱為聚?；ㄉ?，在龍膽、蝶豆等的藍色花瓣內(nèi)含有(參照非專利文獻I)。涉及花色苷的生物合成的酶、編碼這些酶的基因已從很多的植物中分離(參照非專利文獻I)?；ㄉ盏念伾惨蕾囉谄渌ㄎ坏囊号莸膒H、其他類黃酮、金屬離子等。即花色苷在液泡的pH低時變紅，為中性時變藍。此外，黃酮、黃酮醇也被稱為助色素，與花色苷共存時，具有使花色苷看上去更藍的效果。而且，已知鐵、鋁離子通過在花色苷的B環(huán)羥基上配位，使花色苷變藍。植物會盛開多種顏色的花，但可盛開所有顏色的花的種很少。這是由于種的原因，可合成的色素由遺傳性決定。例如，月季、康乃馨、菊花、百合、非洲菊等中沒有藍色、紫色的品種。其主要理由是這些植物中不具有用于合成花翠素的必需的類黃酮3’，5’_羥化酶(以下也稱為“F3’ 5’ H”。)基因。因此，已報道了一些通過使F3’ 5’ H基因表達而生產(chǎn)花翠素，以使花色變藍的嘗試。在F3’ 5’ H缺陷的矮牽牛中使F3’ 5’ H基因表達時，來自花翠素的花色苷量增加(參照非專利文獻2、非專利文獻3)。此外,在積累了花青素的煙草(Nicotiana tabacum)中使F3’ 5’ H基因表達時，可合成花翠素，花色稍帶有藍色(參照非專利文獻3)。使來自風鈴草、洋桔梗、矮牽牛的F3’ 5’ H基因在煙草中表達時，來自風鈴草的F3’ 5’ H基因最高效地生產(chǎn)花翠素(參照非專利文獻4)。此外，使蝶豆和馬鞭草的F3’ 5’ H基因在馬鞭草中表達時，來自蝶豆的基因表達時花翠素生產(chǎn)量多，花色也明顯發(fā)生了變化(參照非專利文獻5)。使來自矮牽牛、龍膽、蝶豆、瓜葉菊、洋桔梗、三色堇、薰衣草等的F3’5’H基因在月季中表達時，結(jié)果僅有使來自三色堇的F3’ 5’ H基因表達時生成了總花色素的10%數(shù)量的花翠素，表明在月季中，來自三色堇的F3’ 5’ H基因良好地發(fā)揮了功能(參照專利文獻4)。在菊花品種Improved Reagan>Dark Splendid Reagan中，通過使用月季的查爾酮合成酶啟動子使來自三色堇的F3’5’H基因轉(zhuǎn)錄，可得到積累了 50%以上花翠素、花色變藍的基因重組菊花(參照專利文獻5)。在菊花品種94-765中，使來自風鈴草、馬鞭草、瓜葉菊、三色堇、矮牽牛、山梗菜等的F3’ 5’ H基因利用來自菊花的來自黃烷酮3-羥化酶基因的啟動子和煙草乙醇脫氫酶基因的5’非翻譯區(qū)表達時，來自風鈴草、馬鞭草、瓜葉菊、三色堇的F3’ 5’ H基因比較良好地發(fā)揮功能，生成總花色素的25%以上的花翠素。在菊花中，這些之中來自風鈴草的F3’5’H基因最良好地發(fā)揮功能，生成75%以上的花翠素(參照非專利文獻16)。在以上的報道例中，雖已報道了在植物中使異種(外源)F3’ 5’ H基因表達而生產(chǎn)花翠素的例子，但卻難于預測出將來自何種植物的F3’ 5’ H基因利用何種啟動子轉(zhuǎn)入所關注的植物中時，是否會在該所關注的植物的花瓣內(nèi)實際表達該所轉(zhuǎn)入的F3’5’H基因，為了在花瓣內(nèi)生產(chǎn)花翠素，需要不斷經(jīng)歷反復的失敗和實驗。而且，所述的報道例均是以雙子葉植物為對象的研究成果。在高等植物中，雙子葉植物和單子葉植物有巨大的區(qū)別。首先，雙子葉植物和單子葉植物具有各種各樣的形態(tài)上的不同。這表示單子葉植物在其起源上發(fā)生了巨大的·形態(tài)上的進化。在單子葉植物中具有以下特征:子葉為I枚；子葉的基部形成包圍胚的其他部分的胚芽鞘；莖的斷面上維管束散生；莖在伸長生長結(jié)束后不會在其基礎上再增粗(形成層不發(fā)達)；葉脈為平行線狀(平行脈)；主根不太發(fā)達，為須根；花被片？雄蕊？心皮的數(shù)量為3的倍數(shù)；花瓣和萼片無區(qū)別(參照http://WWW.fukuoka-edu.ac.jp/ fukuhara/keitai/9-1.html)。而且，因單子葉植物和雙子葉植物在基因表達控制上具有很大差異(參照非專利文獻6、非專利文獻7)，所以，在基因重組單子葉植物的培育中伴隨著困難。而在單子葉植物中，對玉米和稻子的研究開發(fā)也很發(fā)達，基因重組玉米已在很多國家商業(yè)化。如此，有關單子葉花卉植物，雖已有使異種(外源)F3’ 5’ H基因在花瓣內(nèi)暫時表達的報道例(參照專利文獻3)，但開發(fā)基因重組的單子葉花卉植物的報道例還很少，更有開發(fā)轉(zhuǎn)入了 F3’ 5’ H基因的單子葉花卉植物的報道例，即還不存在作為開發(fā)異種F3’ 5’ H基因轉(zhuǎn)入的結(jié)果為在花瓣內(nèi)積累花翠素，使花色發(fā)生變化的單子葉花卉植物的報道例。另外，在非專利文獻8中記載了在將需要開發(fā)藍色花色的百合的與藍色色素合成相關的基因轉(zhuǎn)入紅色花色的百合中時，得到了藍色色素含量為一半以上的百合。但是，在非專利文獻8中，分析了藍色色素的百合植物的組織或部分為葉柄。在此，已知很多植物即使在葉中合成花色苷，在花中也不合成花色苷(擬南芥等)，有時在葉中的花色苷和花中的花色苷的分子種不同。例如，雖在紫瓶子草(Sarracenia purpurea)和嬰I踏瓶子草(Sarracenia psitticina)的葉中僅含有來自花青素的花色苷,但在這些的花中含有來自花青素和花翠素的花色苷(參照非專利文獻17)。此外，花色苷生物合成的控制也因組織的不同而不同。例如，在牽?；ㄖ?，基因c會賦予白色花，但莖由花色苷著色，種子為黑色。另一方面，基因ca雖賦予白色花，但莖不著色，種子為白色。因此，在百合中，通過外源基因轉(zhuǎn)入而使葉柄中花翠素成為一半以上的報道，并不意味著已確立了可培育出通過該外源基因轉(zhuǎn)入而在花瓣內(nèi)積累花翠素的百合的藍色花色的百合的生產(chǎn)方法。此外，為使花色變藍，需要使花翠素的含有率上升至總花色素量的50%以上，優(yōu)選為69%以上，更優(yōu)選為70%以上，更優(yōu)選為80%以上，更優(yōu)選為90%以上，更優(yōu)選為95%以上，進一步優(yōu)選為99%以上，最優(yōu)選為100%。為實現(xiàn)此目標，很多情況下僅單純使F3’5’H基因超表達還不充分，還需要進一步設法進行包含追加的基因操作。例如，為康乃馨的情況下，在二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)缺陷的白色康乃馨中，通過使F3’5’H基因和矮牽牛DFR基因兩者表達，可得到花翠素基本為100%，花色也變藍的重組康乃馨(參照專利文獻6、參照本申請圖1)。而且，在月季中，通過使來自三色堇的F3’5’H基因和來自鳶尾的DFR基因超表達，同時抑制月季的DFR基因表達，可得到花翠素含有率基本為100%的花色變藍的重組月季(參照專利文獻2)。此外,在菊花中，通過使來自三色堇的F3’ 5’ H基因超表達，同時抑制菊花的內(nèi)源性F3’ H基因的表達，可使花翠素的含有率上升(參照專利文獻5)。
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現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I國際公開W094 / 28140號公報(PCT / AU94 / 00265、日本特表平8-511683號公報)專利文獻2 國際公開 W02005 / 017147 號公報(PCT / JP2004 / 011958)專利文獻3日本特開2008-253250號公報專利文獻4 國際公開 W02004 / 020637 號公報(PCT / AU03 / 01111)專利文獻5 國際公開 W02009 / 062253 號公報(PCT / AU2008 / 001694)專利文獻6國際公開W096 / 36716號公報(PCT / AU96 / 00296)專利文獻7 國際公開 W02007 / 094521 號公報(PCT / JP2007 / 053342)專利文獻8 國際公開 2008 / 156214 號公報(PCT / JP2008 / 061603)專利文獻9日本特愿2008-276029說明書非專利文獻非專利文獻IPlant J.(2008)54, 737-749非專利文獻2Nature (1993) 366, 276-279非專利文獻3FEBS Lett.(1999)461, 241-245非專利文獻4Biosc1.Biotechnol.Biochem., (2003) 67 (I), 161-165非專利文獻5Plant Biotechnology (2006) 23, 5-11
非專利文獻6蛋白核酸酶vol.34(1989) 1873-1878非專利文獻7Trends in Genetics, (1088) Vol.4, p.13-18非專利文獻82006年日本新潟縣農(nóng)業(yè)綜合研究所年報1-26 (32)Top Brands農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)事業(yè)藍色百合的培育(日語原名:平成18年新潟県農(nóng)業(yè)総合研究所年報1-26 (32)卜7° 7' 7 > F'農(nóng)産物開発事業(yè)青P 二 U O作出)非專利文獻9Plant Cell Reports (2004) 22:415-421非專利文獻IOPlant Cell Reports (2004) 22:359-364非專利文獻I ITheor.Appl.Genet.(1999) 99，383-390非專利文獻12Plant Cell Physiol.(1996)37, 49-59
非專利文獻13CL0NTECH, Molecular Breeding, (2003), 11:287-293非專利文獻14J.Japan Soc.Hort.Soc.(2008) 77:94-102非專利文獻15Plant J.(2008)54:949-962非專利文獻16日本植物生理學會2010年年會要旨集展板號P1C012 ￠00)http://www.jspp.0rg/13member/20IOabstract/pdf/07.pdf非專利文獻17H0RTSCIENCE (2001) 36:38
發(fā)明內(nèi)容
在植物中，在藍色顯色中幾乎所有的情況下均由花色苷類色素的花翠素參與。花翠素的合成中F3’5’H為必需，但百合中無此酶。因此，不存在藍色花色的百合。為了通過基因轉(zhuǎn)入而培育出藍色花色的百合，希望有在百合中高表達的F3’ 5’ H。另一方面，有關合成花青素的百合，如果不抑制花青素的合成，則花翠素的含量不會上升。本發(fā)明的課題在于提供如下百合的生產(chǎn)方法，通過使來自特定種的F3’ 5’ H基因在百合的花瓣細胞內(nèi)高表達，同時抑制百合內(nèi)源性花青素合成，從而在花瓣細胞內(nèi)以高含量比例合成作為藍色色素的花翠素。本發(fā)明者為解決上述課題深入研究，不斷實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在幾乎全部花色苷類色素均由花青素占有的具有粉色花色的東方百合(Oriental lily)品種“元帥(Acapulco)”中轉(zhuǎn)入來自風鈴草F3’ 5’ H基因，同時使用由百合的F3’ H基因片段的轉(zhuǎn)入所形成的RNAi法抑制花青素的合成時，花瓣細胞內(nèi)的總花色苷類色素的80%變成花翠素，從而完成了本發(fā)明。即本發(fā)明如下。[I] 一種生產(chǎn)花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法，其特征在于，包括以下步驟:在百合中，在轉(zhuǎn)入由序列號I或序列號11所示的堿基序列或與序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列組成的來自風鈴草的F3’ 5’ H基因的同時，轉(zhuǎn)入由序列號3或序列號16所示的堿基序列或與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的F3’ H基因的片段，從而在百合花瓣內(nèi)抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性F3’ H表達，同時通過該所轉(zhuǎn)入的F3’ 5’ H基因的作用合成花翠素。[ 2 ]所述[I ]中所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)源性F3 ’ H的表達的抑制通過RNAi法進行。[3]根據(jù)所述[I]或[2]中所述的方法，其特征在于，所述來自風鈴草的F3’ 5’H基因由與序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少95%序列同一性且編碼具有F3’5’H活性的多肽的堿基序列組成。[4]根據(jù)所述[I]或[2]中所述的方法，其特征在于，所述來自風鈴草的F3’ 5’ H基因由序列號I或序列號11所不的喊基序列組成。[5]根據(jù)所述[I] [4]中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自百合的F3’H基因的片段由與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少95%序列同一性且編碼具有F3’ H活性的多肽的堿基序列組成。[6]根據(jù)所述[I] [4]中任一項所述的方法，其特征在于，所述來自百合的F3’H基因的片段由序列號3或序列號16所示的堿基序列組成。[7]根據(jù)所述[I] [6]中任一項所述的方法,其特征在于,進一步包括轉(zhuǎn)入由序列號13所不的喊基序列或與序列號13所不的喊基序列有至少90%序列同一性且編碼具有二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的DFR基因的片段，在百合花瓣內(nèi)，抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性DFR的表達，同時轉(zhuǎn)入來自鳶尾的外源DFR基因。[8]根據(jù)所述[7]中所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)源性DFR的表達抑制通過RNAi法進行。[9]根據(jù)所述[I] [8]中任一項所述的方法，其特征在于，進一步包括使用序列號24所示的百合DFR啟動子序列。[10]—種花瓣內(nèi)含有花翠素的百合或其組織或其部分或其營養(yǎng)繁殖體或其后代，其特征在于，通過所述[I]· [9]中任一項所述的方法生產(chǎn)。[11]根據(jù)所述[10]中所述的百合或其組織或其部分或其營養(yǎng)繁殖體或其后代，其特征在于，所述組織或其部分為切花。通過本發(fā)明所涉及的生產(chǎn)花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法，可在百合花瓣細胞內(nèi)以高含有比例積累作為藍色色素的花翠素，從而可培育出至今為止不存在的盛開藍色花的百合。


圖1為花色苷的生物合成途徑。圖2為雙元載體Tr3的圖譜。圖3為雙元載體Tr7 Trll的圖譜。符號說明RB-右邊界；LB_左邊界；35Spro-花椰菜花葉病毒35S啟動子；N0Ster-胭脂堿合成酶終止子；LF3’Hf-百合的F3’H基因片段；CF3’5’H-風鈴草F3’5’H基因；Iris DFR-鳶尾DFR基因；cCF3’ 5’ H-風鈴草F3，5，H cDNA ；LDFR-百合DFR ；HPT-潮霉素抗性基因。
具體實施例方式以下詳細說明本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法，其特征在于，包括以下步驟:在百合中，在轉(zhuǎn)入由序列號I或序列號11所示的堿基序列或與序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列組成的來自風鈴草的F3’ 5’ H基因的同時，轉(zhuǎn)入由序列號3或序列號16所示的堿基序列或與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的F3’ H基因的片段，從而在百合花瓣內(nèi)抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性F3’ H表達，同時通過該所轉(zhuǎn)入的F3’ 5’ H基因的作用合成花翠素。作為與所述序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列，可列舉使用BLAST、FASTA等的分析軟件計算時，與由序列號I所示的堿基序列組成的DNA有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性的DNA。同樣，作為與所述序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’-羥化酶(F3’H)活性的多肽的堿基序列，可列舉使用BLAST、FASTA等的分析軟件計算時，與由序列號3所示的堿基序列組成的DNA有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性的DNA。與所述序列號I或序列號11所不的喊基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列也可為在序列號I或序列號11所示的堿基序列中，I或數(shù)個堿基發(fā)生缺失、取代、附加的堿基序列且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H) 活性的多肽的堿基序列。在此，DNA或堿基序列中的“I或數(shù)個”是指，只要在具有所述酶活性的范圍內(nèi)，序列號I所示的堿基序列中的堿基也可發(fā)生I 20個、優(yōu)選為I 10個、更優(yōu)選為I 5個、進一步優(yōu)選為4個、更進一步優(yōu)選為I 3個的缺失、取代或附加。此外，“缺失”、“取代”、“附加”是指，產(chǎn)生編碼與由序列號I所示的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)(或多肽)(序列號2)具有相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的堿基序列的“缺失”、“取代”、“附加”。同樣，與所述序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’-羥化酶(F3’H)活性的多肽的堿基序列也可為堿基序列3或序列號16所示的堿基序列中，I或數(shù)個的堿基發(fā)生缺失、取代、附加的堿基序列且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列。在此，DNA或堿基序列中的“I或數(shù)個”是指，只要在具有所述酶活性的范圍內(nèi)，序列號3或序列號16所示的堿基序列中的堿基也可發(fā)生I 20個、優(yōu)選為I 10個、更優(yōu)選為I 5個、進一步優(yōu)選為4個、更進一步優(yōu)選為I 3個的缺失、取代或附加。此外，“缺失”、“取代”、“附加”是指，產(chǎn)生編碼與由序列號3或序列號16所不的喊基序列編碼的蛋白質(zhì)(或多妝)(序列號4或序列號17)具有相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的堿基序列的“缺失”、“取代”、“附加”。與所述序列號I或序列號11所不的喊基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列，可為可與序列號I或序列號11所示的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶(F3’ 5’ H)活性的多肽的堿基序列。
同樣，與所述序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列，可為可與堿基序列3所示的堿基序列的互補鏈在嚴謹條件下雜交且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列。在此，堿基或DNA (序列)中的“嚴謹條件”可根據(jù)與由序列號I或11或3或16所示的堿基序列組成的DNA的互補鏈雜交的DNA，通過適當確定雜交時的、進一步優(yōu)選洗滌時的溫度及鹽濃度來設定，作為嚴謹條件，例如，可列舉薩姆布魯克(Sambrook)等編《分子克隆實驗指南》第 2 版(Molecular Cloning:A Laboratory Manual2nd Ed.)，，〔(Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)〕等中記載的條件。具體而言,例如，為以下步驟:在含有(i)6XSSC(lXSSC 的組成:0.15M NaCl、0.015M 檸檬酸鈉、pH7.0)、0.5%SDS、5 X Denhardt、IOOyg / mL經(jīng)變性并斷裂成片段的鮭精DNA和50%甲酰胺的溶液中，與探針一起在42°C保溫過夜，(ii)通過洗滌除去非特異性雜交的探針的步驟，在此，從更加提高精度的觀點來看，為更低的離子強度，例如為2XSSC，更嚴謹為0.1XSSC等的條件及/或更高溫，例如所使用的核酸的Tm值為40°C以下，更嚴謹為30°C以下，進一步嚴謹為25°C以下，更進一步嚴謹為10°C以下，具體而言，可例舉根據(jù)所使用的核酸的Tm值的不同，在25°C以上，更嚴謹為37°C以上，進一步嚴謹為42°C以上，更進一步嚴謹為50°C以上，更一層嚴謹為60°C以上等的條件下進行洗滌。Tm 例如通過下式:Tm = 81.5+16.6 (log[Na+] )+0.41 (%G+C)_ (600/N)(式中，N為寡核苷酸的鏈長，% G + C為寡核苷酸中的鳥嘌呤及胞嘧啶殘基的含量)求出。雜交操作例如也可參照 所述成書進行。且在本說明書中記載的操作可通過參照該成書而適合地實施。 通過轉(zhuǎn)入如下片段抑制百合花瓣內(nèi)對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性F3’ H表達，該片段為由所述序列號3或序列號16所示的堿基序列或與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶(F3’ H)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的F3’ H基因的片段，采用反義法、正義法(共抑制法)、RNAi法等任何方法均可，優(yōu)選RNAi法。本發(fā)明還涉及包括如下內(nèi)容的所述方法，即轉(zhuǎn)入由序列號13所示的堿基序列或與序列號13所不的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的DFR基因的片段，從而抑制百合花瓣內(nèi)對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性DFR的表達，同時進一步包括轉(zhuǎn)入來自鳶尾的外源DFR基因。該內(nèi)源性DFR的表達抑制優(yōu)選通過RNAi法進行。本發(fā)明還涉及進一步包括使用序列號24所示的百合DFR啟動子序列的所述方法。且有關序列號1、11、3及16，所述的堿基序列中的I或數(shù)個堿基的缺失、取代、附力口、序列同一性、雜交條件的定義同樣也適用于序列號13及24，例如，替換成序列號13及24所示的堿基序列，與這些有至少90、95或99%的序列同一性的堿基序列也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明所涉及的通過生產(chǎn)花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法而生產(chǎn)的花瓣內(nèi)含有花翠素的百合或其組織或其部分或其營養(yǎng)繁殖體或其后代，也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該組織或其部分可優(yōu)選為切花。實施例
以下通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限定于這些實施例。[參考例1:蔓長春花(Vinca major) F3’ 5’ H基因在百合內(nèi)的表達]將質(zhì)粒pNAVFH (參照非專利文獻9，用于使蔓長春花的F3’ 5’ H基因在植物內(nèi)表達的雙元載體)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌系統(tǒng)EHAlOl。使用該重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化百合品種元帥(花為粉色)。百合的轉(zhuǎn)化用公知的方法例如非專利文獻10中記載的方法進行，但不限于此。調(diào)查轉(zhuǎn)入的F3’ 5’ H基因是否在百合中發(fā)揮功能，是否在花瓣內(nèi)形成花翠素的積累，獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的百合的組織培養(yǎng)植物體后需要2年 3年。通過著眼于在培養(yǎng)葉柄中發(fā)現(xiàn)花色苷的著色，分析該葉柄中的花色苷，至少可迅速地判斷出轉(zhuǎn)入基因完全或幾乎未發(fā)揮功能。獲得了所得到的19系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體?；厥者@些發(fā)現(xiàn)有花色苷著色的葉柄約0.5g，使用專利文獻2中所記載的方法進行花色素分析。其結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)可檢測出花翠素的系統(tǒng)。[參考例2:瓜葉菊F3’ 5’ H基因在百合中的表達]將用SmaI和XhoI酶切包含來自瓜葉菊的F3’ 5’ H cDNA Ci5al8 (參照專利文獻9)的質(zhì)粒pSPB2774而得到的約1.7kb的DNA片段、用HindIII和BamHI酶切質(zhì)粒pBI221而得到的包含花椰菜花葉病毒35S啟動子(以下也稱為“35S啟動子”。)的DNA片段與用HindIII和SalI酶切質(zhì)粒pSPB176 (參照專利文獻7)而得到的DNA片段中包含復制子的DNA片段連接，·得到質(zhì)粒pSPB3472。將用AscI和PacI酶切該質(zhì)粒而得到的DNA片段(包含35S啟動子、Ci5al8與胭脂堿合成酶終止子連接的序列)與用AscI和PacI酶切#493的DNA片段連接，得到質(zhì)粒PSPB3376。將其如參考例I中所記載使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入百合，獲得65系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體。其中獲得23系統(tǒng)的積累了花色苷的葉柄，但未得到積累了花翠素的系統(tǒng)。[參考例3:龍膽F3’ 5’ H基因在百合中的表達]將用BamHI和XhoI酶切包含龍膽的F3’ 5’ HcDNA的質(zhì)粒pGHF48 (參照專利文獻4)而得到的約1.7kb的DNA片段與用BamHI和SalI酶切的質(zhì)粒pSPB176連接，得到質(zhì)粒PSPB3329。通過將其用HindIII和BamHI酶切，而除去啟動子部分。在此，將通過插入用HindIII和BamHI酶切pBI221而得到的DNA片段(包含35S啟動子)而得到質(zhì)粒pSPB3473。將用AscI和PacI酶切該質(zhì)粒而得到的DNA片段(包含35S啟動子、龍膽F3’ 5’ H cDNA、月因脂堿合成酶終止子連接的序列)與用AscI和PacI酶切pSPB493的DNA片段連接，得到質(zhì)粒PSPB3378。將其如參考例I中所記載使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入百合，獲得65系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體。其中獲得26系統(tǒng)的積累了花色苷的葉柄。花翠素的積累比率(總花色素量中花翠素所占的比例)最高也不超過1%。[參考例4:薰衣草F3’ 5’ H基因在百合中的表達]將用BamHI和XhoI酶切包含薰衣草的F3’ 5’ HcDNA的質(zhì)粒pLBG8 (參照專利文獻4)而得到的約1.7kb的DNA片段與用BamHI和SalI酶切的質(zhì)粒pSPB176連接，得到質(zhì)粒pSPB2772?；厥瞻缦滦蛄械腄NA片段，其為通過將質(zhì)粒pSPB2772用BamHI和PacI酶切而得到的薰衣草F3’ 5’HcDNA與胭脂堿合成酶終止子連接的序列。將該DNA片段與用BamHI和PacI酶切質(zhì)粒pSPB3472 (3377)而得到的DNA片段中包含復制子的片段連接，得到pSPB3471。將用AscI和PacI酶切該質(zhì)粒而得到的DNA片段(包含35S啟動子、龍膽F3’ 5’ H cDNA與胭脂堿合成酶終止子連接的序列)與用AscI和PacI酶切pSPB493的DNA片段連接，得到質(zhì)粒PSPB3376。將其如參考例I中所記載使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入百合，獲得23系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體。其中獲得20系統(tǒng)的積累了花色苷的葉柄?；ù渌氐姆e累比率(總花色素量中花翠素所占的比例)最高也不超過1%。[參考例5:蝶豆F3’ 5’ H基因在百合中的表達]有如下報道，蝶豆的F3’ 5’H基因(DNA數(shù)據(jù)庫注冊號AB234897)轉(zhuǎn)入馬鞭草時，與轉(zhuǎn)入馬鞭草自身的F3’5’H基因時相比，良好地發(fā)揮功能，會形成更高的花翠素含有率和更清晰的花色變化(參照非專利文獻5)。將質(zhì)粒pSPB748(參照非專利文獻5)用EcoRI酶切，進行末端平滑化，再用BamHI酶切后，回收包含來自蝶豆的F3’ 5’ HcDNA的DNA片段。另一方面，得到用SalI酶切PSPB176，進行末端平滑化，再用BamHI酶切的DNA片段。通過連接這2個DNA片段，得到pSPB3166。在用AscI和PacI酶切包含賦予潮霉素抗性的基因的雙元載體PBI333 (參照非專利文獻11)的DNA片段中，插入包含用AscI和PacI酶切pSPB3166而得到的F3’5’HcDNA的DNA片段。將所得到的雙元載體作為pSPB3169。在用該雙元載體轉(zhuǎn)化的植物中，蝶豆F3’ 5’ H基因在附加有增強子的花椰菜花葉病毒35S啟動子(參照非專利文獻12)的控制下進行轉(zhuǎn)錄。希望將蝶豆的F3’ 5’ H基因轉(zhuǎn)入百合時可生產(chǎn)花翠素，將其如參考例I中所記載使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入百合，獲得23系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體。其中獲得6系統(tǒng)的積累了花色苷的葉柄，但未得到積累了花翠素的系統(tǒng)。[參考例6:三色堇F3’ 5’ H基因在百合中的表達]將來自一些植物的F3’5’H基因轉(zhuǎn)入月季時，僅有來自三色堇的F3’5’H基因(DNA數(shù)據(jù)庫注冊號AB332097)良好地積累了花翠素，花的顏色也發(fā)生了清晰的變化(參照專利文獻4)。此外，該基因即使在菊花的花瓣內(nèi)也積累花翠素，也會使花色變藍(參照專利文獻5)。由這些事實可推測來自三色堇的F3’ 5’ H基因適用于在異種植物中生產(chǎn)花翠素。通過將用AscI和PacI酶切包含三色堇F3’ 5’ HcDNA的質(zhì)粒pSPB575 (參照專利文獻8)而得到的DNA片段與用AscI和PacI酶切pSPB3166而得到的DNA片段連接，得到PSPB3138。在用該雙元載體轉(zhuǎn)化的植物中，三色堇F3’ 5’ H基因在附加有增強子的花椰菜花葉病毒35S啟動子的控制下進行轉(zhuǎn)錄。希望將三色堇的F3’ 5’ H基因轉(zhuǎn)入百合時可生產(chǎn)花翠素，將其如參考例I中所記載使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入百合，獲得25系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化百合的組織培養(yǎng)植物體。其中獲得12系統(tǒng)的積累了花色苷的葉柄，但未得到積累了花翠素的系統(tǒng)。[實施例1](I)從風鈴草基因組DNA中的F3’ 5’ H基因的分離從風鈴草(Campanula medium)的葉中使用DNAeasy (QIAGEN)提取染色體DNA。以風鈴草(Campanula medium)F3’5’H cDNA的堿基序列(DNA數(shù)據(jù)庫注冊號14590)為基礎，合成核苷酸 CFHlL:5’ -CATGTCTATAGACATATCCACCCTCTTCTATGAAC-3’ (序列號 5，下劃線部分為起始密碼子)、cCFHIL:5’ -GCCTAGACAGTGTAAGAACTTGGAGGCAATCTTGG-3’(序列號 6)。以IOOng染色體DNA為模板，將所述核苷酸作為引物使用，進行PCR。PCR使用TaKaRa LA PCR(TAKARA BIO株式會社)，用制造者推薦的條件進行。所得到的堿基序列如序列號I所示。該堿基序列編碼的氨基酸序列號2與在DNA數(shù)據(jù)庫注冊號D14590處注冊的相同。

(2)風鈴草基因組DNA中的包含F(xiàn)3’ 5’ H基因的雙元載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶SmaI和SacI酶切質(zhì)粒pBI221 (參照非專利文獻13)后，使用Blunting Kit (TAKARA BIO株式會社)進行末端平滑化，進行連接。用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切所得到的質(zhì)粒，進行末端平滑化。通過使該DNA片段在脫氧胸苷三磷酸的存在下與DNA聚合酶反應，在該DNA片段的3’末端附加I堿基脫氧胸苷。將該DNA片段與上述的來自風鈴草染色體DNA的PCR片段連接。在所得到的質(zhì)粒中，將風鈴草F3’ 5’ H基因的起始密碼子插入到接近35S啟動子序列的方向的質(zhì)粒作為P35S-CFH-1。用PvuII酶切該質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收包含風鈴草F3’ 5’ H基因的DNA片段。用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI酶切質(zhì)粒pNAVFH (參照非專利文獻9，用于使蔓長春花的F3’5’H基因在植物內(nèi)表達的雙元載體)，進行末端平滑化，進行脫磷酸。將其通過瓊脂糖凝膠電泳分離，回收分子量大的DNA片段。將該DNA片段與上述包含風鈴草F3’5’H基因的DNA片段連接，將所得到的雙元載體作為pNAR1-CHL(3)百合F3’ H基因片段的分離(pCR2.1-AP24-1的構(gòu)建)以過去已報道的F3’ H的氨基酸序列擬南芥(DNA數(shù)據(jù)庫注冊號(以下相同)AF271651)、翠菊(AF313488)、黃豆(AF499731)、紫羅蘭(AF313491)、稻子(AC021892)、老鸛草屬(AF315465)、紫蘇(AB045593)、矮牽牛(AF155332)、蝴蝶草(AB057672)為基礎，在寡核苷酸F3H2:5’ -YTSGCYGGWGTWTTYAACRTHGG-3’擬南芥的序列中，合成相當于LAGVFNIG的(序列號7)，在cF3H4:5’ -GGRTCNCGRGCWATGGCCCA-3’擬南芥的序列中，合成相當于NIWAIARDP的(序列號8)。在此，Y為C和T的混合物，W為A和T的混合物，S為C和G的混合物，R為A和G的混合物，H為A、T、C的混合物，且N為G、A、T、C的混合物。從百合品種元帥(株式會社山喜農(nóng)園)的花瓣中使用RNAeasy (QIAGEN公司)提取RNA。以該RNA為模板，將F3H2和寡聚dT用作引物進行RT-PCR。RT-PCR使用RT-PCR試劑盒(invitrogen公司)進行。以經(jīng)擴增的DNA片段為模板，將F3H2和cF3H4作為引物，如前所述進行PCR。將所得到的DNA片段作為序列號3。使具有該序列的DNA片段與質(zhì)粒pCR2.1 (invitrogen公司)連接。將所得到的質(zhì)粒作為PCR2.1-AP24-1。(4)質(zhì)粒 pNAR1-·Tr3 的構(gòu)建用SpeI和XbaI切割質(zhì)粒pCR2.1_AP24_1，進行末端平滑化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離?；厥账玫降腄NA片段中665bp長度的DNA片段。將該DNA片段與用限制性內(nèi)切酶SacI和MluI切割質(zhì)粒PBI221，進行末端平滑化，進行脫磷酸化處理而得到的DNA片段進行連接。將所得到的質(zhì)粒作為P35S-GUSL-AP24。用SpeI和NotI切割質(zhì)粒pCR2.1_AP24_1，進行末端平滑化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離?；厥账玫降腄NA片段中647bp的DNA片段。將該DNA片段與用SmaI酶切質(zhì)粒P35S-GUSL-AP24，進行脫磷酸化處理而得到的DNA片段連接，作為質(zhì)粒p35S_F3’ HTr2。回收用PvuII切割質(zhì)粒p35S-F3’ HTr2，再通過瓊脂糖凝膠電泳分離的約3.3kb的DNA片段。另一方面，用ClaI和NheI切割質(zhì)粒pNARI_CFH，進行末端平滑化，脫磷酸化后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離。從中回收包含復制子的DNA片段，與上述約3.3kb的DNA片段進行連接。將所得到的質(zhì)?；螂p元載體作為PNAR1-Trf (以下僅稱為“Tr3”。)。如圖2所示，該雙元載體在T-DNA上具有作為選擇性標記的潮霉素磷酸酶基因，組成型表達風鈴草的F3’ 5’ H基因，且通過轉(zhuǎn)錄百合的F3’ H基因的雙鏈RNA，抑制百合的F3’ H基因的表達。(5)百合的轉(zhuǎn)化
將雙元載體pNAR1-CFH和pNARI_Tr3分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌系統(tǒng)EHAlOl中。使用該重組農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化如參考例I中所記載的百合品種元帥(花為粉色)。在使用包含pNAR1-CFH的農(nóng)桿菌時，獲得31系統(tǒng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的百合的組織培養(yǎng)物。在分析積累了花色苷的葉柄的花色素時，4系統(tǒng)積累了總花色素中5%以上的花翠素?；ù渌氐暮新首罡邽?8%。另一方面，在使用包含pNAR1-Tr3的農(nóng)桿菌時，獲得了 40系統(tǒng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化了的百合的組織培養(yǎng)植物體。在分析積累了花色苷的葉柄的花色素時，如以下表I所示，13系統(tǒng)積累了總花色素中5%以上的花翠素?；ù渌氐暮新首罡邽?8%。使這些重組百合中的一些在可栽培基因重組植物的溫室中開花時，結(jié)果花瓣內(nèi)的花翠素的含有率最高達80%，原有品種的顏色為英國皇家園藝學會色譜標準編號N74D，相對于此，花的顏色與原有品種相比變得更藍，在色譜標準上編號為81C。

表I
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)在花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法，其特征在于，包括以下步驟: 在百合中，在轉(zhuǎn)入由序列號I或序列號11所示的堿基序列或與序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’，5’ -羥化酶即F3’ 5’ H活性的多肽的堿基序列組成的來自風鈴草的F3’ 5’ H基因的同時，轉(zhuǎn)入由序列號3或序列號16所示的堿基序列或與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少90%序列同一性且編碼具有類黃酮3’ -羥化酶即F3’ H活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的F3’ H基因的片段，從而在百合花瓣內(nèi)抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性F3’ H表達，同時通過該轉(zhuǎn)入的F3’ 5’ H基因的作用合成花翠素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于， 所述內(nèi)源性F3’ H的表達的抑制通過RNAi法進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于， 所述來自風鈴草的F3’5’H基因由與序列號I或序列號11所示的堿基序列有至少95%序列同一性且編碼具有F3’ 5’ H活性的多肽的堿基序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其特征在于， 所述來自風鈴草的F3’ 5’ H基因由序列號I或序列號11所示的堿基序列組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于， 所述來自百合的F3’ H基因的片段由與序列號3或序列號16所示的堿基序列有至少95%序列同一性且編碼具有F3’ H活性的多肽的堿基序列組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其特征在于， 所述來自百合的F3’ H基因的片段由序列號3或序列號16所示的堿基序列組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于， 進一步包括轉(zhuǎn)入由序列號13所不的喊基序列或與序列號13所不的喊基序列有至少90%序列同一性且編碼具有二氫黃酮醇4-還原酶即DFR活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的DFR基因的片段，從而在百合花瓣內(nèi)，抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性DFR的表達，同時轉(zhuǎn)入來自鳶尾的外源DFR基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于， 所述內(nèi)源性DFR的表達抑制通過RNAi法進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其特征在于， 進一步包括使用序列號24所示的百合DFR啟動子序列。
10.一種在花瓣內(nèi)含有花翠素的百合或其組織或其部分或其營養(yǎng)繁殖體或其后代，其特征在于， 通過權(quán)利要求1、2、4、6或8中任一項所述的方法生產(chǎn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10中所述的百合或其組織或其部分或其營養(yǎng)繁殖體或其后代，其特征在于， 所述組織或其部分為切花。
全文摘要
本發(fā)明提供通過將外源基因轉(zhuǎn)入百合而使花瓣內(nèi)含有藍色色素(花翠素)的百合的生產(chǎn)方法。本發(fā)明所涉及的方法為包括以下步驟的生產(chǎn)在花瓣內(nèi)含有花翠素的百合的方法在百合中，在轉(zhuǎn)入由序列號1或序列號11所示的堿基序列等的編碼具有類黃酮3’，5’-羥化酶(F3’5’H)活性的多肽的堿基序列組成的來自風鈴草的F3’5’H基因的同時，轉(zhuǎn)入由序列號3或序列號16所示的堿基序列等的編碼具有類黃酮3’-羥化酶(F3’H)活性的多肽的堿基序列組成的來自百合的F3’H基因的片段，從而在百合花瓣內(nèi)抑制對花青素合成發(fā)揮作用的內(nèi)源性F3’H表達，同時通過該轉(zhuǎn)入的F3’5’H基因的作用合成花翠素。
文檔編號A01H1/00GK103249301SQ201180044560
公開日2013年8月14日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者田中良和, 中村典子, 小林仁, 奧原宏明, 近藤正剛, 小池洋介, 星洋介, 野水利和 申請人:三得利控股株式會社, 新潟縣