含有益生微生物的寵物食物制品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及寵物食物領(lǐng)域。特別的是，本發(fā)明提供了包含非復(fù)制型益生微生物的寵物食物組合物。這些非復(fù)制型益生微生物可以是例如生物活性的熱處理過的益生微生物。本發(fā)明還涉及由這些非復(fù)制型益生微生物提供的健康益處。
【專利說明】含有益生微生物的寵物食物制品
[0001]本發(fā)明涉及寵物食物領(lǐng)域。特別是本發(fā)明提供了包含非復(fù)制型益生微生物的寵物食物組合物。這些非復(fù)制型益生微生物可以是例如生物活性的熱處理過的益生微生物。本發(fā)明還涉及由這些非復(fù)制型益生微生物提供的健康益處。
[0002]同時，益生菌的健康益處是本領(lǐng)域普遍接受的，由例如Blum等人概括在CurrIssues Intest Microbiol.2003Sep ；4(2):53-60中。通常,在共生制劑中同時施用益生菌和益生元，所述制劑甚至可以具有增強的健康益處。
[0003]馴養(yǎng)動物的健康狀態(tài)與其喂養(yǎng)密切相關(guān)。正確的喂養(yǎng)應(yīng)該導(dǎo)致強壯健康的寵物。除了提供營養(yǎng)價值外，食物組合物影響腸道微生物群平衡，可以導(dǎo)致或阻止胃腸道疾病。因此，關(guān)于健康動物的胃腸道和消化過程的知識對于理解喂養(yǎng)實踐行為是必需的。
[0004]通常，犬科和貓科動物的胃腸道疾病與細菌過度生長以及病原菌產(chǎn)生的腸毒素生成相關(guān)。
[0005]在過去若干年間，研究關(guān)注于一些有價值的乳酸細菌菌株，及其作為益生劑的潛在用途。益生菌被認為是活的微生物制品，通過保護腸道內(nèi)的天然微生物群，促進哺乳動物健康。益生菌被認為吸附在腸道粘膜上，在腸道形成集落，從而阻止有害微生物吸附至其上。其作用的先決條件在于必須以正確和存活的形式到達腸道粘膜，尤其是未被遍布胃中的低PH影響而破壞。特別的是，貓和狗的消化道生理學(xué)不同于人。例如，胃內(nèi)的平均pH是約3.4(狗)和4.2(貓)。
[0006]美國專利7189390描述了基于益生菌潛力而選擇和分離的新的乳酸菌微生物，及其用于制備預(yù)期改善寵物健康的寵物食物組合物的用途。
[0007]由于多達70%的免疫系統(tǒng)包含在動物的消化道內(nèi)，益生菌不僅有助于動物的消化健康，而且有助于寵物的整個免疫系統(tǒng)。
[0008]已知益生菌能夠吸附至腸細胞上，并排除腸細胞上的病原菌。為了產(chǎn)生該活性，益生菌必須在產(chǎn)品中一直保持存活直至其被消化。向?qū)櫸锸澄锎至Ｖ刑砑踊罹蛊浔３执婊钪廉a(chǎn)品消耗，并且在到達腸道時細菌仍然存活仍然是一大挑戰(zhàn)，需要大量的技術(shù)努力予以實現(xiàn)。
[0009]需要即使在益生菌臨界條件下儲藏較長時期后，仍然能夠遞送益生菌益處的寵物食物組合物，該組合物同時是易于制備的。優(yōu)選的是使用這樣的天然成分來實現(xiàn)，所述天然成分對施用安全無副作用，且易于使用現(xiàn)有產(chǎn)業(yè)技術(shù)被摻入到寵物食物組合物中。
[0010]還需要進一步改善這類制品中的益生菌的免疫強化效應(yīng)。
[0011]還需要進一步改善這類制品中的益生菌的抗炎效應(yīng)。
[0012]本發(fā)明人已經(jīng)滿足了上述需求。因此，本發(fā)明的目的是改善現(xiàn)有技術(shù)，提供滿足上述需求的寵物食物組合物。
[0013]本發(fā)明人令人驚訝的發(fā)現(xiàn):可以通過獨立權(quán)利要求的主題實現(xiàn)這一目的。獨立權(quán)利要求進一步發(fā)展了本發(fā)明的觀點。
[0014]本發(fā)明人能夠顯示:即使是非復(fù)制型益生菌也能提供益生菌的健康益處，甚至可具有改善的益處。[0015]因此，保持最終產(chǎn)品中的益生菌存活，以及確保其活著到達腸道的復(fù)雜手段似乎不是必需的。
[0016]相應(yīng)的，本發(fā)明人提出了提供包含非復(fù)制型益生微生物的寵物食物組合物。
[0017]出于本發(fā)明的目的，寵物食物組合物包括多種組合物，例如食物、營養(yǎng)餐、補充劑、零食(treat)和食用玩具,如可咀嚼和可食用的玩具。
[0018]出于本發(fā)明的目的，寵物包括馴養(yǎng)動物(domestic animal),例如狗、貓、鳥、兔、天竺鼠(guinea pig)、羊、牛、馬、豬。
[0019]在一些實施方案中，組合物是具有任何合適形態(tài)的食物，例如液體或固體食物。當(dāng)食物是液體食物時，非復(fù)制型益生微生物可以與食物混合。當(dāng)食物是固體食物時，非復(fù)制型益生微生物可以包被在食物上、摻入到食物中、或兩者。當(dāng)包被在食物上或摻入到食物中時，非復(fù)制型益生微生物可以是均質(zhì)的或不均質(zhì)的分散在食物之中或之上。
[0020]本發(fā)明的寵物食物組合物通常含有糖類級分、蛋白質(zhì)級分和脂肪級分。
[0021]除非另外指出，百分比是基于干物質(zhì)的重量％。
[0022]寵物食物組合物可包含約12 %至約70 %，優(yōu)選約16 %至約65 %，更優(yōu)選約20 %至約60%,最優(yōu)選約30%至約60%的糖類級分；約12%至約50%,優(yōu)選約16%至約45%,更優(yōu)選約18%至約40%，最優(yōu)選約20%至約35%的蛋白質(zhì)級分；和約4%至約40%，優(yōu)選約
6%至約30 %，更優(yōu)選約8 %至約25 %，最優(yōu)選約10 %至約20 %的脂肪級分。
[0023]對于一些寵物食物組合物(例如寵物零食)，組合物可以含有約I至約12%脂肪，通常是包衣的形式，以增強適口性。
[0024]寵物食物組合物還可以包含約0.5%至約40 %，優(yōu)選約0.5%至約30 %，更優(yōu)選約
I%至約20 %，最優(yōu)選約I %至約10 %的膳食纖維。
[0025]可以添加營養(yǎng)平衡劑(即，維生素、礦物質(zhì)、痕量元素及其組合)。通常這類營養(yǎng)平衡劑添加的量可以是約0.01%至約15%，優(yōu)選約0.05%至約10%，更優(yōu)選約1%至約5%，最優(yōu)選約1%至約3%。
[0026]組合物中各種成分特別合適的量取決于多種因素，例如消耗組合物的動物種類；包括在組合物中的特定成分；動物的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食；動物的消耗速率(consumption rate)等。因此,成分的量可以大幅度變化,甚至可以偏離本文給出的比例。這類組分和組分的量的選擇落入本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。對于一些伴侶動物(例如狗和貓)，美國飼料控制辦公室(American Feed Control Officials, AAFC0)提供了這類成分的推薦量。
[0027]可以從多種來源獲得蛋白質(zhì)食物來源，所述來源例如植物、動物或兩者。動物蛋白質(zhì)包括肉、肉類副產(chǎn)品、乳和蛋。肉包括禽肉、魚肉、和動物的肉，如牛肉、豬肉、綿羊肉、山羊肉等。肉類副產(chǎn)品包括肺、腎、腦、肝、胃和腸。蛋白質(zhì)食物成分還可以是游離的氨基酸和/或肽。優(yōu)選的，蛋白質(zhì)食物成分包括肉、肉類副產(chǎn)品、乳產(chǎn)品或蛋。
[0028]可以從多種來源獲得脂肪和糖類食物來源，所述來源例如動物脂肪、魚油、植物油、肉、肉類副產(chǎn)品、谷類、其他的動物或植物來源，及其混合物。谷類包括小麥、玉米、大麥和稻。
[0029]可以從多種來源獲得纖維食物成分，例如植物纖維來源，如纖維素、甜菜渣(beetpulp)、花生殼和大豆纖維。[0030]特別是當(dāng)組合物是動物食物時，優(yōu)選包含維生素和礦物質(zhì)，其量需要避免缺乏和保持健康。上述量是本領(lǐng)域中易于獲得的。美國國家研究協(xié)會(National ResearchCouncil,NRC)提供了農(nóng)場動物的上述成分的推薦量。參見例如Nutrient Requirements ofSwine(10th Rev.Ed.,NatjIAcademy Press,Wash.D.C.,1998) ；Nutrient Requirements ofPoultry (9th Rev.Ed.,Natj I Academy Press,Wash.D.C.,1994) ；Nutrient Requirementsof Horses (5th Rev.Ed., Nat’I Academy Press, Wash.D.C., 1989)等。美國飼料控制辦公室(AAFCO)提供了狗和貓的上述成分的推薦量。參見American Feed Control Officials,Inc., Official publication，第126-140頁(2003)。一般可用作食物添加劑的維生素包括維生素A、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素D、維生素E、維生素H(生物素)、維生素K、葉酸、肌醇、煙酸和泛酸。一般可用作食物添加劑的礦物質(zhì)和痕量元素包括韓、磷、鈉、鉀、鎂、銅、鋅、膽堿和鐵。
[0031]組合物可含有熟練的技術(shù)人員已知的其他成分，如維生素、礦物質(zhì)、填充劑(filler)、適口性增強劑、粘合劑、風(fēng)味劑(flavors)、穩(wěn)定劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、緩沖齊U、鹽、包衣劑等。穩(wěn)定劑包括傾向于增加組合物貨架期的物質(zhì)，如防腐劑、增效劑和螯合齊IJ、包裝氣體、穩(wěn)定劑、乳化劑、增稠劑、膠凝劑和濕潤劑。乳化劑和/或增稠劑的實例包括明膠、纖維素醚類、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和修飾的淀粉。各種組合物組分、食物成分和其他成分的具體量取決于多種因素，如包括在組合物中的特定組分和成分；患者種類；患者的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食；患者的消耗速率；待治療的疾病類型(如果有)等。因此，成分的量可以大范圍的變化，可以偏離本文描述的優(yōu)選比例。組合物中這類添加劑的量通常多達重量的約5%。
[0032]組合物可以是或可以含有其他成分，所述成分預(yù)期維持或改善動物的健康，例如補充劑、藥物、草藥、整體藥物(holistic drug)和組合物等.[0033]用于本發(fā)明的補充劑包括與另一種飼料一起使用的飼料，用于改善整體的營養(yǎng)平衡或性能。補充劑包括這樣的組合物，所述組合物作為其他飼料的補充劑不稀釋喂養(yǎng)，從而為分開獲得的動物的定量配給的其他部分提供自由選擇，或者稀釋并與動物的日常飼料混合以產(chǎn)生完全喂養(yǎng)。在 American Feed Control Officials, Inc.0fficial Publication,第220頁(2003)中，AAFCO提供了涉及補充劑的討論。補充劑可以是各種形式，包括粉末、液體、糖漿、丸劑、膠囊化組合物等.[0034]零食包括在非進餐時間給予動物，誘使動物進食的組合物，例如犬科動物的狗骨。零食可以是有營養(yǎng)的，其中，組合物包含一種或多種營養(yǎng)物，并可以具有上述用于食物的組成。無營養(yǎng)的零食涵蓋了任何其他無毒的零食。非復(fù)制型益生微生物包被在零食上，摻入到零食中，或兩種情況并存。
[0035]玩具包括可咀嚼型玩具，如人造骨(artificial bone)。非復(fù)制型益生微生物可以在玩具的表面或在玩具組分的表面上形成包衣，部分或整個摻入貫穿玩具，或兩種情況并存。在一個實施方案中，非復(fù)制型益生微生物是預(yù)期的使用對象口服可及的。目前有多種合適的玩具在售，例如美國專利號5，339，771、美國專利號5，419，283及其中公開的參考文獻。本發(fā)明提供了部分可消耗的玩具，如包含塑料組分的玩具，和全部可消耗的玩具，如生皮玩具和各種人造骨。此外，本發(fā)明提供了用于人和非人用途的玩具，特別是用于伴侶動物、農(nóng)場動物和動物園動物用途的玩具，特別是用于狗、貓和鳥類用途的玩具。[0036]在制備本發(fā)明的組合物中，調(diào)節(jié)組分使得按組合物的重量計，組合物中存在的非復(fù)制型益生微生物的濃度為至少0.01 %，優(yōu)選約0.01 %至約4%，最優(yōu)選約0.5%至約2%?？梢栽诩庸ぶ苿┑倪^程中，將非復(fù)制型益生微生物摻入到組合物中，如混合組合物的其他組分的過程中和/或之后。通過常規(guī)手段實現(xiàn)這些組分在組合物中的分布。
[0037]可使用常規(guī)方法，制備干燥形式的本發(fā)明的組合物(特別是食物)。在一個實施方案中，研磨干燥成分，包括動物蛋白質(zhì)來源、植物蛋白質(zhì)來源、谷類等，并將它們混合在一起。然后，添加含水或液體成分并與干燥混合物混合，所述成分包括脂肪、油、動物蛋白質(zhì)來源、水等。然后，將混合物加工成粗?；蝾愃频母稍镄∑?。通常使用擠出工藝形成粗粒，在所述工藝中，干燥和潮濕成分的混合物在高壓和高溫下經(jīng)過機械作用，從小的開口壓出，并被旋轉(zhuǎn)刀片切割成粗粒。然后，干燥濕的粗粒，任選的用一種或多種局部包衣包被，包括風(fēng)味劑、脂肪、油、粉末等。還可以不使用擠出，而使用烘焙工藝從生面團制備粗粒，其中在干燥加熱處理前，將生面團放入模具中。
[0038]可以在其常規(guī)制備流程中，將非復(fù)制型益生微生物添加到寵物食物組合物中，如混合、擠出、烘焙等，或優(yōu)選在擠出后的制備中添加，如通過噴霧或包被食物的表面。對于干燥食物而言，這是特別理想的，其中通過在將擠出條切割成粗粒之前，通過噴霧或包被擠出條，使擠出條與非復(fù)制型益生微生物(或包含非復(fù)制型益生微生物的溶液)接觸，或通過噴霧、包被或浸泡粗粒本身，使粗粒與非復(fù)制型益生微生物(或包含非復(fù)制型益生微生物的溶液)接觸。
[0039]為了局部應(yīng)用于食物上，將非復(fù)制型益生微生物與有助于在食物組合物表面應(yīng)用的載體組合物混合。例如，液體、漿狀、輕凝膠或含水固體都可用作該組合物的化合物的載體。使用標(biāo)準的噴霧或浸泡裝置，將化合物應(yīng)用于食物組合物的表面。這類載體的實例是用蛋白酶與氨基酸、還原糖和硫胺聯(lián)合處理過的切碎的動物副產(chǎn)品。然后，將載體與非復(fù)制型益生微生物混合，并包被在粗粒上，從而制備口味非常好且可接受的干燥食物。在某些優(yōu)選的實施方案中，可以簡單的混合非復(fù)制型益生微生物與商業(yè)化的液體口味增強劑或其他風(fēng)味組合物，產(chǎn)生可以局部施用于組合物的新的風(fēng)味劑(flavor palatant)。與本發(fā)明的非復(fù)制型益生微生物一起使用的合適的商業(yè)液體口味增強劑包括任何已知的或可以從本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的寵物食物口味增強劑或其他風(fēng)味劑供應(yīng)商商業(yè)獲得的可商購的液體口味增強劑。
[0040]本發(fā)明的組合物(特別是食物)可以使用常規(guī)的寵物食物方法，制備成罐裝的或濕形式。在一個實施方案中，將地面動物(例如，哺乳動物、禽類、魚類和/或海產(chǎn)品)的蛋白質(zhì)類組織與其他成分混合，包括魚油、谷粒、其他營養(yǎng)平衡成分、特殊用途的添加劑(例如，維生素和礦物質(zhì)混合物、無機鹽、纖維素和甜菜渣、膨脹劑等)。還可以添加足夠加工用的水。通常在適合加熱的容器中混合濕形式成分，同時摻入組分?？梢允褂萌魏魏线m的方式實現(xiàn)混合物加熱，如直接蒸汽注射或使用裝有熱交換器的容器。在加入最后的成分后，將混合物加熱至約50° F至約212° F的溫度范圍。該范圍外的溫度也是可接受的，但在不使用其他加工輔助的條件下是商業(yè)上不實際的。當(dāng)加熱至恰當(dāng)溫度時，材料通常是粘稠的液體形式。將粘稠的液體裝罐。加蓋，密封容器。然后，將封閉的罐頭放入設(shè)計用于內(nèi)容物滅菌的常規(guī)設(shè)備中。一般通過加熱至大于約230° F的溫度下恰當(dāng)?shù)臅r間來實現(xiàn)，取決于使用的溫度和組合物。[0041]對于濕食物，非復(fù)制型益生微生物可以與載體一起摻入到濕食物組合物中，所述載體如醇類組合物(即，丙二醇或二丙二醇)、環(huán)糊精、麥芽糊精或淀粉。可選的，可以在形成濕食物組合物前，將非復(fù)制型益生微生物混合到干燥材料中。
[0042]可以通過與上文關(guān)于干燥食物相似的擠出或烘焙工藝制備本發(fā)明的零食。也可以使用其他工藝在現(xiàn)有的零食形式外部包被風(fēng)味組合物，或?qū)L(fēng)味組合物注射到現(xiàn)有的零食形式內(nèi)。
[0043]本發(fā)明的動物玩具通常是通過用其中混合了非復(fù)制型益生微生物的風(fēng)味組合物包被任何現(xiàn)有玩具來制備的。
[0044]本發(fā)明的寵物食物組合物中的非復(fù)制型益生微生物的量相當(dāng)于約IO6至IO12Cfu/份。
[0045]顯而易見的，非復(fù)制型微生物不形成菌落，因此，該術(shù)語可理解為從IO4至1012cfu/g復(fù)制型細菌獲得的非復(fù)制型微生物的量。包括失活的、無活力或死亡的、或作為片段存在的微生物，所述片段如DNA或細胞壁或細胞質(zhì)化合物。換言之，組合物中包含的微生物的量表示為如果所有的微生物存活時，所述量的微生物的菌落形成能力(cfu)，而不論上述微生物實際上是否是非復(fù)制型的，如失活的或死亡的、片段化的、或任意或所有上述狀態(tài)的混合物。
[0046]寵物食物組合物還可包含益生元。
[0047]“益生元”意指在腸中促進益生菌生長的食物物質(zhì)。它們在攝入它們的人的胃和/或腸上部中不被分解或在胃腸道中不被吸收，但它們被胃腸微生物群和/或益生菌發(fā)酵。益生兀定義在例如 Glenn R.Gibson和Marcel B.Roberfroid, Dietary Modulation of theHuman Colonic Microbiota-1ntroducing the Concept of Prebiotics,J.Nutr.1995125:1401-1412 中。
[0048]根據(jù)本發(fā)明可使用的益生元沒有特別限制，包括在腸中促進益生菌生長的所有食物物質(zhì)。優(yōu)選的，它們可選自低聚糖，其任選包含果糖、半乳糖、甘露糖；膳食纖維，特別是可溶纖維、大豆纖維；菊粉；或其混合物。優(yōu)選的益生元為低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides) (IOS)、低聚異麥芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、葡糖基鹿糖(GS)、乳蔗糖(LS)、乳果糖(LA)、低聚異麥芽酮糖(PAO)、低聚麥芽糖(MOS)、樹膠和/或其水解產(chǎn)物、果膠和/或其水解產(chǎn)物。
[0049]益生元的典型實例為低聚果糖和菊粉。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的寵物食物組合物中的益生元的量取決于它們促進乳酸菌生長的能力。一般而言，組合物可含有0.1至20%的此類益生元(按相對于干物質(zhì)含量的重量計)。
[0051]寵物食物組合物例如可包含相當(dāng)于至少IO3CfVg益生元、優(yōu)選IO4至IO7CfVg益生元的量的非復(fù)制型益生菌的量。
[0052]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，例如，在免疫增強作用方面和/或在抗炎作用方面，非復(fù)制型益生微生物甚至可比復(fù)制型益生微生物更有效。
[0053]這是令人驚奇的，因為益生菌經(jīng)常被定義為“當(dāng)以足夠的量施用時賦予宿主健康益處的活的微生物”(FA0/WH0指南)。絕大多數(shù)公開的文獻涉及活益生菌。此夕卜，若干研究調(diào)查了由非復(fù)制型細菌遞送的健康益處，它們中多數(shù)表明了益生菌的失活(例如，通過熱處理)導(dǎo)致它們的聲稱的健康益處的損失(Rachmilewitz, D.等人，2004, Gastroenterology126:520-528 ；Castagliuolo 等人，2005, FEMS Tmmunol.Med.Microbiol.43:197-204 ；Gill, H.S.和 K.J.Rutherfurd,2001, Br.J.Nutr.86:285-289 ；Kaila, M.等人，1995, Arch.Dis.Child72:51-53.)。一些研究顯示了滅活的益生菌可保留一些健康作用(Rachmilewitz, D.等人,2004, Gastroentero1gy126:520-528 ；Gill,H.S.和 K.J.Rutherfurd, 2001, Br.J.Nutr.86:285-289)，但明確的是，本領(lǐng)域迄今認為活益生菌為更有效的。
[0054]“非復(fù)制型”益生微生物包括已被熱處理的益生細菌。這包括失活的、死亡的、無活力的和/或以片段例如DNA、代謝物、細胞質(zhì)復(fù)合物、和/或細胞壁物質(zhì)存在的微生物。
[0055]“非復(fù)制型”意指沒有活細胞和/或菌落形成單位能夠由經(jīng)典的平板培養(yǎng)法檢出。此類經(jīng)典的平板培養(yǎng)法總結(jié)于微生物學(xué)書:James Monroe Jay, Martin J.Loessner,David A.Golden.2005.Modern food microbiology.第7版，Springer Science,New York,Ν.Y.790p中。典型地，可如下表明不存在活細胞:在用不同濃度的細菌制備物(“非復(fù)制型”樣品)接種和在適當(dāng)條件(需氧和/或厭氧氣氛下至少24小時)溫育之后，在瓊脂平板上沒有可見的菌落或液體生長培養(yǎng)基中濁度不增加。
[0056]對于本發(fā)明的目的，益生菌定義為“對宿主的健康或安康具有有益作用的微生物細胞制備物或微生物細胞的組分”(Salminen S, Ouwehand A.Benno Y.等人“Probiotics:how should they be defined” Trends Food Sc1.Technol.1999:10107-10)。
[0057]本發(fā)明的組合物可包含足以至少部分地產(chǎn)生健康益處的量的益生微生物和/或非復(fù)制型益生微生物。足以實現(xiàn)所述的量被定義為“治療有效劑量”。對該目的有效的量將取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的許多因素例如動物的重量和一般健康狀態(tài)，并取決于食物基質(zhì)(matrix)的影響。
[0058]在預(yù)防性應(yīng)用中，以足以至少部分降低患病風(fēng)險的量對易患病或有患病風(fēng)險的消費者施用根據(jù)本發(fā)明的組合物。此類量被定義為“預(yù)防有效劑量”。再一次，準確的量取決于許多因素例如動物的健康狀態(tài)和重量，并取決于食物基質(zhì)的影響。
[0059]本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卣{(diào)整治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量。
[0060]一般來說，本發(fā)明的組合物含有治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量的非復(fù)制型益生微生物。
[0061]例如，治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量可以在每日劑量約0.005mg-1000mg非復(fù)制型益生微生物的范圍內(nèi)。
[0062]非復(fù)制型微生物可以相當(dāng)于IO4至109cfu/g干組合物的量存在，更優(yōu)選以相當(dāng)于IO5至109cfu/g干組合物的量存在
[0063]可通過本領(lǐng)域已知的任何方法使益生菌成為非復(fù)制型的。
[0064]當(dāng)今可用的使得益生菌菌株成為非復(fù)制型的技術(shù)通常為熱處理、Y-輻射、UV線或使用化學(xué)試劑(福爾馬林，多聚甲醛)。
[0065]就數(shù)量而言，例如，“短時間高溫”處理的非復(fù)制型微生物可以以相當(dāng)于IO4至IO12當(dāng)量cfu/g干組合物的量存在于組合物中。
[0066]優(yōu)選地，使用在食品工業(yè)的工業(yè)環(huán)境下相對容易應(yīng)用的致使益生菌成為非復(fù)制型的技術(shù)。
[0067]當(dāng)今市場上的多數(shù)含有益生菌的產(chǎn)品在它們的生產(chǎn)過程中被熱處理。因此，能夠與生產(chǎn)的產(chǎn)品一起或至少以相似的方式熱處理益生菌，同時益生菌保持或提高它們的有益的性質(zhì)或甚至獲得對消費者的新的有益性質(zhì)，將是方便的。
[0068]但是，在文獻中，通過熱處理的益生微生物失活通常與益生菌活性的至少部分喪失相關(guān)聯(lián)。
[0069]本發(fā)明人現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)，例如，通過熱處理使得益生微生物成為非復(fù)制型不導(dǎo)致益生菌健康益處的喪失，相反地，可增強現(xiàn)存的健康益處，并且甚至產(chǎn)生新的健康益處。
[0070]因此，本發(fā)明的一個實施方案是寵物食物組合物，其中非復(fù)制型益生微生物通過熱處理成為非復(fù)制型的。
[0071]可在至少71.5°C處理至少I秒來進行此熱處理。
[0072]可使用長時熱處理或短時熱處理。
[0073]在當(dāng)今工業(yè)規(guī)模中，通常優(yōu)選短時熱處理，例如UHT-樣熱處理。這類熱處理減少細菌負載，并且減少加工時間，從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。
[0074]本發(fā)明人首次證實，不管它們的初始性質(zhì)，被高溫短時間熱處理的益生微生物表現(xiàn)了抗炎免疫譜(profile)。特別地通過這種熱處理發(fā)展新的抗炎譜或加強現(xiàn)有的抗炎譜。
[0075]因此通過使用特定的熱處理參數(shù)，現(xiàn)在可能產(chǎn)生具有抗炎譜的非復(fù)制型益生微生物，即使活的對應(yīng)物不是抗炎菌株，所述熱處理參數(shù)對應(yīng)于典型的工業(yè)可應(yīng)用的熱處理。
[0076]因此，例如，熱處理可為在約71.5_150°C、約1_120秒的高溫處理。高溫處理可為高溫/短時(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。
[0077]益生微生物可在約71.5_150°C高溫處理約1_120秒的短時間。
[0078]更為優(yōu)選地，所述微生物可在約90_140°C例如90_120°C高溫處理約1_30秒的短時間。
[0079]此高溫處理使得微生物至少部分成為非復(fù)制型的。
[0080]可在正常大氣壓力但也可在高壓力下進行高溫處理。典型的壓力范圍是I至50巴，優(yōu)選I至10巴,更優(yōu)選2至5巴。明顯地，當(dāng)加熱時，優(yōu)選在為液體或固體的介質(zhì)中熱處理益生菌。因此，應(yīng)用的理想的壓力將取決于提供微生物的組合物的性質(zhì)和使用的溫度。
[0081]高溫處理可在約71.5_150°C、優(yōu)選約90_120°C、更優(yōu)選約120_140°C的溫度范圍內(nèi)進行。
[0082]高溫處理可進行約1-120秒、優(yōu)選約1-30秒、更優(yōu)選約5_15秒的短時間。
[0083]該給定的時間范圍指益生微生物在給定的溫度下的時間。需注意的是，取決于提供微生物的組合物的性質(zhì)和量以及取決于使用的加熱裝置的構(gòu)造，熱施用的時間可不同。
[0084]然而，典型地，本發(fā)明的組合物和/或微生物通過高溫短時(HTST)處理、巴氏瞬間滅菌法或超高溫(UHT)處理來進行處理。
[0085]UHT處理是超高溫加工或超熱處理(兩者都縮寫為UHT)，涉及通過大約1_10秒、溫度超過135°C (275° F)短時加熱的組合物的至少部分滅菌，所述溫度是殺死奶中的細菌芽孢所需要的溫度。例如，使用超過135°C溫度用這種方法加工奶使得在必要持續(xù)時間內(nèi)(至2-5秒)降低細菌負載，使能夠連續(xù)流操作。
[0086]有兩種主要類型的UHT系統(tǒng):直接和間接系統(tǒng)。在直接系統(tǒng)中，通過蒸汽注射或蒸汽輸注處理產(chǎn)品，而在間接系統(tǒng)中，使用平板熱交換器、管狀熱交換器或刮面熱交換器熱處理產(chǎn)品?？稍诋a(chǎn)品制備方法中的任一步驟或多個步驟中應(yīng)用UHT系統(tǒng)的組合。[0087]HTST處理如下定義(高溫/短時):巴氏滅菌法設(shè)計達到5-log減少，殺死在奶中活的微生物數(shù)量的99.9999%。這被認為足以破壞幾乎全部酵母、霉菌和常見的腐敗細菌，并且也保證常見病原性熱抗性生物的足夠的破壞。在HTST方法中，加熱奶至71.70C (161。F)達 15-20 秒。
[0088]巴氏瞬間滅菌法是易腐的飲料(如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的熱巴氏滅菌的方法。它在裝入容器前完成，以殺死腐敗微生物，以使得產(chǎn)品更安全以及延長它們的貯存期限。液體在71.50C (160° F)至74°C (165° F)溫度處理約15到30秒的同時以受控制的連續(xù)流移動。
[0089]對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“短時高溫處理”應(yīng)包括例如高溫短時(HTST)處理、UHT處理和巴氏瞬間滅菌法。
[0090]由于此類熱處理提供了具有改善的抗炎譜的非復(fù)制型益生菌；本發(fā)明的組合物可用于炎性疾病的預(yù)防或治療。
[0091]不特別限制能夠通過本發(fā)明的組合物治療或預(yù)防的炎性疾病。例如，它們可選自急性炎癥例如膿毒病；灼傷；和慢性炎癥，例如炎性腸病，例如，克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、隱窩炎(pouchitis);壞死性小腸結(jié)腸炎；皮膚炎癥，例如UV或化學(xué)誘導(dǎo)的皮膚炎癥、濕疹、反應(yīng)性皮膚；腸易激綜合征；眼炎癥；變態(tài)反應(yīng)、哮喘；和它們的組合。
[0092]如果使用長時熱處理使得益生微生物成為非復(fù)制型，可在約70_150°C溫度范圍內(nèi)達約3分鐘-2小時，優(yōu)選地在80-140°C范圍內(nèi)從5分鐘-40分鐘進行此類熱處理。
[0093]盡管現(xiàn)有技術(shù)通常教導(dǎo)通過長時熱處理變成非復(fù)制型的細菌通常就發(fā)揮它們的益生性質(zhì)而言不如活細胞有效，但是本發(fā)明人能夠證實與它們的活對應(yīng)物相比被長時熱處理的益生菌在刺激免疫系統(tǒng)中是優(yōu)越的。
[0094]本發(fā)明也涉及包含益生微生物的組合物，所述微生物通過在至少約70°C、至少約3分鐘的熱處理成為非復(fù)制型的。
[0095]通過體外免疫譜分析(immuneprofiling)確認非復(fù)制型益生菌的免疫增強作用。使用的體外模型使用來自人外周血單核細胞(PBMC)的細胞因子譜分析并且作為測試免疫調(diào)節(jié)化合物的標(biāo)準模型在本領(lǐng)域中被廣為接受(Schultz等人,2003, Journal of DairyResearch70,165-173 ；Taylor 等 人，2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235 ;Kekkonen 等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203)。
[0096]若干作者/研究隊伍已經(jīng)使用了體外PBMC測定法，以例如根據(jù)益生菌的免疫譜，即它們的抗或促炎特征對它們分類(Kekkonen等人，2008, World Journal ofGastroenterology, 14,1192-1203)。例如，在結(jié)腸炎小鼠模型中已經(jīng)顯不出此測定法允許預(yù)測益生候選物的抗炎作用(FoIigne, B.,等人,2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。此外，在臨床試驗中此測定法被經(jīng)常地用作讀出(read-out)測定法并且顯示了此測定法導(dǎo)致與臨床結(jié)果一致的結(jié)果(Schultz等人,2003, Journal of DairyResearch70,165-173 ;Taylor 等 人,2006, Clinical and Experimental Allergy,36,1227-1235)。
[0097]在過去的幾十年中變態(tài)反應(yīng)性疾病穩(wěn)定地上升并且當(dāng)前WHO認為它們是流行病。一般地，認為變態(tài)反應(yīng)由免疫系統(tǒng)的Thl和Th2應(yīng)答的不平衡造成，所述不平衡導(dǎo)致強烈偏向于Th2介質(zhì)的生產(chǎn)。因此，通過恢復(fù)免疫系統(tǒng)的Thl分路和Th2分路之間的適當(dāng)?shù)钠胶饽軌蚓徍?、下調(diào)或預(yù)防變態(tài)反應(yīng)。這暗示了減少Th2應(yīng)答或至少瞬時增強Thl應(yīng)答的必要性。后者將是免疫增強應(yīng)答的特征，通常由例如較高水平的IFNy、TNF-α和IL-12伴隨。(Kekkonen等人，2008, World Journal of Gastroenterology, 14,1192-1203 ；ViljanenM.等人，2005，Allergy，60，494-500)。
[0098]本發(fā)明的寵物食物組合物因而允許其治療或預(yù)防與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。
[0099]因此，不特別限制能夠通過本發(fā)明組合物治療或預(yù)防的與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。
[0100]例如，它們可選自感染，特別地為細菌的、病毒的、真菌的和/或寄生蟲感染；吞噬細胞缺乏；低的到嚴重的免疫抑制水平例如由應(yīng)激或免疫抑制藥物、化學(xué)療法或放射療法誘導(dǎo)的那些免疫抑制水平；較少免疫活性的免疫系統(tǒng)的天然狀態(tài)，例如新生兒的那些免疫系統(tǒng)；變態(tài)反應(yīng)；以及其組合。
[0101]本發(fā)明描述的寵物食物組合物也允許其增強動物對疫苗的應(yīng)答，特別是對口服疫苗的應(yīng)答。
[0102]任何量的非復(fù)制型微生物將會是有效力的。然而，一般優(yōu)選，如果至少90%，優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少98 %，最優(yōu)選至少99 %，理想地至少99.9 %，最理想地全部益生菌為非復(fù)制型的。
[0103]在本發(fā)明的一個實施方案中全部微生物為非復(fù)制型的。
[0104]因此，在本發(fā)明的組合物中至少90%，優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少98%，最優(yōu)選地至少99%，理想地至少99.9%，最理想地全部益生菌可為非復(fù)制型的。
[0105]所有益生微生物可用于本發(fā)明的目的。
[0106]例如，益生微生物可選自雙歧桿菌屬(bifidobacteria)、乳桿菌屬(Iactobacilli)、丙酸桿菌屬(propionibacteria)，或其組合，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus iohnsonii)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、雙乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和 / 或它們的混合物。
[0107]根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含例如選自長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSMl7938、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002 (NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它們的組合的益生微生物。
[0108]所有這些菌株根據(jù)布達佩斯條約保藏和/或是可商購的。
[0109]根據(jù)布達佩斯條約保藏的菌株如下:
[0110]長雙歧桿菌NCC3001:ATCC BAA-999
[0111]長雙歧桿菌NCC2705:CNCM 1-2618
[0112]短雙歧桿菌NCC2950 CNCM 1-3865
[0113]乳雙歧桿菌NCC2818:CNCM 1-3446
[0114]類干酪乳桿菌NCC2461:CNCM 1-2116
[0115]鼠李糖乳桿菌NCC4007 =CGMCCl.3724
[0116]嗜熱鏈球菌NCC2019:CNCM 1-1422
[0117]嗜熱鏈球菌NCC2059:CNCM 1-4153
[0118]乳酸乳球菌NCC2287:CNCM 1-4154
[0119]干酪乳桿菌NCC4006:CNCM 1-1518
[0120]干酪乳桿菌NCC1825:ACA-DC6002[0121 ]嗜酸乳桿菌 NCC3009:ATCC700396
[0122]保加利亞乳桿菌NCC15:CNCM 1-1198
[0123]約漢遜氏乳桿菌Lal CNCM 1-1225
[0124]路氏乳桿菌DSM17938 DSM17938
[0125]路氏乳桿菌ATCC55730 ATCC55730
[0126]大腸桿菌Nisslel917:DSM6601
[0127]以 ATCC 命名的菌株保藏于 ATCC Patent Depository, 10801University Blvd.,Manassas, VA20110, USA。
[0128]以CNCM命名的菌株保藏于國立微生物保藏中心(CNCM)，25，ROUX博士路，F(xiàn)-75724巴黎，15 區(qū)，法國(COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGAN ISMES (CNCM), 25ruedu Docteur Roux, F-75724PARIS Cedexl5, France)。
[0129]以CGMCC命名的菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，微生物研究所，中國科學(xué)院，中關(guān)村，P.0.BOX2714,北京100080，中國。
[0130]以ACA-DC 命名的菌株保藏于 Greek Coordinated Collections ofMicroorganisms, Dairy Laboratory, Department of Food Science and Technology,Agricultural University of Athens, 75, Iera odos, Botanikos, Athens, 11855,希臘。
[0131]以 DSM 命名的菌株保藏于 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Inhoffenstr.7B~, 38124Braunschweig,德國。
[0132]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解他們能夠自由地組合文中描述的本發(fā)明的全部特征而不偏尚本發(fā)明公開的范圍。
[0133]本發(fā)明另外的優(yōu)勢和特點從下述實施例和圖中顯而易見。
[0134]圖1A和B顯示了用“短時高溫”處理的益生菌的抗炎免疫譜(profiles)的增強。
[0135]圖2顯示了非抗炎益生菌菌株變?yōu)榭寡椎模捶强寡滓嫔暝谟谩岸虝r高溫”處理后表現(xiàn)出顯著的體外抗炎免疫譜。
[0136]圖3A和B顯示了在可商購的產(chǎn)品中使用的益生菌菌株，其在用“短時高溫”處理之后表現(xiàn)出增強的或新的體外抗炎免疫譜。
[0137]圖4A和B顯示了乳品起子菌株(即Lcl起子菌株)，經(jīng)高溫?zé)崽幚硭銎鹱泳瓯憩F(xiàn)出增強的或新的體外抗炎免疫譜。
[0138]圖5顯示了非抗炎益生菌菌株，在被HTST處理之后其表現(xiàn)出體外抗炎免疫譜。
[0139]圖6:用以它們活的和熱處理(140°C、15秒)形式的益生和乳品起子菌株生成的PBMC數(shù)據(jù)的主成分分析(IL-12p40、IFN- y、TNF- α、IL-10)。每一個點代表用NCC數(shù)字或名稱標(biāo)識的活的或熱處理的一種菌株。
[0140]圖7顯示了活的和熱處理的(85°C，20分鐘)菌株的IL-12p40/IL_10比率?？傮w地，在85°C達20分鐘的熱處理導(dǎo)致IL-12p40/IL-10比率上升，與本發(fā)明的“短時高溫”處理相反(圖1、2、3、4、和5)。
[0141]圖8顯示了來自用熱處理的細菌刺激的人PBMCs的體外細胞因子分泌的增強。
[0142]圖9顯示了在受鹽水攻擊的OVA致敏的小鼠中(陰性對照)、在受OVA攻擊的OVA致敏的小鼠中(陽性對照)和在受OVA攻擊以及用熱處理的或活的短雙歧桿菌NCC2950處理的OVA致敏的小鼠中觀測到的腹瀉強度百分數(shù)。以腹瀉強度百分數(shù)展示結(jié)果(從4個獨立實驗中計算平均值土SEM)，100%腹瀉強度對應(yīng)于在陽性對照(由變態(tài)反應(yīng)原致敏和攻擊)組中出現(xiàn)的癥狀。
[0143]實施例1:
[0144]方法學(xué):
[0145]細菌制備物
[0146]通常認為活的益生菌對宿主免疫系統(tǒng)遞送的健康益處是菌株特異性的。已經(jīng)顯示誘導(dǎo)高水平的IL-10和/或體外誘導(dǎo)低水平的促炎細胞因子(PBMC測定法)的益生菌是有效的體內(nèi)抗炎菌株(Foligne, B.等人，2007, World J.Gastroenterol.13:236-243)。
[0147]使用若干益生菌菌株以研究熱處理的益生菌的抗炎性質(zhì)。這些菌株為長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)和大腸桿菌Nissle。也測試了包括商業(yè)用于生產(chǎn)Nestl6 Lcl發(fā)酵產(chǎn)物的一些菌株在內(nèi)的若干起子培養(yǎng)物菌株:嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、保加利亞乳桿菌NCC15和乳酸乳球菌NCC2287。
[0148]在對每一菌株優(yōu)化的條件下在5-15L的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細菌細胞。全部的典型細菌生長培養(yǎng)基為可用的。此類培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。當(dāng)調(diào)整pH至5.5時，連續(xù)地加入30%堿溶液(NaOH或Ca(OH)2)。當(dāng)足夠時，通過用CO2充氣頂部空間維持厭氧的條件。在標(biāo)準需氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌。
[0149]通過離心(5000xg，4°C)收集細菌細胞并且重懸于足夠體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)中以達到約109-101(lCfu/ml的最終濃度。一部分制備物與15%甘油冷凍在_80°C。通過以下方法熱處理另一部分細胞:
[0150]-超高溫:140°C達15秒；通過間接蒸汽注射。
[0151]-高溫短時(HTST):通過間接蒸汽注射74°C、90°C和120°C處理15秒。
[0152]-在水浴中長時間低溫度(85°C，20分鐘)
[0153]熱處理后，在_80°C凍存樣品直到使用。[0154]細菌制備物的體外免疫譜分析: [0155]評價活的和熱處理的細菌制備物的免疫譜(即從體外人血細胞誘導(dǎo)特定細胞因子分泌的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細胞(PBMCs)。在通過細胞密度梯度分離之后，收集單核細胞并用Hank平衡鹽溶液洗滌兩次。隨后在用10%胎牛血清(Bioconcept，Paris,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和0.1 %慶大霉素補充的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(MDM，Sigma)中重懸細胞。隨后在48孔板中用活的和熱處理的細菌(相當(dāng)于7xl06cfu/孔)溫育PBMC(7xl05個細胞/孔)達36小時。在來自8個個體供體的PBMC上測試活的和熱處理的細菌的作用，所述個體供體被分至兩個分離的實驗。在溫育36小時之后，冷凍并在-20°C保存培養(yǎng)板直到細胞因子測量。對活細菌和它們熱處理的對應(yīng)物平行地實施(即，在同一實驗中對同一批PBMC實施)細胞因子譜分析。
[0156]在36小時溫育后依照制造者的說明書通過ELISA(R&D DuoSet Human IL-10、BDOptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF a、BD OptEIA人IFN- Y )確定在細胞培養(yǎng)物上清液中的細胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、和 TNF-a是促炎細胞因子，而IL-1O是強效的抗炎介質(zhì)。用4個個體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM表示結(jié)果，并且結(jié)果代表了兩個單獨實驗，每一個所述單獨實驗用4個供體實施。對每一菌株計算IL-12p40/IL-10的比率作為體內(nèi)抗炎作用的預(yù)測值(Folign6，B.，等人，2007，WorldJ.Gastroenterol.13:236-243)。
[0157]把對每一菌株通過ELISA(見上)確定的細胞因子數(shù)值(pg/ml)轉(zhuǎn)移入BioNumerics v5.10 軟件(Applied Maths, Sint-Martens-Latem,比利時)。在此數(shù)據(jù)集上實施主成分分析(PCA，量度技術(shù))。此分析包括就特征減去平均值和就特征除以方差。
[0158]結(jié)果
[0159]通過超高溫(UHT)/高溫短時(HTST)樣處理生成的抗炎譜
[0160]將研究中的益生菌菌株進行一系列熱處理(超高溫(UHT)、高溫短時(HTST)和85°C達20分鐘)并且把它們的免疫譜和體外活細胞的那些免疫譜相比較。當(dāng)與人PBMC —起溫育時活微生物(益生菌和/或乳品起子培養(yǎng)物)誘導(dǎo)了不同水平的細胞因子產(chǎn)生(圖
1、2、3、4和5)。這些微生物的熱處理以溫度依賴性的方式改變了由PBMC生產(chǎn)的細胞因子的水平?！岸虝r高溫”處理(120°C或140°C，15秒)產(chǎn)生了具有抗炎免疫譜的非復(fù)制型細菌(圖1、2、3和4)。實際上，UHT-樣處理的菌株(140°C，15秒)誘導(dǎo)了更少的促炎細胞因子(TNF- a，IFN- y，IL_12p40)，同時維持或誘導(dǎo)額外的IL-10產(chǎn)生(與活的對應(yīng)物相比)。對于任何UHT-樣處理的菌株，獲得的IL-12p40/IL-10比率與活細胞相比更低(圖1、2、3和4)。對于由HTST-樣處理處理的細菌，即受到120°C持續(xù)15秒(圖1、2、3和4)、或74°C和90°C持續(xù)15秒(圖5)處理的細菌，這一觀察結(jié)果也是有效的。熱處理(UHT-樣或HTST-樣處理)對益生菌菌株(圖1、2、3和5)和乳品起子培養(yǎng)物(圖4)的體外免疫譜具有相似的效果。對用活的和熱處理的(140°C，15秒)益生菌和乳品起子菌株生成的PBMC數(shù)據(jù)的主成分分析揭示了活的菌株全部沿X軸分散，表明菌株表現(xiàn)出非常不同的體外免疫譜，從低(左偵?促炎細胞因子的誘導(dǎo)物到高(右側(cè))促炎細胞因子的誘導(dǎo)物。熱處理的菌株聚集在圖表左側(cè)，顯示了熱處理菌株更少誘導(dǎo)促炎細胞因子(圖6)。與之相反，在85°C達20分鐘的熱處理的細菌比活細胞誘導(dǎo)更多的促炎細胞因子和更少的IL-10，導(dǎo)致更高的IL-12p40/IL-1O比率(圖7)。
[0161]UHT-樣和HTST-樣處理增強或生成抗炎譜。
[0162]不管它們各自初始的免疫譜(活細胞)，UHT和HTST處理的菌株表現(xiàn)出抗炎譜。已表明，在“短時高溫”處理以后，已知為體內(nèi)抗炎且體外表現(xiàn)抗炎譜的益生菌菌株(長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)表現(xiàn)出增強的體外抗炎譜。如圖1中所示，UHT-樣處理的雙歧桿菌屬菌株的IL-12p40/IL-10比率低于來自活的對應(yīng)物的那些比率，因此顯示了 UHT-樣處理的樣品的提高的抗炎譜。更突出地，對于非抗炎的活菌株也確認了由HUT-樣和HTST-樣處理產(chǎn)生抗炎譜?；钍罄钐侨闂U菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461都表現(xiàn)出體外高IL-12p40/IL_10比率(圖2和5)。顯示了這兩種活菌株對小鼠中TNBS-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是非保護性的。在“短時高溫”處理(UHT或HTST)以后，由鼠李糖乳桿菌NCC4007和類干酪乳桿菌NCC2461誘導(dǎo)的IL-12p40/IL_10比率劇烈下降，達到與用雙歧桿菌屬菌株獲得的水平一樣低的水平。這些低IL-12p40/IL-10比率由于與沒有變化(鼠李糖乳桿菌NCC4007)或劇烈誘導(dǎo)(類干酪乳桿菌NCC2461)的IL-10分泌相結(jié)合的低水平IL-12p40產(chǎn)生所致(圖2)。
[0163]因此:
[0164]-通過UHT-樣和HTST-樣熱處理能夠增強活微生物的抗炎譜(例如長雙歧桿菌NCC2705、長雙歧桿菌NCC3001、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818)。
[0165]-通過UHT-樣和HTST-樣熱處理能夠從非抗炎活微生物產(chǎn)生抗炎譜(例如鼠李糖乳桿菌NCC4007、類干酪乳桿菌NCC2461、乳品起子嗜熱鏈球菌NCC2019)。
[0166]-對于從可商購的產(chǎn)品(包含益生大腸桿菌菌株)分離的菌株也顯示了抗炎譜(圖 3A&B)。
[0167]對于所有測試的益生菌和乳品起子例如乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌，UHT/HTST-樣處理的影響是相似的。
[0168]將UHT/HTST-樣處理施用于表現(xiàn)出不同體外免疫譜的若干乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌。與它們活的對應(yīng)物相比，在UHT/HTST-樣處理以后所有菌株誘導(dǎo)更少的促炎細胞因子(圖1、2、3、4、5和6)，這證實了 UHT/HTST-樣處理對獲得的非復(fù)制型細菌的免疫性質(zhì)的作用能夠概括至全部益生菌，特別是概括至乳桿菌屬和雙歧桿菌屬和特定的大腸桿菌株以及概括至全部乳品起子培養(yǎng)物，特別是概括至鏈球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。
[0169]實施例2:
[0170]方法學(xué):
[0171]細菌制備物:
[0172]使用5株益生菌菌株以研究非復(fù)制型益生菌的免疫增強性質(zhì):3株雙歧桿菌(長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、短雙歧桿菌NCC2950)和2株乳桿菌(類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007)。
[0173]在37°C、無pH控制下以分批發(fā)酵使細菌細胞在MRS上生長達16-18小時。把細菌細胞離心下來(5，000xg，4°C)并重懸于磷酸鹽緩沖液中，然后在鹽水中稀釋，以達到約10E10cfu/ml的最終濃度。在水浴中在85°C將長雙歧桿菌NCC3001、乳雙歧桿菌NCC2818、類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007熱處理20分鐘。在水浴中在90°C將短雙歧桿菌NCC2950熱處理30分鐘。將熱處理的細菌懸液等分(aliquoted)并凍存于_80°C直到使用?；罴毦A存在-80°C、15% PBS-甘油中直到使用。
[0174]細菌制備物的體外免疫譜分析
[0175]評價活的和熱處理的細菌制備物的免疫譜(即體外誘導(dǎo)人血細胞特定細胞因子分泌的能力)。從血液過濾器分離人外周血單核細胞(PBMCs)。在通過細胞密度梯度分離之后，收集單核細胞并用Hank平衡鹽溶液洗滌兩次。隨后在用10%胎牛血清(Bioconcept，Paris,法國)、1% L-谷氨酰胺(Sigma)、I %青霉素/鏈霉素(Sigma)和0.1 %慶大霉素補充的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(MDM，Sigma)中重懸細胞。隨后在48孔板中用活的和熱處理的細菌(相當(dāng)于7xl06cfu/孔)溫育PBMC(7xl05個細胞/孔)達36小時。在來自8個個體供體的PBMC上測試活的和熱處理的細菌的作用，所述個體供體被分至兩個分離的實驗。在溫育36小時之后，冷凍并在-20°C保存培養(yǎng)板直到細胞因子測量。對活細菌和它們熱處理的對應(yīng)物平行地實施(即，在同一實驗中對同一批PBMC實施)細胞因子譜分析。
[0176]在36小時溫育后依照制造者的說明書通過ELISA(R&D DuoSet Human IL-10, BDOptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF、BD OptEIA人IFN- Y )確定在細胞培養(yǎng)物上清液中的細胞因子(IFN-Y、IL-12p40、TNF-a 和 IL-10)的水平。IFN-Y、IL_12p40、TNF-α 是促炎細胞因子，而IL-1O是強效的抗炎介質(zhì)。用4個個體供體的平均值(pg/ml)+/-SEM表示結(jié)果，并且結(jié)果代表了兩個單獨實驗，每一個所述單獨實驗用4個供體實施。
[0177]活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950在預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性腹瀉中的體內(nèi)作用
[0178]使用變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的小鼠模型以測試短雙歧桿菌NCC2950的Thl促進作用(Brandt Ε.B 等人.JCI2003 ;112 (11):1666-1667)。在致敏(間隔 14 天，在第 O 和第 14 天2次腹膜內(nèi)注射卵清蛋白(OVA)和硫酸鋁鉀)之后，用OVA 口服攻擊雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)，導(dǎo)致瞬時的臨床癥狀(腹瀉)和免疫參數(shù)(總IgE、0VA特異性的IgE、小鼠肥大細胞蛋白質(zhì)酶I即MMCP-1的血漿濃度)的改變。在OVA致敏之前四天(第-3、-2、_1、0天和第11、12、13和14天)和在攻擊期間(第23至39天)通過管飼法施用活的或在90°C熱處理30分鐘的短雙歧桿菌NCC2950。使用約IO9菌落形成單位(cfu)或相當(dāng)?shù)腸fu/小鼠的日細菌劑量。
[0179]益果
[0180]熱處理后“促炎”細胞因子分泌的誘導(dǎo)
[0181]體外評估熱處理的細菌菌株刺激人外周血單核細胞(PBMC)分泌細胞因子的能力。在相同的體外測定法中將經(jīng)熱處理的細菌刺激PBMC的基于4種細胞因子的免疫譜與活細菌細胞誘導(dǎo)的基于4種細胞因子的免疫譜相比較。
[0182]將熱處理的制備物平板接種并評估活菌數(shù)的缺乏。熱處理的細菌制備物在平板接種后不產(chǎn)生菌落。
[0183]當(dāng)與人PBMC —起溫育時活的益生菌誘導(dǎo)不同的和菌株依賴性水平的細胞因子產(chǎn)生(圖8)。與它們的活的對應(yīng)物相比，益生菌的熱處理改變了 PBMC產(chǎn)生的細胞因子的水平。熱處理的細菌比它們的活的對應(yīng)物誘導(dǎo)更多的促炎細胞因子(TNF-α、IFN-Y和IL-12p40)。相反,與活細胞對比,熱處理的細菌誘導(dǎo)相似或更低量的IL-10 (圖8)。這些數(shù)據(jù)顯示了熱處理的細菌比它們的活的對應(yīng)物更能夠刺激免疫系統(tǒng)且因此更能夠增強弱化的免疫防御。換言之，體外數(shù)據(jù)說明了在熱處理之后細菌菌株的提高的免疫增強效果。[0184]為了說明熱處理的短雙歧桿菌NCC2950對免疫系統(tǒng)的增強的作用(與活細胞相比)，在變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的動物模型中測試活的和熱處理的短雙歧桿菌NCC2950 (菌株A)。
[0185]與陽性對照組相比，在用熱處理的短雙歧桿菌NCC2950處理后，腹瀉的強度顯著地和持續(xù)地下降(41.1% ±4.8)，而在用活的短雙歧桿菌NCC2950處理后腹瀉的強度僅降低了 20±28.3%。這些結(jié)果顯示了熱處理的短雙歧桿菌NCC2950表現(xiàn)出比它的活的對應(yīng)物增強的對變態(tài)反應(yīng)性腹瀉的保護作用(圖9)
[0186]因此，顯示了在熱處理后益生菌增強免疫防御的能力被提高了。
[0187]其他實施例:
[0188]可以使用本專利申請中描述的標(biāo)準技術(shù)制備下列寵物食物組合物:
【權(quán)利要求】
1.包含非復(fù)制型益生微生物的寵物食物組合物，所述益生微生物的量相當(dāng)于每份約IO6 至 IO12CfUo
2.根據(jù)權(quán)利要求1的寵物食物組合物，其大約包含約4至40重量％的干重脂肪、約12至70重量％的干重糖類和約12至約50重量％的干重蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的寵物食物組合物，其大約包含約10至20重量％的干重脂肪、約30至60重量％的干重糖類和約20至約35重量％的干重蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其還包含約0.5至40重量％干重，優(yōu)選約0.5至30重量％干重，更優(yōu)選約I至20重量％干重，最優(yōu)選約I至10重量％干重的膳食纖維。
5.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其中寵物食物組合物選自寵物食物、寵物營養(yǎng)飲食、寵物補充劑、寵物零食和寵物的食物玩具，如可咀嚼和可消耗的玩具。
6.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其還包含益生元，例如低聚果糖和菊粉。
7.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其中益生微生物是通過熱處理成為非復(fù)制型的，優(yōu)選通過在至少71.5°C處理至少I秒的高溫處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的寵物食物組合物，其中熱處理為在約71.5-150°C處理約1-120秒的高溫處理，并且優(yōu)選為高溫/短時(HTST)處理或超高溫(UHT)處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的寵物食物組合物，其用于預(yù)防或治療炎性疾病。`
10.根據(jù)權(quán)利要求7的寵物食物組合物，其中熱處理在約70-150°C溫度范圍內(nèi)進行約3分鐘-2小時，優(yōu)選在80-140°C范圍內(nèi)進行5分鐘-40分鐘。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的寵物食物組合物，其用于預(yù)防或治療與受損的免疫防御相關(guān)的疾病。
12.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其中至少90%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選至少99%、理想地至少99.9%、最理想地全部益生菌為非復(fù)制型的。
13.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其中益生微生物選自雙歧桿菌屬(bifidobacteria)、乳桿菌屬(Iactobacilli)、丙酸桿菌屬(propionibacteria)或它們的組合，例如長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、類干釀乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、約漢遜氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳桿菌(LactobacillusPI ant arum)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、雙乙酸乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcuscremoris)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、大腸桿菌(Escherichia coli)和/或它們的混合物。
14.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其中益生微生物選自長雙歧桿菌NCC3001、長雙歧桿菌NCC2705、短雙歧桿菌NCC2950、乳雙歧桿菌NCC2818、約漢遜氏乳桿菌LaU類干酪乳桿菌NCC2461、鼠李糖乳桿菌NCC4007、路氏乳桿菌DSM17938、路氏乳桿菌ATCC55730、嗜熱鏈球菌NCC2019、嗜熱鏈球菌NCC2059、干酪乳桿菌NCC4006、嗜酸乳桿菌NCC3009、干酪乳桿菌ACA-DC6002(NCC1825)、大腸桿菌Nissle、保加利亞乳桿菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它們的組合。
15.根據(jù)前述項權(quán)利要求之一的寵物食物組合物，其每日劑量含有約0.005mg-1000mg非復(fù)制型微生物 。
【文檔編號】A23K1/18GK103702569SQ201180064176
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月5日
【發(fā)明者】A·梅賽尼爾, G·普里烏特, S·努特恩 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司