專利名稱：一種葡萄無性系品種的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到果樹育種技術(shù)領(lǐng)域，具體指利用現(xiàn)代生物技術(shù)(物理誘變)手段獲得葡萄優(yōu)良無性系品種即一種葡萄無性系品種的育種方法。
背景技術(shù)：
葡萄為葡萄科、葡萄屬植物，起源于黑海和地中海沿岸，是分布最廣泛、適應(yīng)性最強的果樹之一，目前全世界已形成數(shù)千個品種。在我國，北起黑龍江，南至海南島，各省市均有栽培。目前國內(nèi)外對葡萄新品種選育的方法主要有雜交育種、芽變選種，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使用組織培養(yǎng)技術(shù)、誘變技術(shù)、分子標記技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等新型育種技術(shù)培育新品種已經(jīng)成為可能，但成功報道的例子甚少。自然界葡萄容易產(chǎn)生芽變，目前栽培中部分優(yōu)良品種由自然芽變選擇培育成功， 但自然芽變概率較低，利用人工誘變可以大大提高葡萄的變異概率，是選育葡萄優(yōu)良品種的良好途徑，但是利用人工誘變育種葡萄的方法還鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的狀況，提供一種葡萄無性系品種選育的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種葡萄無性系品種選育的方法，通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)的葡萄優(yōu)良單株，該方法包括育種目標的的確定、育種材料的選取、物理誘變劑量的選擇、苗木的培養(yǎng)、變異單株的篩選、變異性狀的分子鑒別等，具體包括下述步驟(1)育種目標的確定以抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)為主要育種目標；(2)育種材料的選取一般選擇具有良好經(jīng)濟性狀(如產(chǎn)量等)但在某些性狀(如成熟期、抗病性等需要改良的形狀)需要改良的品種；誘變種子從品種純正、已經(jīng)進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的植株上采集；具體為當葡萄果實完全成熟(浙江省一般在8 10 月份)，選擇果穗整齊、果粒發(fā)育良好的果實采集種子；種子采集后選擇飽滿的種子，用清水反復(fù)沖洗洗凈粘在種子表面的果肉，然后用20%多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水沖洗后在陰涼處晾干；晾干的種子以5份沙子(沙子相對濕度60%左右)、1份種子混合后置于4 5°C的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6 組，其中1組為對照，5組用于輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用100、150、200、250、300Gy (5組用于
輻照處理，每組對應(yīng)一組輻射強度)的6tlCo Y射線分別對應(yīng)五組要輻照處理的種子進行急性輻射，以無輻射處理為對照，劑量率為lOGy/min ；(4)種子的播種種子播種于育苗床上；育苗床基質(zhì)為體積比6 4的泥炭和谷殼的混合物，基質(zhì)裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，育苗基質(zhì)含有有機質(zhì)30 45g · kg—1，堿解氮 100 130mg · kg-1，速效磷 80 95mg · kg-1，速效鉀 200 230mg · kg-1, ρΗ6· O 7· 5 ；苗床底部鋪8 IOcm厚的卵石、再鋪4 6cm厚的沙子，上層鋪25 30cm厚育苗基質(zhì)；將處理和對照的種子均勻播種于苗床上，行株距IOX IOcm;播種后注意苗床基質(zhì)相對濕度保持60 70% ；(5)苗木的管理播種后14 15天發(fā)芽，當小苗長至5 6葉時定植于大棚設(shè)施中；畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內(nèi)加疏松且已經(jīng)消毒的土壤，株距0. 5m，大棚內(nèi)的溫度保持20 25°C，大棚內(nèi)土壤相對濕度保持60 65%，空氣相對濕度保持65 75%， 培育3 6年后植株開花結(jié)果；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照(對照組苗木)在抗性、植物學(xué)和生物學(xué)特性等方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑒別選擇優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良與對照的幼嫩葉片，利用 ISSR或者SSR標記技術(shù)進行變異基因分析；(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及結(jié)果特性的觀測， 結(jié)合分子鑒別，獲得優(yōu)良單株；將該單株進行無性繁殖，選擇不同的區(qū)域進行試驗，以明確其適種范圍，并總結(jié)適合該單株的一整套栽培措施。上述步驟中育苗基質(zhì)優(yōu)選含有有機質(zhì)38g · kg—1，堿解氮IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg-1，速效鉀 237mg · kg-1, ρΗ6· 3。上述步驟中苗床底部優(yōu)選鋪IOcm厚的卵石、再鋪5cm厚的沙子，上層鋪25cm
厚育苗基質(zhì)。上述步驟中播種后苗床基質(zhì)相對濕度優(yōu)選保持60%。上述步驟(7)中利用ISSR或者SSR標記技術(shù)進行變異基因分析其葡萄最優(yōu) ISSR-PCR 的最佳反應(yīng)體系20μ L PCR 反應(yīng)體積中，MgC121. 75mmol/L, dNTPsO. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1.0U，引物 0. 2ymol/L，10XBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；PCR反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸 1. 5min，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min。)其中引物為利用(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、 (CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA、 (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 等供沈條引物( 條引物同時使用)能擴增出清晰的譜帶且重復(fù)性較好。上述步驟(8)所述的無性繁殖如扦插、嫁接等。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果1.本發(fā)明成功采用6tlCo Y射線人工誘變，獲得變異概率高、操作安全穩(wěn)定的葡萄育種。2.本發(fā)明的葡萄育種方法，通過確定照射劑量、劑量率、照射后種子的播種環(huán)境條件控制、苗木的管理、篩選、變異性狀的分子鑒別、優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣等，得到一套完整的抗病、早熟(成熟期可提早10 15天)、優(yōu)質(zhì)的葡萄人工誘變育種方法，成功實現(xiàn)了葡萄人工誘變育種。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述(以“鄞紅”葡萄品種誘變選育新品種為例)，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。實施例以“鄞紅”為例，“鄞紅”為寧波地區(qū)推廣的優(yōu)良品種，屬歐美雜交種，其樹勢強，葉色濃，葉面光滑無毛。一般穗重500 700克。果實橢圓形，平均粒重12克左右。果皮紫紅色，風(fēng)味濃郁。寧波地區(qū)大棚保護地栽培之成熟期一般為7月底至8月中旬。(1)育種目標的確定以早熟為主要育種目標，其它特性與“鄞紅”相近。(2)育種材料的選取誘變種子從品種純正、已經(jīng)進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的“鄞紅”植株上采集。當葡萄果實完全成熟，浙江省一般在8月中旬左右，選擇果穗整齊、果粒發(fā)育良好的果實采集種子，種子采集后選擇飽滿的種子，用清水反復(fù)沖洗洗凈粘在種子表面的果肉，然后用20 %多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水沖洗后在陰涼處晾干。晾干的種子用5份沙子(沙子相對濕度60%左右)、1份種子混合后置于5°C左右的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6組，其中1組為對照 (不進行輻照處理)，5組用于輻照處理。(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用100、150、200、250、300Gy(即需要
輻照處理的5組用于輻照處理種子，每組對應(yīng)一種輻照強度)的6tlCo Y射線處理，以無輻射處理為對照，劑量率為lOGy/min。(4)種子的播種種子(輻照處理和未輻照處理的種子)播種于育苗床上；育苗床基質(zhì)為體積比6 4的泥炭和谷殼的混合物，基質(zhì)裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，基質(zhì)含有有機質(zhì) 38g · kg—1，堿解氮 IlOmg · kg—1，速效磷 87mg · kg—1，速效鉀 237mg · kg—1，ρΗ6· 3。苗床底部一般鋪IOcm左右厚的卵石、再鋪5cm厚左右的沙子，上層鋪育苗基質(zhì)，約25cm厚。將處理和對照的種子均勻播種于苗床上，行、株距10 X IOcm0播種后注意苗床基質(zhì)相對濕度保持60%左右。(5)苗木的管理播種后15天左右發(fā)芽，當小苗長至5 6葉時定植于大棚設(shè)施中。一般畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內(nèi)加疏松且已經(jīng)消毒的土壤，株距一般0. 5m, 大棚內(nèi)的溫度一般保持20 25°C，溫度過高時注意通風(fēng)，大棚內(nèi)土壤相對濕度保持60 %左右、空氣相對濕度保持70%左右，一般培育3年后植株開花結(jié)果。(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照在抗性、植物學(xué)和生物學(xué)特性等方面有明顯差異的單株。(7)變異性狀的分子鑒別根據(jù)育種目標，選擇成熟期較早且其余經(jīng)濟性狀同“鄞紅”相似的優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良單株與對照組單株的幼嫩葉片，利用ISSR或者SSR標記技術(shù)進行變異基因分析；葡萄ISSR-PCR 的反應(yīng)體系20μ L PCR 反應(yīng)體積中，MgC121. 75mmol/L, dNIPsO. 20mmol/L，Taq 聚合酶 1. 0U，弓 | 物 0. 2 μ mol/L，IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2μ L ；所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，50-60°C退火lmin， 72°C延伸1.5min，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min。采用的引物為(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA)8T、(GA)8C、(CT)8Τ、(CT)8Α、(CT)8G、 (CA) 8Α、(CA) 8G、(TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、 (GA) 8YC, (CT) 8RG、(CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共洸條引物，擴增出清晰的譜帶且重復(fù)性較好。(D = (A, G，T)，V = (A，C，G)，R = (A, G)，Y = (C，T))(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及結(jié)果特性的觀測， 結(jié)合分子鑒別，獲得優(yōu)良單株。我們以“鄞紅”葡萄誘變，獲得一優(yōu)良單株，其綜合性狀與“鄞紅”形似，但成熟期比 “鄞紅”可提早15天左右；將該單株進行無性繁殖(如扦插、嫁接)，在寧波地區(qū)進行三點二年試驗，試驗結(jié)果表明適合寧波地區(qū)推廣，并總結(jié)了適合該單株的一整套栽培措施。
權(quán)利要求
1.一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)的葡萄優(yōu)良單株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于育種方法的具體步驟包括(1)育種目標的確定以抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)為主要育種目標；(2)育種材料的選取選擇具有良好經(jīng)濟性狀但在某些性狀需要改良的品種，誘變種子從品種純正、已經(jīng)進入盛果期、生長健壯、無病蟲害的植株上采集；當葡萄果實完全成熟， 選擇果穗整齊、果粒發(fā)育良好的果實采集種子，種子采集后選擇飽滿的種子，用清水反復(fù)沖洗洗凈粘在種子表面的果肉，然后用20 %多菌靈1000倍液浸泡15分鐘消毒，再用清水沖洗后在陰涼處晾干；晾干的種子用5份沙子、1份種子混合后置于4 5°C的冰箱中貯藏；第二年2 3月將種子進行分組，每300粒為一組，分為6組，其中1組為對照，5組用于輻照處理；(3)物理誘變劑量的選擇通過預(yù)備試驗，采用100、150、200、250、300Gy的6tlCoγ射線分別對應(yīng)五組要輻照處理的種子進行急性輻射，以無輻射處理為對照，劑量率為IOGy/ min ；(4)種子的播種種子播種于育苗床上；育苗床基質(zhì)為體積比6 4的泥炭和谷殼的混合物，基質(zhì)裝盆前用高壓滅菌鍋進行消毒，育苗基質(zhì)含有有機質(zhì)30 45g · kg—1，堿解氮 100 130mg · kg-1,速效磷 80 95mg · kg-1,速效鉀 200 230mg · kg-1, ρΗ6· 0 7· 5 ；苗床底部鋪8 IOcm厚的卵石、再鋪4 6cm厚的沙子，上層鋪25 30cm厚育苗基質(zhì)；將處理和對照的種子均勻播種于苗床上，行株距IOXlOcm ；播種后注意苗床基質(zhì)相對濕度保持 60 70% ；(5)苗木的管理播種后14 15天發(fā)芽，當小苗長至5 6葉時定植于大棚設(shè)施中； 畦寬2. 5m，定植前挖定植溝，定植溝內(nèi)加疏松且已經(jīng)消毒的土壤，株距0. 5m，大棚內(nèi)的溫度保持20 25°C，大棚內(nèi)土壤相對濕度保持60 65%，空氣相對濕度保持65 75%，培育 3 5年后植株開花結(jié)果；(6)變異單株的篩選在苗木生長期間，仔細觀測不同處理的生物學(xué)、植物學(xué)性狀，選擇與對照在抗性、植物學(xué)和生物學(xué)特性方面有明顯差異的單株；(7)變異性狀的分子鑒別選擇優(yōu)良單株，采集該優(yōu)良與對照的幼嫩葉片，利用ISSR或者SSR標記技術(shù)進行變異基因分析；(8)優(yōu)良單株的區(qū)域試驗和推廣通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀以及結(jié)果特性的觀測，結(jié)合分子鑒別，獲得優(yōu)良單株；將該單株進行無性繁殖，選擇不同的區(qū)域進行試驗，以明確其適種范圍，并總結(jié)適合該單株的一整套栽培措施。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述步驟 (4)中育苗基質(zhì)含有有機質(zhì)38g · kg—1，堿解氮IlOmg · kg—1，速效磷87mg · kg—1，速效鉀 237mg · kg-1, pH6. 3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述步驟中苗床底部鋪IOcm厚的卵石、再鋪5cm厚的沙子，上層鋪25cm厚育苗基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述步驟中播種后苗床基質(zhì)相對濕度保持在60%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述步驟(7)中利用ISSR或者SSR標記技術(shù)進行變異基因分析其葡萄ISSR-PCR的反應(yīng)體系為20μ LPCR 反應(yīng)體積中，MgCl2L 75mmol/L，dNTPs 0. 20mmol/L, Taq 聚合酶 1. 0U，引物 0. 2 μ mol/L, IOXBuffer 2. 0 μ L, ddH20 13. 2 μ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，50 60°C退火lmin，72°C延伸1. 5min， 進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于所述的引物為(AG)8T、(AG)8C、(AG)8C、(GA) 8T、(GA) 8C、(CT) 8Τ、(CT) 8Α、(CT) 8G、(CA) 8Α、(CA) 8G、 (TC) 8C、(TC) 8G、(AC)8T、(AC)8C、(AC)8G、(AG)8YT、(AG) 8YA, (GA) 8YT、(GA) 8YC, (CT) 8RG、 (CA) 8RT、(CA) 8RC、(AC)8YT、(AC) 8YA, (AC) 8YG, (GGAGA) 3 共 26 條引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于步驟(8)所述的無性繁殖為扦插或嫁接。
全文摘要
本發(fā)明公開一種葡萄無性系品種的育種方法，其特征在于通過人工物理誘變的方式，獲得抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)的葡萄優(yōu)良單株。具體為育種目標確定→采集飽滿成熟的種子→物理誘變——劑量100-300Gy的60Coγ射線、以劑量率為10Gy/min→種子播種→3～6年苗木培育→單株選擇通過生物學(xué)、植物學(xué)性狀、經(jīng)濟特性等的觀測選擇→變異性狀的基因分析→優(yōu)良單株區(qū)域試驗→栽培措施總結(jié)→推廣。本發(fā)明的方法獲得的優(yōu)良單株具有抗病、早熟、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)點。
文檔編號A01H1/04GK102524055SQ201210005630
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者吳月燕, 崔鵬, 王忠華 申請人:浙江萬里學(xué)院