專利名稱：一株甘蔗內生固氮泛菌屬細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地涉及ー株具有固氮作用及拈抗病原真菌的甘蔗內生固氮泛菌屬細菌。
背景技術：
農業(yè)微生物資源是生命科學資源寶庫的重要組成部分，是微生物保藏菌種庫源，又是微生物開發(fā)利用的源泉，充分發(fā)揮農業(yè)微生物資源寶庫的作用，積極發(fā)掘新的生防微生物資源是農業(yè)微生物資源開發(fā)研究的重要內容。內生固氮菌是指那些定殖在植物內部與宿主植物聯合固氮的微生物，主要是細菌，它們的部分或整個生活周期寄居在植物組織特別是營養(yǎng)繁殖的組織中生存、繁衍、傳播而不會對植物引起明顯的損害。對內生固氮菌最早的認識來自于禾本科作物和牧草。如20世紀80年代末以來，D6bereiner實驗室先后從甘鹿體內分尚得到幾種具有特殊生理生化特性的固氮菌，包括 Gluconacetobacter(Acetobacter；diazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae,Herbaspirillum rubrisubalbicans 和 Burkholderia spp.。在巴西之后，這些屬的固氮菌相繼從美洲其他國家、澳洲和亞洲種植甘蔗的體內被分離。在亞洲，這些屬的固氮菌已在印度、菲律賓和日本等國種植的甘蔗體內被分離。近年國內外的研究者先后對不同地域的甘蔗、水稻、小麥、燕麥、玉米、大麥、高粱、甘薯及卡拉草等植物中的內生固氮菌進行了分離研究。研究證明，內生固氮菌避免了化合態(tài)氮的抑制及土著微生物的競爭，更有利于充分發(fā)揮固氮效能，分泌固氮產物直接供給植物吸收，表現出更高的固氮效率。近年來，大量施用化肥造成的肥料浪費及土壌、地下水體污染已引起了世界各國的廣泛重視。減少化肥施用，提高氮肥利用率是當前農業(yè)生產的重要任務。利用生物固氮是減少氮肥施用量最為有效的途徑，生物固氮資源的研究、開發(fā)和利用在我國農業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位。植物內生固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時具有分泌生長素、溶磷、增強植株抗病性、抗逆境等多方面的促進植物生長的作用。因此，聯合(內生)固氮菌是ー類非常有發(fā)展前景的農業(yè)微生物資源，充分發(fā)揮聯合固氮菌的固氮促生長及抗病性能，對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。據相關資料統(tǒng)計，全球毎年因病害導致的大田農作物減產達20%，嚴重為害時可達可造成50%的損失，甚至絕收。目前，控制植物病害的主要手段是使用化學殺菌劑，但它在作物中以及環(huán)境中的殘留毒性對人類健康有潛在危險，已成為全社會關心的問題。隨著科學技術的不斷發(fā)展進步，減少使用化學農藥，保護人類生存環(huán)境的呼聲日益高漲，且早已引起人們的高度重視。為了保護環(huán)境，維護生態(tài)平衡和人類健康安全，開發(fā)和使用具有生防作用的農業(yè)微生物資源已成為現代農業(yè)發(fā)展的ー個方向。目前已發(fā)現聯合固氮菌的宿主植物大多為具有重要價值的作物如甘蔗、水稻、小麥、玉米、牧草等不能自主固氮的禾本科植物。針對長期単一施用化學肥料帶來的土壌肥力下降，農產品品質下降和農業(yè)環(huán)境污染加劇等一系列對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的負面影響，積極發(fā)掘和利用聯合固氮作用的潛力對農業(yè)可持續(xù)發(fā)展更具特殊的意義。廣西是我國最大的蔗糖生產產區(qū)，甘蔗及蔗糖產量占全國60%以上。但是，一直以來我國甘蔗生產成本高，缺乏國際競爭力。在甘蔗生產的各項農資投入中，化肥尤其是氮肥所占比重最大，其對甘蔗產量的影響也最為顯著。此外，我國甘蔗主產區(qū)蔗地90%以上為旱坡地，土壌保水、保肥能力差，化肥利用率很低。近年來，甘蔗生產上受到各種病害的危害，特別是甘蔗黑穗病、宿根矮化病、鳳梨病、赤腐病等的普遍發(fā)生也成為蔗糖產業(yè)發(fā)展的重要限制因子。因此，充分發(fā)揮蔗地生態(tài)系統(tǒng)中聯合固氮菌的固氮及拈抗病原菌等促生潛力，對提高我國甘蔗的生產能力，保護和改善甘蔗的生態(tài)環(huán)境，促進經濟可持續(xù)發(fā)展具有重要的經濟和社會意義。因此 ，分離篩選具有促進甘蔗生長及拈抗病原真菌的內生固氮菌，可為甘蔗生產上實現節(jié)肥減耗、加強甘蔗生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)提供科學基礎和技術支持。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一株具有高效聯合固氮及拈抗病原真菌性能的甘蔗內生固氮菌，同時開發(fā)該內生固氮細菌的應用。本發(fā)明采取的技術方案本發(fā)明所述的甘鹿內生固氮菌屬于泛菌屬(Pantoea sp.)細菌,該菌株已于2011年11月3日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為 CGMCC No. 5438。該菌株由甘蔗莖部組織分離獲得，通過無氮培養(yǎng)基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nifH擴增及序列分析，確定其為甘蔗內生固氮菌，含有固氮酶基因nifH，菌株與甘蔗組培苗的聯合固氮效率為12.85%。經菌株形態(tài)、16S rDNA序列分析、Biolog系統(tǒng)分析，把該菌株鑒定為腸桿菌科泛菌屬Pantoea sp.細菌。菌株命名為NN08200，其最適生長溫度為28-30°C，最適生長pH為7 8。該菌對甘蔗、玉米幼苗的生長具有顯著的促進作用，并且對甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea SycL )、甘Ik鳳楽病菌[Ceratocystis paradoxa(Dode；Moreau] >甘鹿赤腐病菌(Colletotrichum Falcatum)、甘鹿虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)、玉米大斑病菌[Exserohilum turcicum (Pass. ) Leonard et Suggs]、玉米小斑病菌[Cochliobolus heterostrophus (Drechsler)Drechsler]等多種重要真菌性病害的病原菌具有較強的拈抗作用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述的泛菌屬(Pantoea sp.)細菌菌株NN08200,保藏號CGMCC No. 5438,能顯著促進植物生長并且拈抗多種植物病原真菌。利用該菌接種甘蔗組培苗50d后植株干重和總氮含量分別比空白對照增加了 46. 74%和41.5%，固氮效率為12. 85% ;接種菌株NN08200的玉米幼苗地上部分干重比對照增加74. 5%，地下部分増加84.6%，株高比對照增加16. 3%，葉綠素含量增加了 29.2%，含氮量增加了 27.0%。本發(fā)明所述的Pantoea sp.菌株具有聯合固氮、分泌生長素等促植物生長的作用，同時能拈抗多種重要植物病原菌，利用平板對峙法檢測抑菌試驗結果表明NN08200對引起甘蔗虎斑病的立枯絲核菌(R. Solani)生長的抑制效果達86. 9%，對甘蔗黑穗病菌(U. scitaminea)的抑制率達78. 4%。本發(fā)明菌株可應用于生產具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌劑和生物有機月巴，對于減少化肥農藥的使用、保護生態(tài)環(huán)境具有重要意義，并有廣闊的應用前景。


圖I接種菌株NN08200對甘蔗生長的促進作用。圖2接種菌株NN08200對玉米幼苗生長的促進作用。圖3菌株NN08200對玉米小斑病菌的抑制作用。圖4菌株NN08200對甘蔗虎斑病菌(立枯絲核菌)的抑制作用。圖5菌株NN08200分泌IAA特性的比色反應。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明。實施例I本發(fā)明菌株的分離取甘蔗蔗莖，在超凈工作臺上先用70%酒精浸30s，無菌水洗3次，再用0. 1%升萊浸Imin, 70%酒精浸30s,無菌水洗5次。稱取Ig表面滅菌的組織塊浸于IOmL磷酸鹽緩沖液在無菌的研缽中研碎后靜置5min，取上清液用無菌水做10倍系列稀釋，分別取原液和稀釋液100 y L鋪在Ashby無氮培養(yǎng)基(成份為蔗糖10g，NaCl 0. 2g，KH2PO4O. 2g，MgSO4 7H200. 2g, CaSO4 2H20 0. lg, CaCO3 5g，蒸餾水 IOOOmL, pH 7. 0)平板上，在 28°C培養(yǎng)2-3d至長出單菌落。菌落長出后，在Ashby無氮培養(yǎng)基平板上用劃線法進行菌種純化。實施例2本發(fā)明菌株的固氮酶活性采用こ炔還原こ烯法(acetylene reduction assay, ARA)測定固氮酶活性。將NN08200活化后在Ashby液體培養(yǎng)基中生長48h，取ImL菌液接種于滅菌的含IOmL Ashby液體培養(yǎng)基的60mL磨ロ小口瓶中，培養(yǎng)24h后從瓶內抽出5mL氣體，然后再注入5mL乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用氣相色譜儀檢測こ烯生成量，以nmolC2H4/h. mL表示固氮酶活性。以巴西甘鹿內生固氮菌G. diazotrophicusPAL5為陽性對照，以接種ImL滅活菌液的處理作為空白對照。實驗結果表明，本發(fā)明菌株的固氮酶的こ炔還原こ烯活性約為2445nmol C2H4/h,高于陽性對照巴西甘鹿內生固氮菌模式菌株G. diazotrophicus PAL5的固氮酶活性1675nmolC2H4/h。實施例3本發(fā)明菌株的nifH基因及16S rDNA的克隆分析PCR擴增模板的制備將菌株NN08200活化后接種到LB液體培養(yǎng)基(成分為胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 0)，培養(yǎng)20h后離心收集菌體備用。用細菌基因組DNA提取試劑盒，按產品說明書從新鮮的細菌LB培養(yǎng)物中提取本發(fā)明菌株的基因組DNA，保存于-20°C，DNA含量約為50_100ng/ UしnifH 基因分析擴增引物為 PolyF(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和PolyR(ATSGCCATCATYTCRCCGGA), PCR 反應程序為94°C 3min 預變性，然后進行 94°C lmin,55°C lmin，72°C lmin，30個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴增產物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以固氮葡糖醋酸桿菌G. diazotrophicusPAL5菌株(Gillis et al. , 1989)為陽性對照，以大腸桿菌E. coli DH5 a菌株為陰性對照。將nifH擴增產物回收以后克隆到T載體上，按寶生物工程(大連)有限公司(簡稱TaKaRa)的pMDTM18_T Vector克隆試劑盒說明來操作。經PCR驗證的陽性克隆送上海生エ生物工程公司測序，測序結果在GenBank登錄和比對分析。
菌株的16S rDNA序列分析利用細菌16S通用引物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)擴增細菌的 16SrRNA基因。PCR 反應程序為94°C 3min 預變性，然后進行94°C 55s, 50°C 50s, 72°C lmin，35個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴增產物進行I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物回收以后克隆到T載體上，選擇陽性克隆送上海生エ生物工程公司測序，測序結果在GenBank登錄和比對分析。nifH PCR擴增得到的片段測序后發(fā)現本 發(fā)明菌株含有鑰鐵固氮酶鐵蛋白基因nifH序列；16S rDNA序列分析結果表明本發(fā)明菌株與泛菌屬(Pantoea sp.)細菌的同源性
最聞98 % o實施例4本發(fā)明菌株的Biolog鑒定在LB平板活化菌株，挑取單菌落至BUG瓊脂培養(yǎng)基平板，30°C，培養(yǎng)16_24h。用無菌棉簽將BUG瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌體懸浮于0. 85% NaCl溶液，調節(jié)菌懸液OD6tltl為0. 2，取150ii L菌液加入Biolog-GN2板的96孔，30°C培養(yǎng)。分別在4_6h和16_24h用BIOLOG微生物自動鑒定儀及Biolog Microstation 4. 20. 05系統(tǒng)檢測和分析代謝指數。Biolog微生物鑒定系統(tǒng)檢測顯示本發(fā)明菌株的碳源代謝譜與Pantoeaagglomerans°綜合菌株的菌落形態(tài)、Biolog鑒定、nifH基因及16S rDNA的序列分析結果，將本發(fā)明菌株鑒定為腸菌科泛菌屬(Pantoea sp.)細菌。實施例5用Salkowski比色法測定NN08200菌株分泌IAA的能力配制S2比色液將4. 5gFeCl3溶于300mL蒸餾水，然后緩慢加入587. 4mL 98%H2SO4，待冷卻后定容至1L，測定IAA范圍5 200mg/L。將NN08200菌株接種在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h(28°C、120r/min)后，用無菌水調節(jié)0D600值為0. 05，取NN08200菌懸浮液100 u L分別接到不含色氨酸的King培養(yǎng)液(成分為蛋白胨20g，磷酸氫ニ鉀I. 5g，硫酸鎂I. 5g，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 0)和含有100mg/L色氨酸的King培養(yǎng)液中，重復4次，以加IOOii L無菌水的培養(yǎng)液為空白對照，一起置于28°C、轉速為120r/min的控溫振蕩器中培養(yǎng)12d。分別取NN08200菌懸液和空白對照50 y L各加A 50 u L S2比色液，置室溫下靜置，15min內觀察其顏色變化，4個重復均變紅為陽性，表示能分泌IAA，顔色越深表示分泌數量多；4個重復均不變色為陰性，表示不分泌IAA。測定結果見圖5，表明NN08200菌株分泌IAA的能力較強。實施例6本發(fā)明菌株對多種植物病原真菌的拈抗作用采用平板對峙法，在培養(yǎng)皿中央接種病原菌菌餅，離該菌餅約3cm處，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)48h的本發(fā)明菌株，在平板對稱兩測各劃一條約3cm的細線，正放于28°C培養(yǎng)，以僅接種病原菌的平板為對照，重復3次。待對照長滿全皿時測量病原菌菌落生長直徑，計算本發(fā)明菌株對病原菌生長的抑制率。見圖3、圖4。試驗結果表明，本發(fā)明菌株對甘鹿黑穗病菌(Ustilago scitamineaSyd.)、甘鹿鳳梨病菌(Ceratocystis paradoxa (Dode) Moreau)、甘鹿赤腐病菌(Colletotrichum Falcatum)、甘鹿虎斑病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)、玉米大斑病M [Exseronilum turcicum (Pass.) Leonard et Suggs]、玉米小斑病囷[Cocnliobolusheterostrophus (Drechsler)Drechsler]、甘庶虎斑炳隹(Rhizoctonia solani Kiihn)均具有較強的抑菌作用，抑制率達到72. 5 86. 9% (表I)。甘蔗內生固氮細菌Pantoea sp.對甘蔗的促生作用及其具有拈抗多種甘蔗重要真菌性病害的功能在國內屬首次報道。表I菌株NN08200對多種植物病原真菌的拈抗作用
供試植物病原菌抑菌率(％)
甘鹿黑穗病菌U. scitaminea78.權利要求
1.一株甘鹿內生固氮泛菌屬細菌，該菌屬于泛菌屬Pantoea sp. NN08200,含有固氮酶基因nif H，菌株與甘蔗組培苗的聯合固氮效率為12.85%。
2.菌株NN08200在促進植物生長中的應用。
3.菌株NN08200對多種植物病原真菌具有較強拈抗活性，應用于生產具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌劑和生物有機肥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株甘蔗內生固氮細菌及其應用，該菌株分類命名為泛菌屬細菌Pantoea sp.NN08200，保藏編號為CGMCC No.5438。本發(fā)明菌株能顯著促進植物生長并且拈抗多種植物病原真菌。利用該菌接種甘蔗組培苗50d后植株干重和總氮含量分別比空白對照增加了46.74％和41.5％，固氮效率為12.85％；接種菌株NN08200的玉米幼苗地上部分干重比對照增加74.5％，地下部分增加84.6％，株高比對照增加16.3％，葉綠素含量增加了29.2％，含氮量增加了27.0％。該菌株具有聯合固氮、分泌生長素等促植物生長的作用，可應用于生產具有促生及抑制植物病害的固氮微生物菌劑和生物有機肥。
文檔編號C05F11/08GK102732443SQ201210010289
公開日2012年10月17日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權日2012年1月13日
發(fā)明者史國英, 李楊瑞, 林麗, 胡春錦, 魏源文 申請人:廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院微生物研究所