專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)梅花成熟子葉再生體系的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、利用梅花成熟子葉再生體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
梅花(Prunus mume)屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，國外僅日本、朝鮮、新西蘭等少數(shù)幾個(gè)國家有種植。根據(jù)植物采集家的實(shí)際工作和中、日若干古籍的記載，肯定了中國乃梅之故鄉(xiāng)。梅花主要分布于我國的長江流域及整個(gè)江南地區(qū)。川、滇、藏交界的橫斷山區(qū)和云貴高原一帶被認(rèn)為是梅、半野生梅的自然分布中心，即梅的變異與種質(zhì)多樣化中心。在我國有7000年以上的應(yīng)用史和2000年以上的栽培史。梅花集色、香、姿、韻于一身，有“梅天下尤物”的美稱，具有極高的觀賞價(jià)值。其生性較為耐寒(一般能耐_5°C的低溫)，且開花較早，能在早春怒放。然而，梅花一般不能抵御-15°C -20°C的低溫，僅杏梅系的品種除外。梅花絕大多數(shù)品種(多屬真梅系)集中分布于我國長江流域一帶，在北方梅花品種則較少且主要以杏梅系和櫻李梅系為主，少見真梅系品種，有“南梅北杏”之稱。此外,梅花切花品種較少。為了使梅花在我國分布范圍更為廣泛，為了使梅花的栽培應(yīng)用國際化，培育出大量的抗寒品種勢在必打。傳統(tǒng)的梅花品種選育和品質(zhì)改良多采用實(shí)生苗選種、雜交育種等，這些方法周期長、偶然性大、消耗大量人力物力，且受季節(jié)限制，同時(shí)在性質(zhì)改良上局限性很大。而現(xiàn)代化的生物技術(shù)，特別是植物基因工程的應(yīng)用則可以克服傳統(tǒng)育種方法的局限性，可以使我們在較短的育種周期內(nèi)獲得大量符合我們要求的植株。植物基因工程技術(shù)在保持品種的其他性狀相對穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，能夠利用外源基因?qū)ζ渌刂频男誀钸M(jìn)行定向改良，從而為培育梅花新品種提供了新的途徑。要獲得轉(zhuǎn)基因植物，最重要的前提是要建立遺傳轉(zhuǎn)化體系所需的植株再生體系。目前梅花再生體系的建立還存在較大的難度，目前只有從櫻李梅系的‘美人’梅葉片再生出不定芽，并獲得完整植株，所以有關(guān)梅花遺傳轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道非常有限。目前只有一篇關(guān)于梅花遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道，Mei Gao et al.(2010)以梅花品種‘Nanko’的未成熟子葉作為遺傳轉(zhuǎn)化受體，利用體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、萌發(fā)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化GUS報(bào)告基因并得到抗性植株。這篇報(bào)道采用梅花未成熟子葉作為轉(zhuǎn)化受體材料，通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，建立了一個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化體系并且得到了抗性植株，但是轉(zhuǎn)化效率極低，而且體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)對于未成熟子葉的大小有嚴(yán)格的要求，當(dāng)未成熟子葉為2-3_長的時(shí)候，誘導(dǎo)效率最高，小于或者大于2-3_的時(shí)候誘導(dǎo)效率均很低，這對于外植體的采樣時(shí)間有嚴(yán)格要求，一年只能夠采樣一次，而且未成熟的果實(shí)容易腐爛不易保存，不能周年進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)；并且在遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，未成熟子葉經(jīng)侵染和共培養(yǎng)后延遲篩選7d，這勢必導(dǎo)致假陽性率高，轉(zhuǎn)化效率低，這些都不利于轉(zhuǎn)化。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于以梅花成熟子葉為受體進(jìn)行遺 傳轉(zhuǎn)化的成功報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種以梅花成熟子葉再生體系為基礎(chǔ)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，建立一種梅花遺傳轉(zhuǎn)化體系，該體系不需要通過胚發(fā)生途徑，直接獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的梅花成熟子葉直接再生體系的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化及植株鑒定，其特征在于，以梅花成熟子葉作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，不經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，通過直接的器官發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)化植株，其步驟經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、成苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，將GUS報(bào)告基因和正義PmCBFb基因?qū)胧荏w細(xì)胞，利用抗生素進(jìn)行抗性篩選，通過GUS化學(xué)染色或PCR檢測篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，其步驟如下所示:I)預(yù)培養(yǎng):將消毒后梅花成熟子葉接種到成熟子葉再生培養(yǎng)基中，置于24±2°C，光照強(qiáng)度為2000Ix光下預(yù)培養(yǎng)0-5d ；2)菌株的制備:從-70°C冰箱中取出保存的包含有⑶S報(bào)告基因和正義PmCBFb基因的農(nóng)桿菌EHA105，用接種環(huán)在100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，然后將平板倒置于28°C溫箱中黑暗培養(yǎng)直至單菌落產(chǎn)生；挑取單菌落接種于100mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min振蕩培養(yǎng)過夜；然后將對數(shù)生長期為0D_ =
0.6-0.8的菌液從三角瓶中轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，4000r/min離心IOmin,去上清液,將收集得到的農(nóng)桿菌置于ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基中，作為重懸液使用，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min重懸培養(yǎng)2_4h后用于轉(zhuǎn)化受體的侵染；3)侵染:將步驟I)的梅花成熟子葉再生培養(yǎng)基中生長健壯、無污染的子葉轉(zhuǎn)入步驟2)中制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染10-30min，期間每隔2_3分鐘搖動(dòng)一下；4)共培養(yǎng):將步驟3)中侵染過的梅花成熟子葉放在濾紙上除去菌液后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于24±2°C,黑暗條件下培養(yǎng)l-5d ；5)選擇培養(yǎng):將步驟4)中共培養(yǎng)后的梅花成熟子葉轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中，置于24±2°C光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每兩周補(bǔ)充一次新鮮選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化；6)成苗培養(yǎng):將步驟5)中再生出的不定芽接種到到成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)，對獲得的抗性芽進(jìn)一步的篩選和促進(jìn)生長，于光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每四周補(bǔ)充一次新鮮的成苗培養(yǎng)基，直到得到抗性苗；7)生根培養(yǎng):將步驟6)獲得的抗性苗切成2-3厘米長的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，直到獲得抗性植株；8)將步驟7)中獲得的轉(zhuǎn)GUS報(bào)告基因的抗性苗進(jìn)行GUS化學(xué)染色，驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株；或提取步驟7)中獲得的轉(zhuǎn)正義PmCBFb基因植株的基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株；培養(yǎng)基組分及配制:成熟子葉再生培養(yǎng)基:1/2MS，6_芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基:1/2MS ，6_芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, ρΗ6.0 ；選擇培養(yǎng)基:1/2MS，6_芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基
脲0.2-0.4mg/L,卡那霉素20mg/L,頭孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水
定容至1L，pH6.0 ；成苗培養(yǎng)基:1/21^，玉米素1.011^/1，3-吲哚乙酸0.lmg/L，卡那霉素20mg/L，頭孢
霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ；生根培養(yǎng)基:1/2MS，α -萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，瓊脂7.5g/L，用蒸餾水定
容至 1L，pH6.0。作為優(yōu)選方案，步驟I)中所述的成熟子葉預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d。作為優(yōu)選方案，步驟3)中所述的農(nóng)桿菌的侵染時(shí)間為20min。作為優(yōu)選方案，步驟4)中所述的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化受體的共培養(yǎng)時(shí)間為3d。本發(fā)明的積極效果是:本發(fā)明是國內(nèi)外首次利用梅花成熟子葉轉(zhuǎn)化報(bào)告基因和目的基因獲得梅花轉(zhuǎn)基
因植株，為今后梅花的遺傳改良提供新的技術(shù)平臺。具體的優(yōu)點(diǎn)如表I所示。表I本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別
比較項(xiàng)目_本發(fā)明技術(shù)特征_現(xiàn)有的技術(shù)特征_
受體材料梅花成熟子葉外植體一次采收后，梅花未成熟子葉采收受季節(jié)限制，不易
不受季節(jié)限制，易于保存，可以周于保存，不能周年用于遺傳轉(zhuǎn)化的材料 年用于遺傳轉(zhuǎn)化的材料
遺傳轉(zhuǎn)化體系以梅花成熟子葉作為遺傳轉(zhuǎn)化的受以梅花未成熟子葉作為遺傳轉(zhuǎn)化的受
體材料，利用直接的器官發(fā)生途徑體材料，利用體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，其步 (未經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑)，其步驟經(jīng)農(nóng)桿菌侵染15mm、脫菌培養(yǎng)7d(不 驟經(jīng)預(yù)培養(yǎng)3d、農(nóng)桿菌侵染20mm、加入卡那霉素篩選)、選擇培養(yǎng)、萌發(fā) 共培養(yǎng)3d、選擇培養(yǎng)、成苗培養(yǎng)和培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得抗性植株，進(jìn)行陽 生根培養(yǎng)獲得抗性植株，進(jìn)行陽性性檢測，由于共培養(yǎng)后延遲篩選，導(dǎo)致 檢測，陽性率高，轉(zhuǎn)化效率高假陽性率高，轉(zhuǎn)化效率低
轉(zhuǎn)化基因Gf 報(bào)告基因和正義PmCSFZ)基只轉(zhuǎn)Gf 報(bào)告基因，未轉(zhuǎn)入目的基因，
因，縮短了生產(chǎn)流程離生產(chǎn)應(yīng)用較遠(yuǎn)


序列表SEQ ID NO:1是⑶S(i3 -葡萄糖苷酸酶)報(bào)告基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO:2是NPTII選擇基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO:3是PmCBFb目的基因的核苷酸序列。
圖1:本發(fā)明中以梅花成熟子葉為受體的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)流程圖。圖2:是本發(fā)明應(yīng)用的一個(gè)報(bào)道的質(zhì)粒PBI121的物理圖譜。圖3:是本發(fā)明應(yīng)用的表達(dá)載體pCAMBIA2300s的物理圖譜。圖4:本發(fā)明中以梅花成熟子葉為受體的⑶S瞬時(shí)表達(dá)檢測。圖中:a.未轉(zhuǎn)化成熟子葉染色；b.轉(zhuǎn)化成熟子葉染色；c.轉(zhuǎn)基因植株。圖5:本發(fā)明中以梅花成熟子葉為受體再生出抗性不定芽的⑶S穩(wěn)定表達(dá)檢測。圖6:本發(fā)明實(shí)施例中由梅花成熟子葉誘導(dǎo)出的不定芽。圖7:本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)化PmCBFb目的基因所得的陽性植株，提取其葉片的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測結(jié)果。(泳道“P”代表農(nóng)桿菌質(zhì)粒，泳道“CK”代表未轉(zhuǎn)化的植株，泳道“ I” - “ 11”代表轉(zhuǎn)化得到的植株)。圖8:本發(fā)明實(shí)施例中轉(zhuǎn)化GUS報(bào)告基因，卡那霉素對梅花成熟子葉不定芽誘導(dǎo)率的影響。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，但不是限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1梅花成熟子葉轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株1.轉(zhuǎn)化受體材料及培養(yǎng)::用于本實(shí)施例的梅花材料來自于中國(武漢)梅花研究中心晏小蘭高級工程師惠增的梅花品系‘雪梅’和‘米單綠’的成熟果實(shí)(晏小蘭，劉小祥等，2007)，用錘子將成熟的梅花果實(shí)敲開，取出梅花成熟胚，再用含有洗衣粉的水浸泡IOmin后,流水沖洗30min,然后在超菌操作臺上用70%的酒精消毒30s，無菌水沖洗I次,然后用0.1 %升汞溶液消毒15min，用無菌水沖洗4-5次，用無菌水浸泡約24h后，在無菌操作臺上將外植體(梅花成熟子葉)接種到子葉再生培養(yǎng)基中，置于24±2°C，光照強(qiáng)度為20001X光下預(yù)培養(yǎng)3d，選擇沒有污染，生長狀況良好的梅花成熟子葉為受體材料。2.轉(zhuǎn)化載體材料:1)⑶S報(bào)告基因攜帶GUS報(bào)告基因所用的根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105 (由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室宋建坤惠贈(zèng))為一種報(bào)道和常用的商業(yè)菌株，該菌株包含商業(yè)質(zhì)粒pBI121(見GenBank，基因登錄號:AF485783.1，該質(zhì)粒的物理圖譜參見圖2，其攜帶⑶S報(bào)告基因和NPTII選擇基因(該⑶S基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示)，NPTII選擇基因(其核苷酸序列見序列表SEQ ID N0:2所示)。2)正義 PmCBFb 基因攜帶正義PmCBFb基因的根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105 ( —種報(bào)道的商業(yè)菌株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室過聰惠增)，該農(nóng)桿菌包含表達(dá)載體pCAMBIA2300s (該載體的原始來源為澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，一種公開銷售的商業(yè)載體，其物理圖譜參見圖3)，該載體正向插入PmCBFb目的基因(其序列見GenBank，登陸號:HM099910.1所示，參見序列表SEQ ID NO:3)，攜帶NPTII選擇基因(見序列表SEQ ID NO:2)。3.遺傳轉(zhuǎn)化方法:
I)受體材料的準(zhǔn)備:以梅花‘米單綠’、‘雪梅’(來源同上)成熟子葉為外植體，將所述的外植體成熟子葉接種到成熟子葉再生培養(yǎng)基中，置于24±2°C，光照強(qiáng)度為20001X光下預(yù)培養(yǎng)3d(在另外的實(shí)施例中預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為0-5d)，為遺傳轉(zhuǎn)化提供受體材料；2)菌株的制備:從_70°C冰箱中取出所保存的農(nóng)桿菌EHA105(來源同上)，用接種環(huán)在含100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，然后將平板倒置于28°C溫箱中黑暗培養(yǎng)直至單菌落產(chǎn)生。挑取單菌落接種于含有100mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。然后將對數(shù)生長期的菌液(0D_ = 0.6-0.8)從三角瓶中轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，4000r/min離心lOmin，去上清液，將收集到的農(nóng)桿菌菌體置于含有ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基(作為重懸液使用)中，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min重懸培養(yǎng)2_4h后用于轉(zhuǎn)化受體的侵染；3)侵染:將步驟I)中在梅花成熟子葉再生培養(yǎng)基中生長健壯、無污染的子葉轉(zhuǎn)入制備好的菌液侵染20min ；4)共培養(yǎng):將步驟3)中侵染過的梅花成熟子葉放在濾紙上除去菌液后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于24±2°C,黑暗條件下培養(yǎng)3d ；5)選擇培養(yǎng):將步驟4)中共培養(yǎng)后的梅花成熟子葉轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中，置于24±2°C光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每兩周補(bǔ)充一次新鮮選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化；6)成苗培養(yǎng):將步驟5)中再生出的不定芽接種到到成苗培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性芽的進(jìn)一步的篩選和促進(jìn)芽的生長，光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每四周補(bǔ)充一次新鮮的成苗培養(yǎng)基，直到得到抗性苗；7)生根培養(yǎng):將步驟6)獲得的抗性苗切成2-3厘米長的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001χ，從而獲得抗性植株；本實(shí)施例涉及的培養(yǎng)基組分及配比見表表2本發(fā)明的梅花的遺傳轉(zhuǎn)化用的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的梅花成熟子葉直接再生體系的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化及植株鑒定，其特征在于，以梅花成熟子葉作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，不經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，通過直接的器官發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)化植株，其步驟經(jīng)預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、成苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，將GUS報(bào)告基因和正義PmCBFb基因?qū)胧荏w細(xì)胞，利用抗生素進(jìn)行抗性篩選，通過GUS化學(xué)染色或PCR檢測篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，其步驟如下所示: 1)預(yù)培養(yǎng):將消毒后梅花成熟子葉接種到成熟子葉再生培養(yǎng)基中，置于24±2°C，光照強(qiáng)度為20001x光下預(yù)培養(yǎng)0-5d ； 2)菌株的制備:從_70°C冰箱中取出保存的包含有GUS報(bào)告基因和正義PmCBFb基因的農(nóng)桿菌EHA105，用接種環(huán)在100mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線，然后將平板倒置于28°C溫箱中黑暗培養(yǎng)直至單菌落產(chǎn)生；挑取單菌落接種于100mg/L卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min振蕩培養(yǎng)過夜；然后將對數(shù)生長期為0D_ = 0.6-0.8的菌液從三角瓶中轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，4000r/min離心lOmin，去上清液，將收集得到的農(nóng)桿菌置于ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的1/2MS液體培養(yǎng)基中，作為重懸液使用，在28°C恒溫?fù)u床上200r/min重懸培養(yǎng)2_4h后用于轉(zhuǎn)化受體的侵染； 3)侵染:將步驟I)的梅花成熟子葉再生培養(yǎng)基中生長健壯、無污染的子葉轉(zhuǎn)入步驟2)中制備好的農(nóng)桿菌菌液侵染10-30min，期間每隔2_3分鐘搖動(dòng)一下； 4)共培養(yǎng):將步驟3)中侵染過的梅花成熟子葉放在濾紙上除去菌液后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于24±2°C,黑暗條件下培養(yǎng)l-5d ； 5)選擇培養(yǎng):將步驟4)中共培養(yǎng)后的梅花成熟子葉轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基中，置于24±2°C光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每兩周補(bǔ)充一次新鮮選擇培養(yǎng)基直至不定芽分化； 6)成苗培養(yǎng):將步驟5)中再生出的不定芽接種到到成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)，對獲得的抗性芽進(jìn)一步的篩選和促進(jìn)生長，于光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001X，每四周補(bǔ)充一次新鮮的成苗培養(yǎng)基，直到得到抗性苗； 7)生根培養(yǎng):將步驟6)獲得的抗性苗切成2-3厘米長的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為20001x，直到獲得抗性植株； 8)將步驟7)中獲得的轉(zhuǎn)GUS報(bào)告基因的抗性苗進(jìn)行GUS化學(xué)染色，驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株；或 提取步驟7)中獲得的轉(zhuǎn)正義PmCBFb基因植株的基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測，驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因植株； 培養(yǎng)基組分及配制: 成熟子葉再生培養(yǎng)基:1/2MS，6-芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L，噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ； 共培養(yǎng)培養(yǎng)基:1/2MS，6-芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲0.2-0.4mg/L,乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L,ρΗ6.0 ； 選擇培養(yǎng)基:1/2MS，6-芐基腺嘌呤1.0-2.0mg/L, α -萘乙酸0.2mg/L,噻二唑苯基脲.0.2-0.4mg/L,卡那霉素20mg/L,頭孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至 1L，pH6.0 ； 成苗培養(yǎng)基:1/2MS，玉米素1.011^/1，3-吲哚乙酸0.lmg/L，卡那霉素20mg/L，頭孢霉素300mg/L,鹿糖30.0g/L,瓊脂7.5g/L,用蒸懼水定容至1L, pH6.0 ； 生根培養(yǎng)基:1/2MS，α -萘乙酸0.5mg/L，蔗糖30.0g/L，瓊脂7.5g/L，用蒸餾水定容至1L, pH6.0。
1/2MS液體培養(yǎng)基:l/2MS+100ymol/L AS+蔗糖30.0g/L，用蒸餾水定容至lL，pH5.5。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的成熟子葉預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3d。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的農(nóng)桿菌的侵染時(shí)間為20min。
4.如權(quán)利要求1所述的方法 ，其特征在于，步驟4)所述的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化受體的共培養(yǎng)時(shí)間為3d。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的梅花成熟子葉再生體系的遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的步驟包括遺傳轉(zhuǎn)化、篩選再生、GUS染色檢測和PCR檢測。其特征在于，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將GUS報(bào)告基因和PmCBFb基因?qū)胧荏w梅花成熟子葉細(xì)胞中，對影響梅花成熟子葉轉(zhuǎn)化的不同因素進(jìn)行了篩選，利用卡那霉素作為選擇劑，對轉(zhuǎn)化后的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選，再通過GUS染色或PCR檢測等輔助方法篩選得到轉(zhuǎn)基因梅花植株。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化體系不經(jīng)過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，直接獲得轉(zhuǎn)基因植株，因而顯著提高了梅花的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
文檔編號A01H4/00GK103215307SQ201210016150
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者張俊衛(wèi), 楊潔, 聞娟, 張蔚, 包滿珠 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)