專利名稱：香菇新菌株k48及其選育方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種香菇新菌株K48及其選育方法，屬于食用菌育種領域。
背景技術：
目前食用菌的育種方法主要有野生種訓化、雜交育種、誘變育種、原生質體融合育種和基因工程育種等多種。野生種訓化是從野生子實體中分離獲得菌絲體，經栽培試驗，篩選獲得優(yōu)良菌株。這種方法需分離獲得大量菌株，從中選出高產優(yōu)質的品種，不能創(chuàng)造新的種性。雜交育種是一種目前應用較多而有效的育種技術，它可組合雙親的優(yōu)良性狀、表現出較強的雜交優(yōu)勢，培育出超越親本的優(yōu)良雜交種。但雜交育種是一項耗工耗時的工作，從對育種材料進行遺傳分析和親緣關系分析來確定親本，再從眾多的雜交后代中篩選、鑒定出優(yōu)良品種的過程不僅需要很長時間，且隨機性和盲目性很大。現階段誘變育種是通過物理和化學的手段，使其染色體結構發(fā)生改變，促進變異，再從眾多的變異體中篩選出好的品種，這仍然是一種篩選量大和隨機性、盲目性很強的育種方法。原生質體融合育種是用于遠緣雜交，克服“種間性隔離”的技術，上世紀80年代在食用菌中廣泛研究，但由于在有絲分裂過程中有些染色體會丟失，融合子不穩(wěn)定，未能得到廣泛應用。基因工程育種在食用菌中的研究應用主要包括以下兩個方面一是利用食用菌作為新的基因工程的受體菌，生產人們所期望的外源基因編碼的產物(即作為生物反應器)。二是利用基因工程技術定向培育食用菌新品種，包括抗蟲、抗病，優(yōu)質的新品種，以及將編碼纖維素或木質素降解酶的基因導入食用菌體內，以提高食用菌的產量和質量(閻培生等，1997)。但基因工程育種目前存在的主要問題有1、假陽性菌落的干擾；2、外源DNA整合率不高；3、外源基因整合后表達率不高；4、轉化子不穩(wěn)定。這些問題均將嚴重阻礙著研究向實際應用的轉化。在誘變育種中，除采用物理、化學方法改變和破壞染色體結構而促其變異外，還有一種是不改變和破壞染色體的結構，而人工誘導多倍體形成的技術方法。在植物界中的經濟作物、中藥材植物、花卉中已人工培育出眾多的多倍體植株。在動物界國內已有成功的報道。以貝類、蝦類、魚等海產養(yǎng)殖領域的多倍體育種比較成熟，如大連水產學院的鮑多倍體等。在微生物中已有釀酒酵母的多倍體菌株用于工業(yè)化生產。人工誘導多倍化過程主要是利用誘導劑(如細胞松弛素B、6-二甲基氨基嘌呤、秋水仙素等)干擾細胞分裂過程。其作用主要在于能抑制處于分裂細胞中的微管的聚合，使已有的微管解聚，從而阻止紡錘體的形成或破壞已形成的紡錘體，使細胞的染色體在加倍后而不能分離，使細胞分裂停止在分裂中期。這種染色體加倍后的細胞在解除誘導處理后，在一定時間內能恢復正常生長，重新進行細胞分裂，從而得到較為穩(wěn)定的多倍體細胞。這種干擾作用對染色體結構無明顯影響， 只導致染色體的成倍增加，并不發(fā)生染色體交換、基因重組和基因突變，可使原有性狀得到放大、加強和提高。這在很多種植物的多倍體育種中得到證明，而在食用菌的育種研究中還未見有國內的任何報道。有日本學者在上世紀八十年代的研究認為人工誘導菇類多倍體是不可能的我國是世界香菇栽培大國，栽培歷史悠久，栽培技術先進，特別是代料栽培技術居世界領先水平。但是國內培育具有自主知識產權的香菇品種較少，特別是能在國內大面積栽培的品種更少。香菇代料栽培是今后生產發(fā)展的主要方式，目前國內香菇代料栽培中的品種仍以“ 135”和“939”菌株為主。香菇“ 135”菌株是上世紀70年代使用的低溫遲熟型品種，菇形、品質較好，但使用年代過久，在代料栽培中表現為產量較低，抗逆性差，夏季遇高溫易爛筒。香菇“939”菌株產量較高，易管理，但出菇過多、過密，叢生菇多，嚴重影響香菇品質。所以，選育出高產優(yōu)質、抗逆性強的香菇新品種，促進我國香菇代料生產的可持續(xù)發(fā)展，已是迫在眉睫的工作。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是通過將出發(fā)菌株的單核體菌株誘變后再與雙核體菌株(單X雙) 雜交的方法，以期培育出適宜代料栽培、優(yōu)質、高產，且抗逆性強的優(yōu)良菌株，用于香菇生產，代替目前的常規(guī)栽培品種，促進香菇產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。一方面，本發(fā)明提供了一種香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于 2012年01月06日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5713。它是香菇303菌株的單核體誘變后再雜交得到的新菌株。另一方面，本發(fā)明提供了一種香菇誘變雜交育種的方法，包括以下步驟(1)用香菇303菌株進行單孢分離，培養(yǎng)單核體菌株備用；(2)制備含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基，裝試管，滅菌后擺放成試管斜面；(3)在上述斜面培養(yǎng)基中接入303菌株的單核體菌株進行誘導培養(yǎng)；(4)經培養(yǎng)一定時間后，轉出菌落前端的菌絲到常規(guī)培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；(5)用經誘導的單核體菌株與雙核體菌株分別作單X雙雜交；(6)作形態(tài)觀測試驗；作對峙培養(yǎng)和同功酶檢測試驗；作DNA指紋檢測，鑒定雜交新菌株；(7)雜交新菌株與親本菌株作連續(xù)三年的栽培品比試驗；(8)優(yōu)良雜交新菌株經過專家鑒定。所述雙核體菌株是JL-2。所述秋水仙素的濃度在0.01% -5%的范圍內，優(yōu)選為0. 1%。所述誘導培養(yǎng)的時間為2天-120天，根據誘導劑的使用濃度來選擇誘導處理時間。本發(fā)明具有以下優(yōu)點本發(fā)明克服了現有誘變育種中使其染色體結構發(fā)生改變，促使變異，再篩選大量變異體的隨機性、盲目性強的缺點，提供了一種食用菌誘變加雜交的育種新方法。不破壞和改變親本的染色體結構，僅促使染色體倍性的增加，可不改變出發(fā)菌株現有的優(yōu)良性狀，從而達到優(yōu)良品種在產量、品質和適應性等生產性狀方面得到較大的提升，獲得更加優(yōu)良的新菌株。從本發(fā)明的試驗結果可以看出，新菌株K48是用誘變的一個單核體與另一個雙核體經單X雙雜交而得到的，因誘變加雜交的雙重效應，從而使新菌株K48與親本菌株JL-2 相比產生了較大的變異。
試驗結果表明，經單核體誘變后再雜交得到的新菌株K48明顯有別于出發(fā)菌株和親本菌株，其產量極顯著高于親本菌株，且抗高溫能力增強。多種鑒定方法綜合認定結果表明，雜交誘變菌株K48是有別于出發(fā)菌株和親本菌株的新菌株。秋水仙堿的誘變效果明顯，該技術方法為香菇的新菌株選育提供了一種有效的新途徑。香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5713。


圖1是本發(fā)明技術路線示意圖；圖2是供試菌株ISSR聚類分析示意圖；圖3是供試菌株SRAP聚類分析示意圖；圖4是誘變菌株和出發(fā)菌株的生長對比試驗，誘變菌株(388B1)和出發(fā)菌株 (388) 23 °C 培養(yǎng) 10 天；圖5是新菌株K48和對照菌株939的三年栽培數據統(tǒng)計直觀圖(橫坐標為出菇月份當年9月至次年4月，縱坐標為單產，單位g)；圖6是新菌株K48和對照菌株939平均單袋12月底以前總產量占全年總產量比例圖；圖7是新菌株K48和對照菌株939三年平均單袋產量直觀圖；圖8是顯示供試菌株子實體形態(tài)特征的照片。
具體實施例方式1、材料與方法1. 1 材料1. 1. 1親本菌株香菇135 (三明真菌所引進)、香菇939 (三明真菌所引進)、303 (本公司雜交選育)、幾-2(日本引進)。1.1.2 培養(yǎng)基試驗培養(yǎng)基PDA+20%菌糠煮汁。誘變培養(yǎng)基PDA+0. 1 %秋水仙堿。栽培培養(yǎng)基雜木屑83%、麩皮15%、糖1%、石膏1%。1.1. 3主要試劑秋水仙堿(C22H25N05)含量98%，分析純，上?；菔郎噭┕具M口分裝。熒光染料Hoechst33258(商品名)，雙苯并咪唑(C25H24N5O13HCL)化學名，瑞士進 □。1. 2 方法1. 2. 1單孢分離2004年12月15日分別采集香菇135、303的子實體(八成熟)，置于鐘罩式孢子采集器中，于23°C培養(yǎng)四天后，收集孢子連續(xù)10倍稀釋5次，稀釋的孢子懸浮液在 2cmX 20cm的試管斜面上劃線培養(yǎng)。孢子開始萌發(fā)后，逐個挑取星芒狀的單個小菌落轉管培養(yǎng)。再逐個鏡檢，凡是無鎖狀聯(lián)合的可暫作為單孢菌落，并隨即編號，冰箱保藏、備用。1. 2. 2單核菌株交配型確定將初次鏡檢的各單孢菌落相互配對作交配型試驗，挑取兩菌落交接處的菌絲鏡檢，根據各單孢菌落在交配型試驗中的親和表現進行分析，以確定各單核體菌株的交配型。1.2.3單核體菌株的誘變處理將香菇135、303兩菌株的單核體菌株，分別接種在含0. 秋水仙堿的斜面培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中25°C恒溫培養(yǎng)，每個供試菌株接種10支試管，20天后，陸續(xù)挑取菌落尖端的菌絲轉管培養(yǎng)后備用。 1.2.4配對雜交-單X雙雜交實驗誘變的單核體菌株分別與幾_2、939香菇菌株配對作單X雙雜交。先接種單核體菌株待成活萌發(fā)后，再接種雙核體菌株。在兩株菌絲交接后再培養(yǎng)10天左右，挑取單核體 (非交接處)另一側的菌絲轉管培養(yǎng)，經鏡檢產生有鎖狀聯(lián)合的即為雜交雙核體新菌株。1.2.5生長溫度和拮抗實驗將供試菌株分別接種5支試管，在5 °C、25 °C、26 °C、27 V、28。C、29 V、30 V的條件
下作菌絲生長試驗，觀察并記錄菌絲生長情況。將誘變菌株分別與其出發(fā)菌株和親本菌株135、303、幾_2、939作拮抗性試驗，觀
察并記錄實驗結果。1. 2. 6新菌株檢測鑒定(委托華中農業(yè)大學食品科技學院檢測)1. 2. 6. 1鑒定的方法和內容1)菌絲細胞核染色采用爬片制備菌絲體進行熒光染色或吉姆沙染色，而后熒光顯微鏡下鏡檢，并記錄結果。2)擔孢子電鏡掃描取子實體菌褶制片供電鏡掃描觀察擔孢子形態(tài)和大小。3)拮抗實驗取直徑5cm的培養(yǎng)皿制平板，用打孔器制圓形接種塊，同皿，同組合， 三次重復，接種對峙培養(yǎng)。4)酯酶同工酶常規(guī)凝膠電泳法記錄結果。5)多酚氧化酶常規(guī)凝膠電泳法記錄結果。6)核酸含量測定方法見提供的參考資料。7)分子標記(ISSR和SRAP)分析每種標記篩選3個合適的引物，記錄每種引物分析的DNA指紋圖和遺傳聚類的結果。1.2. 7新菌株栽培比較試驗1.2. 7. 1三年栽培比較試驗于2007年、2008年、2009年分別用15cmX50cm的塑料袋制作菌筒，經室內越夏后，于秋季移入層架式菇棚(5層)中并注意環(huán)境條件的一致，記錄每次的出菇時間、產量、 個數、菌蓋直徑、菌柄長短并計算每筒平均單產、單菇重。1. 2. 7. 2產量生物學統(tǒng)計分析用SPSS17. 0生物統(tǒng)計軟件，對比出發(fā)菌株(或對照菌株)對新菌株三年的平均單袋產量進行統(tǒng)計分析。用旬期做因變量，同一菌株三年同一句期的單袋產量做自變量，進行單因素方差分析。1. 2. 7. 3抗高溫比較試驗對供試菌株進行越夏管理實驗，統(tǒng)計分析越夏溫度在30°C以上的時間及越夏前后菌筒的污染情況。1. 2. 8子實體形態(tài)特征子實體考種方法參照日本國提供的標準和方法進行。2結果與分析2. 1 結果2. 1. 1單核菌株的交配型經交配型測定試驗，從香菇135菌株中測定出四種交配型的四個單核體菌株，編號為163 (A1B2)、132 (A2B1)、168 (AlBl)、108 (A2B2)；從303香菇菌株中測定出四種交配型的八個單核體菌株，編號為:304、3104、3119、3131、388、3101、307、382。2. 1. 2誘變實驗從單核體誘變菌株中初篩選出菌株163A1、163B1、168A1、108A1、3101A1、388A1、 388B1。特別是單核體菌株388B1從形態(tài)、生長速度上明顯不同于出發(fā)菌株388，同時接種后在23°C培養(yǎng)10天，差異極其顯著。見圖4。2. 1.3配對雜交選取誘變的單核體菌株388B1、163B1和各自的出發(fā)菌株388、163分別與幾_2、939 香菇菌株配對作單X雙雜交，雜交組合及得到的新菌株見表1:其中單核體出發(fā)菌株388與JL-2雜交試驗表現為明顯的不親和性，但388的誘變菌株388B1與JL-2卻表現出親和性，我們將388B1 X幾_2雜交成功的菌株暫定名為K48A。表1，試驗菌株雜交配對組合
權利要求
1.一種香菇(Lentinula edodes)新菌株K48，該菌菌株已于2012年01月06日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，其保藏號為CGMCC No. 5713。
2.如權利要求1所述的香菇新菌株，其特征在于它是香菇303菌株分離的單核體菌株經誘變后再雜交得到的新菌株。
3.一種選育香菇誘變雜交菌株的方法，包括以下步驟(1)用香菇303菌株進行單孢分離，培養(yǎng)單核體菌株備用；(2)制備含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基，裝試管，滅菌后擺放成試管斜面；(3)在上述斜面培養(yǎng)基中接入303菌株的單核體菌株進行誘導培養(yǎng)；(4)經培養(yǎng)一定時間后，轉出菌落前端的菌絲到常規(guī)培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；(5)用經誘導的單核體菌株與雙核體菌株分別作單X雙雜交；(6)作形態(tài)觀測試驗；作對峙培養(yǎng)和同功酶檢測試驗；作DNA指紋檢測，鑒定雜交新菌株；(7)雜交新菌株與親本菌株作連續(xù)三年的栽培品比試驗；(8)優(yōu)良雜交新菌株經過專家鑒定。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述雙核體菌株是幾_2。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述秋水仙素的濃度在0.01% -5%的范圍內。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述秋水仙素的濃度為0.1%。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述誘導培養(yǎng)的時間為2天-120天，根據誘導劑的使用濃度來選擇誘導處理時間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇新菌株K48及其選育方法。香菇新菌株K48是香菇303菌株的單核體誘變后再和一個雙核體雜交得到的新菌株，是通過用含有秋水仙素的PDA培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)單核體后再雜交而獲得的新菌株，通過誘變加雜交的雙重效應，使新菌株在產量、品質和適應性等生產性狀上比出發(fā)菌株和親本菌株得到較大的提升，是一種簡便、實用和有效的食用菌育種新技術。
文檔編號A01H1/08GK102523929SQ20121001704
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權日2012年1月18日
發(fā)明者徐年聲 申請人:遠安科力生菌業(yè)有限公司