專利名稱：一種高通量農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種玉米轉(zhuǎn)基因方法，尤其涉及農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法。
背景技術：
玉米(Zea mays L.)是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料兼用作物，是我國和世界主要的農(nóng)作物之一。隨著工業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，以及世界人口的增長，玉米在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位越來越重要。2003年以來，我國的玉米播種面積和產(chǎn)量呈現(xiàn)出不斷增長的趨勢，但與我國的玉米需求量還有較大缺口，尤其與美國等玉米生產(chǎn)大國還有較大的差距。因此，不斷增長的玉米需求量對我國的玉米農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提出了更高的要求。目前，我國的玉米生產(chǎn)仍以常規(guī)雜交育種為主體，因其育種周期長、種質(zhì)資源匱乏等缺點，這就對我國的玉米育種工作者提出了前所未有的挑戰(zhàn)。因此，開展玉米轉(zhuǎn)基因技術研究是我國目前玉米生產(chǎn)現(xiàn)狀的迫切需求。轉(zhuǎn)基因技術克服了物種間的限制，使優(yōu)良的基因在動植物和微生物之間相互交流，彌補了常規(guī)雜交育種種質(zhì)資源匱乏的不足。將轉(zhuǎn)基因技術與玉米常規(guī)育種相結(jié)合，能盡快培育出符合育種目標的玉米新品種，顯著的縮短了玉米育種周期。自Frorrn等人于1990 首次報道了第一例可育的轉(zhuǎn)基因玉米以來，全世界已有多個轉(zhuǎn)基因玉米品種被批準進入商業(yè)化生產(chǎn)。通過轉(zhuǎn)基因技術已經(jīng)培育了一大批抗除草劑、抗旱、抗蟲、耐鹽等優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因玉米品種。目前，在玉米轉(zhuǎn)基因技術研究上，已建立了多個轉(zhuǎn)化方法，包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導法、PEG介導法、花粉管通道法、超聲波法、顯微注射等方法。但在玉米轉(zhuǎn)基因過程中應用的比較成熟的是農(nóng)桿菌介導法和基因槍法。而這些方法在組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化效率以及受體基因型等方面存在著各種不足，難以滿足目前生產(chǎn)上應用的玉米骨干自交系的轉(zhuǎn)化需求。 因此，發(fā)展和建立一種簡便高效的不需要組織培養(yǎng)和不受玉米基因型限制的轉(zhuǎn)基因技術顯得尤為迫切。原位轉(zhuǎn)化(In planta)，又叫活體轉(zhuǎn)化、整體轉(zhuǎn)化，是一種農(nóng)桿菌介導的在植物活體狀態(tài)下實現(xiàn)目的基因整合的轉(zhuǎn)基因方法，其主要特征是不需要經(jīng)過繁瑣組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程而直接獲得轉(zhuǎn)化種子，顯著縮短了轉(zhuǎn)基因育種周期。原位轉(zhuǎn)化方法是雙子葉植物擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化廣泛采用的一種方法，現(xiàn)已成功應用到蕓薹屬作物上。目前，該技術在禾本科植物玉米的遺傳轉(zhuǎn)化中的應用并不成熟。本發(fā)明方法利用特制的電動注射儀將含有目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注入到玉米雌穗最內(nèi)層苞葉空隙處，并對轉(zhuǎn)化液各參數(shù)進行了優(yōu)化， 獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明方法效率高、簡便易行、成本低，適用于不同玉米種質(zhì)的遺傳轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于改進現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，提供一種簡便高效的玉米轉(zhuǎn)基因技術。本發(fā)明的具體方案為
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—種高通量農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，農(nóng)桿菌菌株為 LBA4404或EHA105，質(zhì)粒為PCAMBIA1301，篩選標記為除草劑，包括以下步驟步驟1 對農(nóng)桿菌進行增殖培養(yǎng)，病毒基因誘導培養(yǎng)后，配制農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液；步驟2 將步驟1的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注入玉米雌穗最內(nèi)層苞葉的空隙處，浸泡雌花序一定時間后進行授粉；步驟3 收獲種子播種后，對幼苗進行除草劑抗性篩選；步驟4 對具有除草劑抗性的植株進行PCR檢測篩選。上述步驟1的增殖培養(yǎng)方法為將凍存的農(nóng)桿菌株接種于含50mg/L卡那霉素和 50mg/L利福平的YEP平板上，于避光培養(yǎng)2d后，從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中J8°C，230rpm培養(yǎng)16_24h ；吸取上述過夜培養(yǎng)物按1 50 的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，280C 230rpm振蕩培養(yǎng)4_6h， 至 0D600 值為 0. 6-0. 8。上述步驟1的病毒基因誘導培養(yǎng)方法為經(jīng)增殖培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液離心后收集菌體，按照離心前菌液體積1 50的比例，用AB誘導液懸浮菌體，然后于條件下 150-180rpm震蕩培養(yǎng)12h，進行農(nóng)桿菌的Vir基因誘導培養(yǎng)；所述的AB誘導培養(yǎng)液含3g/ L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/L MgS04 ·7Η20、0· 15g/L KCl、0.01g/L CaCl2, 0. 0025g/L FeS04 ·7Η20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L 葡萄糖、IOOuM 乙酰丁香酮，pH 為 5. 6。上述步驟1的配制農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液為將經(jīng)病毒基因誘導培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液離心后，用MS轉(zhuǎn)化液重新懸浮菌體，轉(zhuǎn)化液0D600值調(diào)整為0. 8-1. 0，此菌液即為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液； 其中，MS 轉(zhuǎn)化液為組分為:1/4MS,2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2， 4-D、IOOuM 乙酰丁香酮，pH 為 5. 8。進一步，步驟2的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液在注入玉米雌穗最內(nèi)層苞葉的空隙之前，添加 0. 03% -0. 05%表面活性劑Silwet L-77 ；注射時使用電動注射儀；玉米雌穗在抽絲前用紙袋套住，于轉(zhuǎn)化液注入24h后進行授粉。上述電動注射儀包括轉(zhuǎn)化液容器、壓力電泵、壓力控制閥、塑料軟管、注射控制閥、注射針頭；壓力電泵位于轉(zhuǎn)化液容器底部并和塑料軟管相連；壓力電泵在壓力控制閥的控制下，將轉(zhuǎn)化液容器中的轉(zhuǎn)化液壓入塑料軟管；塑料軟管一端連接壓力電泵，另一端通過注射控制閥連接注射針頭；注射控制閥為按壓式，按壓打開注射控制閥，放開關閉注射控制閥；打開注射控制閥，被壓力電泵壓入塑料軟管中的轉(zhuǎn)化液通過注射針注射。本發(fā)明的有益效果包括1.本發(fā)明在進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注入到玉米雌穗最里層苞葉時，用電動注射儀取代了手動注射器，極大地提高了工作效率。該方法每人每天完成6000-8000植株的轉(zhuǎn)化，可充分利用玉米盛花期進行授粉，提高了玉米植株的結(jié)籽率，為較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率提供了保障。另外，電動注射儀壓力均勻，對玉米雌穗損傷較手動注射要小，在一定程度上保證了轉(zhuǎn)化效率。2.原位轉(zhuǎn)化方法在模式植物擬南芥中應用非常廣泛，在農(nóng)桿菌浸泡花序時，采用真空輔助處理，能顯著提高轉(zhuǎn)化效率。但真空處理并不能應用于玉米這種花器較大的植物。 該方法在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中添加適宜濃度的表面活性劑Silwet L-77，增強玉米雌花序?qū)r(nóng)桿菌的吸附能力。同時使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液與玉米花器的各個部分充分接觸，為農(nóng)桿菌中T-DNA 高效的整合提供了條件。3.玉米植株授粉后，可直接收獲種子，不需經(jīng)過繁瑣的組織培養(yǎng)和植株再生過程， 顯著地縮短了玉米轉(zhuǎn)基因周期，加快了玉米轉(zhuǎn)基因育種進程。4.本發(fā)明適合于不同的玉米品種，轉(zhuǎn)化效率不會受到基因型的限制，可滿足目前生產(chǎn)上應用的玉米骨干自交系的轉(zhuǎn)化要求，簡單高效。本發(fā)明僅需簡單的設備和常規(guī)試劑， 可一次性完成大規(guī)模的植株轉(zhuǎn)化。5. T1代玉米轉(zhuǎn)基因植株的篩選采用除草劑噴灑2-3葉期幼苗，不依賴于抗生素篩選，操作簡單、成本低。


圖1是本發(fā)明電動注射儀結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明PCR檢測抗性植株結(jié)果圖。
具體實施例方式下面將通過具體實例介紹本發(fā)明具體實施過程。1.材料和方法1. 1玉米品種品種為目前生產(chǎn)上應用的玉米骨干自交系aieng58，但本發(fā)明適用的玉米品種沒有具體限制。1. 2農(nóng)桿菌菌株及外源基因農(nóng)桿菌菌株為LBA4404或EHA105，質(zhì)粒為PCAMBIA1301，篩選標記為除草劑(bar)。2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化液的制備農(nóng)農(nóng)桿菌株轉(zhuǎn)化液的制備包括三個過程增殖培養(yǎng)、病毒基因誘導培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化液的配置。具體的操作過程如下1、從-70°C凍存的農(nóng)桿菌株LBA4404-1301-bar刮取少量菌體，接種于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上，于避光培養(yǎng)2d ；2、從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中J8°C， 230rpm 培養(yǎng) 16_24h ；3、吸取上述過夜培養(yǎng)物按1 50的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，280C 230rpm振蕩培養(yǎng)4_6h，至0D600值為0. 6-0. 8 ；4、經(jīng)增殖培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液離心后收集菌體，按照離心前菌液體積1 50的比例，用AB誘導液懸浮菌體，然后于條件下150-180rpm震蕩培養(yǎng)12h，進行農(nóng)桿菌的Vir 基因誘導培養(yǎng)；所述的AB誘導培養(yǎng)液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04、lg/L NH4C1、0. 3g/ L MgS04 · 7H20、0. 15g/L KC1、0. Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04 · 7H20、0. 5g/L MES、2mM Na3P04、5g/L蔗糖、5g/L葡萄糖、IOOuM乙酰丁香酮，pH為5. 6。5、經(jīng)病毒基因誘導培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液離心后，用MS轉(zhuǎn)化液重新懸浮菌體，轉(zhuǎn)化液0D600值調(diào)整為0. 8-1. 0，此菌液即為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液；其中，MS轉(zhuǎn)化液為組分為1/4MS、 2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2，4_D、100uM 乙酰丁香酮，pH 為 5. 8。
3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的注射從試驗田中選取生長健壯的玉米植株，在玉米雌穗抽絲前用紙袋將其套住，當花絲抽出雌穗苞葉4-5cm時，開始注射。首先將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液，添加0.03%-0.05% (V/V)濃度的表面活性劑Silwet L-77后，裝入電動注射儀中，然后從雌穗下部將注射儀針頭插入雌穗最內(nèi)層苞葉處，按住壓力開關3-5秒，然后將針頭拔出，注射完畢。一次后重復一次注射。 然后用剪刀將花絲貼近苞葉處剪平，注射后24h后開始授粉。上述電動注射儀如圖1所示， 包括轉(zhuǎn)化液容器1、壓力電泵2、壓力控制閥3、塑料軟管4、注射控制閥5、注射針頭6 ；壓力電泵2位于轉(zhuǎn)化液容器1底部并和塑料軟管4相連；壓力電泵2在壓力控制閥3的控制下， 將轉(zhuǎn)化液容器1中的轉(zhuǎn)化液壓入塑料軟管4 ；塑料軟管4 一端連接壓力電泵2，另一端通過注射控制閥5連接注射針頭6 ；注射控制閥5為按壓式，按壓打開注射控制閥5，放開關閉注射控制閥5 ；打開注射控制閥5時，被壓力電泵2壓入塑料軟管4中的轉(zhuǎn)化液通過注射針6 注射。壓力電泵2由內(nèi)置的電池組驅(qū)動。4.轉(zhuǎn)化體的篩選待植株種子成熟后收獲T1代種子，脫粒并曬干，然后播種。待幼苗長至2-3葉期， 開始進行除草劑抗性篩選。除草劑(Basta)要均勻的噴灑到每一顆幼苗的葉片上，濃度為 0.1%。一周后觀察哪些幼苗是具有抗性植株。5.轉(zhuǎn)化體的PCR的檢測對除草劑篩選表現(xiàn)抗性的玉米植株，分別掛牌編號，將其葉片取回，采用CTAB法提取葉片基因組。根據(jù)載體中bar基因序列設計特異性引物，引物序列如下Bar-F 5' GCCTCGAGATGAGCCCAGAACGACG 3‘Bar-R 5' GCCTCGAGTCAGATCTCGGTGACGG 3‘以抗性植株的DNA為模板進行PCR檢測(L1-L5)，含bar基因的質(zhì)粒為陽性對照 ⑴，以未轉(zhuǎn)化玉米植株葉片DNA為陰性對照㈠，反應條件如下
94 "C 94 "C 65 "C 72 "C 72 "C反應體系如下10XPCR buffer :5μ LdNTP (IOmM) 1 μ LBar-F(IOuM) :2 μ LBar-R(IOuM) :2 μ LDNA模板0· 6μ LTaq 酶0· 4μ LddH20 補足 50 μ LPCR擴增后的產(chǎn)物在含有0. 5 μ g/mL溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB)的1. 0%
5 min 45 sec 30 sec 30 sec IOmin
32 cycles瓊脂糖凝膠上電泳，產(chǎn)物大小為^Obp。結(jié)果顯示選取的5株抗性玉米植株PCR檢測均為陽性，如圖2所示。通過除草劑抗性篩選和PCR分子檢測，表明外源基因已經(jīng)成功地整合到玉米基因組中，整個流程操作簡單，轉(zhuǎn)化頻率高，為玉米轉(zhuǎn)基因技術提供了一種簡便、高效的新方法。
權利要求
1.一種高通量農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，農(nóng)桿菌菌株為 LBA4404或EHA105，質(zhì)粒為PCAMBIA1301，篩選標記為除草劑，包括以下步驟步驟1 對農(nóng)桿菌進行增殖培養(yǎng)，病毒基因誘導培養(yǎng)后，配制農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液；步驟2 將步驟1的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注入玉米雌穗最內(nèi)層苞葉的空隙處，浸泡雌花序一定時間后進行授粉；步驟3 收獲種子播種后，對幼苗進行除草劑抗性篩選；步驟4 對具有除草劑抗性的植株進行PCR檢測篩選。
2.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的步驟1的增殖培養(yǎng)方法為將凍存的農(nóng)桿菌株接種于含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEP平板上，于觀！避光培養(yǎng)2d后，從YEP平板上挑取單菌落接種于含上述抗生素的 YEP液體培養(yǎng)基中，28 V，230 rpm培養(yǎng)16-24 h ；吸取上述過夜培養(yǎng)物按1 50的比例接種于含有相應抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，28 0C 230 rpm振蕩培養(yǎng)4-6 h，至0D_ 值為 0. 6-0.8。
3.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟1的誘導培養(yǎng)方法為經(jīng)增殖培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液離心后收集菌體，按照離心前菌液體積 1 50的比例，用AB誘導液懸浮菌體，然后于條件下150-180rpm震蕩培養(yǎng)12h，進行農(nóng)桿菌的Vir基因誘導培養(yǎng)；所述的AB誘導培養(yǎng)液含3g/L K2HP04、lg/L NaH2P04Ug/L NH4Cl、0.3g/L MgS04*7 Η20、0· 15g/L KCl、0· Olg/L CaC12、0. 0025g/L FeS04*7H20、0. 5g/ L MES、2 mM Na3P04、5g/L 蔗糖、5g/L 葡萄糖、100 uM 乙酰丁香酮，pH 為 5. 6。
4.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟1的配制農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液為將經(jīng)誘導培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液離心后，用MS轉(zhuǎn)化液重新懸浮菌體，轉(zhuǎn)化液OD6tltl值調(diào)整為0. 8-1. 0，此菌液即為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液；所述MS轉(zhuǎn)化液為組分為 1/4MS、2% sucrose,0. 05% silwet_77、2ng/L 6_BA、lng/L 2，4_D、100uM 乙酰丁香酮，pH 為 5. 8。
5.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟2的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液在注入玉米雌穗最內(nèi)層苞葉的空隙之前，添加0. 03% - 0. 05%表面活性劑 Silwet L-77。
6.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液注入玉米雌穗使用電動注射儀；所述電動注射儀包括轉(zhuǎn)化液容器(1)、壓力電泵 (2)、壓力控制閥(3)、塑料軟管(4)、注射控制閥(5)、注射針頭(6)；壓力電泵(2)位于轉(zhuǎn)化液容器⑴底部并和塑料軟管⑷相連；壓力電泵⑵在壓力控制閥⑶的控制下，將轉(zhuǎn)化液容器(1)中的轉(zhuǎn)化液壓入塑料軟管；塑料軟管(4) 一端連接壓力電泵O)，另一端通過注射控制閥( 連接注射針頭(6)；注射控制閥( 為按壓式，按壓打開注射控制閥(5)， 放開關閉注射控制閥(5)；打開注射控制閥(5)時，被壓力電泵(2)壓入塑料軟管(4)中的轉(zhuǎn)化液通過注射針(6)注射。
7.根據(jù)權利要求1所述的農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，玉米雌穗在抽絲前用紙袋套住，于轉(zhuǎn)化液注入24h后進行授粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高通量農(nóng)桿菌介導的玉米基因原位轉(zhuǎn)化方法，其主要步驟包括1、含有外源目的基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液的培養(yǎng)；2、轉(zhuǎn)化液添加表面活性劑SilwetL-77后用電動注射儀將該轉(zhuǎn)化液注入到玉米雌穗最內(nèi)層苞葉的空隙處，使其浸泡雌花序，然后進行授粉；3、將收獲種子播種后，對玉米幼苗除草劑抗性篩選，對除草劑抗性植株進行PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本方法避免了組織培養(yǎng)過程中對外植體基因型要求嚴格的缺陷和植株再生的過程，縮短了玉米轉(zhuǎn)基因周期，利用電動注射儀每人每天可完成6000-8000株玉米的轉(zhuǎn)化，可獲得大量的轉(zhuǎn)化體，進行玉米轉(zhuǎn)基因研究。
文檔編號A01H5/00GK102533851SQ20121002199
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權日2012年1月31日
發(fā)明者何紅升, 周建, 朱蘇文, 程備久, 趙陽, 項艷, 馬慶 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學