專利名稱：一種調(diào)控水稻莖稈高度的組蛋白去甲基化酶基因jmj703及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703，同時還涉及一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703的制備方法，還涉及一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703的用途，所述的基因參與組蛋白甲基化和植物的莖桿高度調(diào)控。
背景技術(shù)：
糧食安全已經(jīng)是一個世界性的難題。水稻作為全球的主要糧食作物之一，對緩解糧食短缺，尤其是保障我國的糧食安全有著重要的意義，如何提高水稻產(chǎn)量已經(jīng)成為一項具有重要意義的科學(xué)問題。同時，作為禾本科植物研究的模式生物，相關(guān)方面的研究也具有相當(dāng)?shù)睦碚撘饬x。20世紀(jì)60年代初，第一次綠色革命的興起極大的提高了糧食產(chǎn)量，其主要特征就是將水稻的高桿變矮桿并輔助以農(nóng)藥、化肥和農(nóng)業(yè)機械的廣泛應(yīng)用。矮桿基因的發(fā)現(xiàn)使水稻可以抗倒伏，同時突破了肥料的使用限制，是第一次綠色革命的關(guān)鍵。在后來的育種實驗中，矮桿已經(jīng)成為一個必不可少的性狀。表觀遺傳調(diào)控是指在不改變DNA序列的前提下，以染色質(zhì)為物質(zhì)基礎(chǔ)，調(diào)控基因的時空表達，從而調(diào)控細(xì)胞活動及個體發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)。組蛋白修飾是表觀調(diào)控的主要組成部分之一。組蛋白修飾是指構(gòu)成核小體骨架的組蛋白的末端(尾巴)可以發(fā)生如甲基化、乙?；裙矁r修飾，這些修飾通過改變核小體的結(jié)構(gòu)和染色質(zhì)的蛋白識別調(diào)控相應(yīng)區(qū)域的基因表達(Kouzarides.Chromatin modifications and their function.Cell.2008,128:693-705)。組蛋白甲基化是目前為止研究的最多的修飾之一，主要發(fā)生在組蛋白的氨基末端的賴氨酸殘基和精氨酸殘基，其中賴氨酸的甲基化有三種形式:單甲基化、二甲基化和三甲基化；精氨酸有兩種形式:單甲基化和二 甲基化。不同位點、不同形式的甲基化會對基因的表達產(chǎn)生不同的影響，例如，組蛋白H3第三位賴氨酸的三甲基化修飾(H3K4me3)多分布在活躍表達的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。甲基化水平由甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同調(diào)節(jié)。Jumonji類蛋白是迄今發(fā)現(xiàn)的僅有的兩類組蛋白去甲基化酶家族中主要的一個家族，廣泛參與了基因表達調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成等過程和生物體的發(fā)育過程，然而它們在植物中的研究還很少。擬南芥和水稻中各有20個基因，擬南芥中JMJ11，JMJ12，JMJ14，JMJ15, JMJ25 和 JMJ30 的功能有了初步的研究(Chen etal.Epigenetic gene regulationby plant Jumonji group of histone demethylase.BBA Gene Regul Mech.2011,8 =421-426)，而水稻中目前僅有一個JMJ706的相關(guān)報道(Sun andZhou.RicejmjCdomain-containing geneJMJ706 encodes H3K9 demethylase required for floral organdevelopment.PNAS.2008，105:13679-13684)。綜上所述，本發(fā)明的相關(guān)研究將在水稻的育種應(yīng)用和理論研究上具有一定的價值
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703,該基因去除組蛋白H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3甲基化修飾，而水稻中目前僅有一個組蛋白去甲基化酶基因的相關(guān)報道，該基因的研究為其做了補充。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703在調(diào)控水稻株高方面中的應(yīng)用，該基因抑制表達后水稻的莖桿邊矮，更抗倒伏，但是葉片等器官發(fā)育正常，從而為育種提供了一個選擇的株型。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):申請人:通過檢索染色質(zhì)蛋白數(shù)據(jù)庫(chromdb, http://www.chromdb.0rg/),選取了其中一個組蛋白去甲基化酶及基因JMJ703，其全長cDNA登錄號為AK121381，基因ID號為4338043，預(yù)測編碼區(qū)由3717個堿基組成，編碼1238個氨基酸，此基因的功能研究在水稻中尚沒有相關(guān)文章發(fā)表。通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)的方法，將該基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到水稻中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的莖桿高度比野生型矮，但是葉片的長度卻沒有明顯的變化從而改進了水稻的柱形。通過煙草異源體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，JMJ703蛋白是一種組蛋白H3K4mel/H3K4me2/H3K4me3的去甲基化酶。以上表明本發(fā)明的JMJ703是有功能的組蛋白去甲基化酶基因并且調(diào)控水稻的莖桿伸長過程。一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703的制備方法，其步驟如下:從染色質(zhì)蛋白數(shù)據(jù)庫(chromdb,http://www.chromdb.0rg/)得到 JMJ703 基因的核苷酸序列，根據(jù)該序列設(shè)計引物對，以水稻的cDNA為模板，擴增了 JMJ703的一段(距翻譯起始位點第2282至第2834個堿基)，一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述引物對的DNA序列如下: RiJMJ703-F (正向引物)5 ’ -GGGACTAGTGGTACCGGAATGAGTTGTCATGTACAACAAA-3 ’RiJMJ703-R (反向引物)5 ’ -GGGGAGCTCGGATCCGCAGGGGGATCTAAAGAAGG-3 ’I)將步驟(I)中擴增片段連接到抑制表達載體pdsl301上(已經(jīng)在圖中說明，請見圖1B，載體骨架為pCAMBIA1301，購自澳大利亞CAMBIA公司)，獲得轉(zhuǎn)化載體pdsl301-JMJ703o2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法(Hiei Y et.al.，Efficient transformationofrice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis oftheboundaries of the T-DNA.PlantJ.1994，6:271-282)將所述的載體導(dǎo)入水稻受體中花11 (遺傳資源來源披露表-1)，獲得轉(zhuǎn)化植株；3)借助PCR的方法分析鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株，再利用realtime-PCR分析轉(zhuǎn)基因植株中相關(guān)基因的表達；4)鑒定轉(zhuǎn)基因植株的表型，并進行統(tǒng)計分析；設(shè)計序列特異的引物，擴增JMJ703的一段(距翻譯起始位點第340至第2100個堿基)，一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，同時得到一種分離的蛋白質(zhì)片段，其序列為SEQID NO:3所示的氨基酸序列。擴增的引物序列如下:FA-NCZ-F (正向引物)5 ’ -GCTCTAGAATGACGAGACGCAGACAACAGCT-3 ’FA-NCZ-R (反向引物)5 ’ -GCTCTAGATGGACCATCAGTTAATCTGCG-3，。 將SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列用XbaI單酶切克隆到克隆到煙草表達載體PFA121上(見圖1)后，利用農(nóng)桿菌在煙草葉片中瞬時表達，再分離出葉片的細(xì)胞核，用特異的組蛋白修飾的抗體雜交，觀察修飾的水平是否下降。結(jié)果顯示，與沒有表達SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的細(xì)胞核相比，表達了這段序列的細(xì)胞核的組蛋白H3K4的甲基化修飾水平明顯下降，說明SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列表達后可以去除H3K4mel，H3K4me2，H3K4me3的甲基化，見圖6 (詳細(xì)見實施例3A)。將表達有SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的煙草葉片提取蛋白純化后，得到SEQIDNO:3所示氨基酸序列的蛋白，該蛋白與小牛組蛋白體外孵育后，H3K4甲基化修飾水平下降，說明SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列具有去除H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3的甲基化修飾的功能，見圖7 (詳細(xì)見實施例3B)。一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703在調(diào)控水稻株高方面得到應(yīng)用，其步驟是:將得到的SEQ ID NO I所示的核苷酸序列克隆到pdsl301(見圖1B)上，轉(zhuǎn)化水稻(詳細(xì)見實施例2)。經(jīng)過統(tǒng)計分析和組織切片分析后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的莖桿高度變矮，但是葉片等器官的發(fā)育沒有明顯變化，從而影響了水稻株型，更加抗倒伏，為水稻育種提供了一個株型的選擇(詳細(xì)見實施例4)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果:組蛋白甲基化是目前研究的最熱的表觀修飾之一，染色質(zhì)甲基化水平的動態(tài)平衡對基因表達調(diào)控期重要作用，而JMJ類蛋白是目前僅有的兩類組蛋白去甲基化酶中主要的一類。植物中的研究更是知之甚少。水稻中的JMJ類組蛋白去甲基化酶僅有一例報道，作用于H3K9位點，本發(fā)明的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703的功能尚未闡明，其在水稻的發(fā)育中的作用也沒有未見報道。本發(fā)明通過測定其生化酶活性，發(fā)現(xiàn)JMJ703蛋白可以去除H3K4位點的甲基化，豐富了水稻中組蛋白去甲基化酶作用位點的類型。抑制該基因的表達使水稻植株出現(xiàn)了莖桿變短的·表型，而葉片等其他器官的發(fā)育正常，較矮的莖桿可以提高水稻的抗倒伏能力，優(yōu)化水稻的株型，為水稻的育種提供了更多的選擇。


圖1A為一種和煙草表達載體pFA121(通過改造pBI 121而來，Genbank ID:AF485783.1)示意圖。pFA121由如下方法獲得:用XbaI和EcoRI (均購自寶生物工程大連有限公司)將pBI 121 (Genbank ID:AF485783.1)上的GUS基因切除后，回收載體片段，再以FLAG:HA標(biāo)簽連入。圖1B為一種抑制表達載體pdsl301不意圖。將pMCG161 (GenBank ID:AY572837.1)用 EcoRI 和 HindIII (均購自寶生物工程大連有限公司)酶切后回收外源片段，再連入到pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)中得到pdsl301ο圖2為一種抑制表達Tl代轉(zhuǎn)基因植株中JMJ703基因的表達量檢測示意圖。(ZHlI 為野生型，ds3-l-2, ds3-l_7，ds3-5_2，ds3-5_6，ds3-6_2 為轉(zhuǎn)基因陰性對照)。圖3為一種抑制表達JMJ703基因后水稻植株的表型及統(tǒng)計結(jié)果示意圖。JMJ703被抑制后，植株呈現(xiàn)半矮化的表型，每一個節(jié)間都變短，但葉片大小沒有明
顯變化。
圖4為一種抑制表達JMJ703基因后水稻植株的細(xì)胞學(xué)表型及統(tǒng)計結(jié)果示意圖。JMJ703被抑制后，雖然植株節(jié)間變短，但是節(jié)的細(xì)胞長度并沒有明顯變化。圖5為一種細(xì)胞周期相關(guān)基因在抑制表達植株中的表達情況不意圖。其中一個抑制細(xì)胞周期進程的基因RBRl在JMJ703抑制植株中上升表達。圖6為一種JMJ703蛋白的組蛋白去甲基化活性實驗示意圖。DAPI指示細(xì)胞核的位置，ant1-HA指示表達有JMJ703蛋白的細(xì)胞核，ant1-methylated histories 指不細(xì)胞核的組蛋白修飾狀況，H3K4meI, H3K4me2, H3K4me3,H3K27me3指不同位點的組蛋白修飾情況。若箭頭指示的含有JMJ703蛋白的細(xì)胞核有組蛋白修飾的信號則表達JMJ703不去除該種修飾，反之則JMJ703去除了組蛋白修飾，結(jié)果顯示JMJ703 去除了 H3K4mel，H3K4me2, H3K4me3 修飾。
圖 為一種JMJ703蛋白的組蛋白去甲基化體外活性實驗示意圖。
FAJ3NCZ代表加入JMJ703蛋白的量，H3K4mel, H3K4me2, H3K4me3和H3分別指示western雜交所用的抗體:其中H3指示底物的量(表示各個樣品之間的差異不是由于底物的多少引起的)，H3K4mel, H3K4me2, H3K4me3分別指示底物上著三種修飾的含量。結(jié)果顯示加入的JMJ703蛋白越多，底物的三種甲基化水平越低，說明JMJ703的去甲基化活性。
具體實施例方式實施例1:相關(guān)序列的獲得對本發(fā)明所需要的基因(登錄號AK121381, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide/37991004)，主 要通過RT-PCR方法(參見:J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，北京，科學(xué)出版社，2002版)進行擴增得到JMJ703基因特異的一段序列，A、先抽提來自水稻幼苗葉片的RNA, RNA抽提用試劑是Invitrogen公司的Trizol抽提試劑盒(具體操作步驟見試劑盒說明書)；B、RT-PCR中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈的步驟如下:①配混合液1:總RNA 2 μ g，DNaseI 2U, IOxDNAseI buffer I μ L，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的強烈抑制劑)處理水(0.01% DEPC)到10 μ L，混勻后將混合液I在37°C放置20分鐘以除去DNA，②20分鐘后將混合液I置于65°C水浴中溫浴10分鐘以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分鐘，③向混合液I中加入I μ I 500 μ g/ml的oligo (dT)，④將在冰上冷卻的混合液I立即置于65°C水浴中溫浴10分鐘，以徹底使RNA變性，然后置于冰上5分鐘，⑤配混合液2:混合液I 10 μ 1，5x first strand buffer 4 μ 1,0.1M DTT (疏基乙醇)2 μ I, IOmM dNTP mixture 1.5 μ I,DEPC處理水0.5 μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶2 μ 1，混勻后將混合液2置于42°C水浴鍋內(nèi)溫浴1.5小時，⑥反應(yīng)結(jié)束后將混合液2置于90°C干浴3分鐘，⑦_20°C保存反應(yīng)最終產(chǎn)物，反應(yīng)中用到的試劑全部購自Invitrogen公司；C、然后根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)公布的 JMJ703 基因的全長cDNA序列，設(shè)計特異引物PCR擴增特異片段。PCR用到的體系為20 μ 1，具體配法為:cDNA 第一鏈模板 I μ 1，IOxPCR buf f er2 μ I, IOmM dNTP 1.6μ 1,2.5mM Mg2+L 5 μ 1，RiJMJ703-F和RiJMJ703-R引物各0.4 μ I (用于抑制表達載體的引物為RiJMJ703_F和RiJMJ703-R ;用于煙草表達的載體的引物為FA-NCZ-F和FA-NCZ-R)，LATaq酶0.2 μ 1，加水到20 μ I (所用到的PCRbuffer、dNTP、Mg2+、LATaq酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下:①94°C 4分鐘，②94°C 30秒，③56°C 30秒，④72°C 30秒，⑤從②-④循環(huán)30次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。D、最后將擴增產(chǎn)物連接到T/A克隆載體pGEMT-vector (購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)上用T7和SP6引物測序驗證。用來克隆JMJ703抑制載體片段的引物為:RiJMJ703-F (正向引物)5 ’ -GGGACTAGTGGTACCGGAATGAGTTGTCATGTACAACAAA-3 ’RiJMJ703-R (反向引物)5 ’ -GGGGAGCTCGGATCCGCAGGGGGATCTAAAGAAGG-3 ’最終得到的JMJ703基因的抑制載體片段的cDNA序列，一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。用來克隆煙草異源表達的引物為:FA-NCZ-F (正向引物)5，-GCTCTAGAATGACGAGACGCAGACAACAGCT-3 ’FA-NCZ-R (反向引物)5，-GCTCTAGATGGACCATCAGTTAATCTGCG-3 ‘最終得到的JMJ703基因的煙草異源表達片段的cDNA序列，一種分離的DNA片段，其序列為SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列和一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID N0:3所
示的氨基酸序列。實施例2 =RNAi雙鏈抑制表達載體的構(gòu)建:I)將得到的SEQ ID NO:1的序列用BamHI和KpnI雙酶切(購自寶生物工程大連有限公司，具體參見內(nèi)切酶說明書)，回收目標(biāo)片段后連到雙鏈抑制載體上。連接酶購自NEB公司，反應(yīng)體系參見說明書。2)連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法(電轉(zhuǎn)化儀為印pendorf公司產(chǎn)品，所用電壓為1800v，操作方法見儀器說明書)導(dǎo)入大腸桿菌DH10B(購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，即美國Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(購自羅氏生物公司產(chǎn)品)的LA (LA配方參見J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版)LA抗性培養(yǎng)基上涂皿培養(yǎng)；3)將LA抗性培養(yǎng)基上長出的單菌落在超凈工作臺接種于滅菌的IOml離心管，管內(nèi)預(yù)先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培養(yǎng)基，然后在37°C搖床上培養(yǎng)16-18小時。按照(《分子克隆實驗指南》，J.薩姆布魯克和D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002)所述的方法抽提質(zhì)粒，用KpnI和BamHI (購自寶生物工程大連有限公司)酶切檢測，得到的陽性質(zhì)粒用pMCG-lF(上海生工合成)和pMCG-lR(上海生工合成)測序驗證，得到抑制表達第一鏈載體；所用引物序列如下:pMCG-lF:CTGCTCCACACATGTCCATTpMCG-lR: CCCACCATCTTGTGGAGCTA4)用步驟I)中的方法，將SEQ ID NO:1的序列用SacI和SpeI (購自寶生物工程大連有限公司)雙酶切后連接到經(jīng)過測序驗證的抑制表達第一鏈載體上，用PMCG-2F (上海生工合成)和pMCG-2R(上海生工合成)測序驗證，得到完成的雙鏈抑制表達載體；所用引物序列如下:pMCG-2F: GGCTCACCAAACCTTAAACAApMCG-2R: CTGAGCTACACATGCTCAGGTT
5)把步驟4)的抑制表達載體通過電轉(zhuǎn)化的方法(參考文獻和使用的電壓參數(shù)按照本實施例步驟2)的方法進行)導(dǎo)入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)EHA105 (購自澳大利亞CAMBIA實驗室)菌株中。將轉(zhuǎn)化后的菌株命名為RiJMJ3-EHA105。實施例3: —種水稻組蛋白去甲基化酶在組蛋白H3K4去甲基化方面的功能A、JMJ703蛋白體內(nèi)去甲基化酶活性的分析:由于組蛋白甲基化修飾可以以不同的形式發(fā)生于不同的位點，JMJ類蛋白的去甲基化活性也有特異性，故用煙草異源表達的方式確定JMJ703蛋白的去甲基化活性。將序列表中的序列為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列克隆到煙草表達載體pFA121(見圖1)上，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草后用免疫染色(Immunostaining)的方法檢測表達JMJ蛋白的細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白修飾情況。具體方法如下:I)用XbaI單酶切列表中的其序列為SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列后，回收目標(biāo)片段，克隆到pFA121(見圖1)上，35S引物測序驗證方向正確后，用電轉(zhuǎn)(1800伏)的方法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，得到JMJ703的煙草轉(zhuǎn)化菌株J3NCZ-EHA105。在5ml含有250ppm卡那霉素、IOmM MES和40 μ M乙酰丁香酮的LB中接種10 μ I的J3NCZ-EHA105，28°C搖床培養(yǎng)16小時左右。第二天收集菌體，用含IOmM氯化鎂的水重懸并調(diào)節(jié)菌體OD值到1.0，加入乙酰丁香酮至終濃度為200 μ M，靜置3小時以上。將菌液轉(zhuǎn)移到注射器內(nèi)，去掉針頭，以食指抵住煙草葉片，將菌液用注射器從煙草的背頁面擠壓滲透到煙草葉片中，完成轉(zhuǎn)化。2) 2天后，將轉(zhuǎn)化的煙草葉片剪成I厘米見方左右大小，浸入含4% (體積/體積)甲醛的緩沖液I中QOmM TisHCl，ρΗ7.5，IOOmM NaCl, IOmM EDTA)，抽真空20分鐘，再用緩沖液I洗兩次，每次10分鐘，吸干殘留水分后在緩沖液2中(15mM TisHCl, pH7.5,20mMNaCl,2mM EDTA，0.5mM精胺，80mM KC1，0.1 % Triton X-100)將葉片盡量剪碎是細(xì)胞核釋放出。用200目的篩子過濾去掉殘渣后再以1: 4的比例將上清稀釋到緩沖液3中(IOOmMTisHCl，ρΗ7.5，2mM MgCl2, 50mM KCl，0.1 % Triton X-100，5%蔗糖，0.05% (體積 / 體積)吐溫-20)，再取稀釋過的液體70 μ I滴在涂過多聚賴氨酸的玻片上，自然風(fēng)干后置于_20°C待用。3)取制作好的片子在含4 % (體積/體積)甲醛的KPBS (NaCl 128mM, KCl2mM, Na2HP048mM, KH2P042mM, pH 7.2)-0.1 % Triton X-100 緩沖液中交聯(lián) 20 分鐘后，用KPBS-0.1% Triton X-100洗三次，每次5分鐘。將玻片置于封閉液(含1% (質(zhì)量/體積)小牛血清蛋白(BSA)的KPBS-0.1 % TritonX-100)中，37°C封閉30分鐘。這期間配制一抗，即同時將HA的抗體和組蛋白修飾的抗體以1: 300稀釋到封閉液中。用KPBS-0.1%Triton X-100洗三次，每次5分鐘洗去封閉液后，將配好的一抗滴加在玻片有樣品的地方，蓋上封口膜，4°C雜交過夜。第二天，輕輕揭去封口膜，將玻片在KPBS中洗3次，再次封閉后滴加以1: 200稀釋在封閉液中的二抗，37°C雜交2小時，再輕輕揭去封口膜，KPBS洗3次后往玻片上有樣品的地方滴加20 μ I 4!，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，在滴加一滴保護劑(H-1000, VECTASHIELD )，保濕和減緩熒光淬滅。再在激光共聚焦顯微鏡下觀察(Leica)。用到的抗體:HA 抗體(Μ20003Μ, ab-mart)，H3K4mel (ab8895, abeam)，H3K4me2 (04-790，millipore), H3K4me3 (07-473, millipore), H3K27me3 (ABE44, millipore), Alexa Fluor 488 標(biāo)記羊抗鼠二抗(A-l 1029, invitrogen), Alexa Fluor 568 標(biāo)記羊抗兔二抗(A-11036,invitrogen).結(jié)果如圖6所示,能夠檢測到JMJ703蛋白的細(xì)胞核都失去了 H3K4甲基化的信號，而H3K27的甲基化信號沒有丟失，說明JMJ703是一種組蛋白H3K4的去甲基化酶，可以去除該位點所有三種形式的甲基化。B、JMJ703蛋白體體外甲基化酶活性的分析:I)按照實施例3中所描述的方法完成含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列載體的煙草轉(zhuǎn)化后，去轉(zhuǎn)化過的煙草葉片，在液氮中研磨成粉，按照1: 2(質(zhì)量/體積)加入到總蛋白抽提緩沖液中(50mM TisHCl，ρΗ7.5，150mM NaCl，0.5% Triton X-100)，混合均勻后，4度條件下1200rpm離心15分鐘，取上清液與100 μ I的ANT1-FLAG M2 MagneticBeads(SIGMA-ALDRICH公司，貨號:M8823)混合，在4度冰箱里顛倒孵育過夜。第二天，將混合液放在磁力架上，棄去上清，用TBS(50mM TisHCl, pH7.4,150mM NaCl)洗滌磁珠3次，每次十分鐘。最后用100 μ I含有150ng/y I的3XFLAG多肽與磁珠在室溫下孵育30分鐘，得到洗脫的蛋白，命名為FA-NCZ，序列如SEQ IDNO:3所示。2)分別取 O μ I，20 μ I 和 60 μ I 的 FA-NCZ 與 30 μ g 的小牛組蛋白(SIGMA-ALDRICH公司，貨號 H9250)在反應(yīng)緩沖液(50mM HEPES, pH 8.0, IOOmM [NH4]2Fe [S04]2, ImMa-ketoglutarate, 2mM抗壞血酸,5%甘油,0.2mM PMSF)中37度條件孵育8小時,反應(yīng)總體積100 μ I。反應(yīng)結(jié)束后分別加入35 μ I上樣緩沖液(62.5mMTris-HCl,pH 6.8,2% SDS,25%甘油，0.01%溴酹藍(lán)，10% β -巰基乙醇)再分別取10 μ I進行western分析。3)將反應(yīng)完成的蛋白進行western檢測，western blot轉(zhuǎn)膜使用Bio-Rad公司的Mini Trans-Blot Cell轉(zhuǎn)印槽系統(tǒng),按照其說明書，將組蛋白轉(zhuǎn)至Amersham公司的Hybond-P PVDF膜上，用配好的含2% (質(zhì)量/體積)小牛血清蛋白(BSA)的PBS緩沖液(NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4L 4mmol/L, pH 7.5)對膜封閉兩小時以上,然后以體積比1: 10000加入不同的抗體(如后所示)室溫孵育兩小時左右。用到的抗體:HA 抗體(M20003M，ab-mart)，H3K4mel (ab8895, abeam)，H3K4me2 (04-790，millipore), H3K4me3 (07-473，millipore), H3K27me3 (ABE44, millipore), H3(abl791,abeam)。倒掉一抗后，用PBS 緩沖液洗膜三次，每次15分鐘，再加入按體積比為1: 10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(購自SouthernBiotech公司，得博生物科技有限公司(北京)代理)，室溫孵育1-2小時，然后用PBS緩沖液洗膜三次，每次15分鐘，使用SuperSingnalPico (購自Pierce公司)試劑盒按說明書操作方法進行X光片顯影，經(jīng)掃描儀掃描X光片后分析結(jié)果。結(jié)果顯示，隨著外源蛋白FA-NCZ加入量的增加，H3K4的甲基化修飾逐漸減少(H3作為上樣對照)，見圖7，說明JMJ703去除H3K4的三種甲基化修飾。實施例4:一種調(diào)控水稻莖桿高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703在調(diào)控水稻株高方面中的應(yīng)用，其步驟是:A、雙元Ti質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽性和表達量檢測:I)將實施例2中獲得的Ri JMJ3-EHA105 (來自實施例2)向水稻受體品種“中花11”(見遺傳資源來源披露表-1)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化方法參照Hiei等人報道的方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J, 1994,6:271-282)進行。所獲得的TO代轉(zhuǎn)基因植株命名為RiJMJ3-n，其中η = 1,2,3...代表轉(zhuǎn)基因的不同家系。2)取TO代轉(zhuǎn)化植株葉片抽提總DNA，DNA抽提方法為CTAB法(Zhang等，geneticdiversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis, 1992, Theor Appl Genet，83，495-499)。然后用 PCR 方法對 TO 代轉(zhuǎn)化植株用潮霉素引物進行陽性檢測。潮霉素引物的序列如下:Hn-F5, -AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3;，Hn-R 5' -GTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3'(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)總體積為 20 μ 1，具體配法是:模板 lOOng，IOxPCR buffer 2 μ 1，IOmM dNTP 1.6 μ 1,2.5mMMg2+L 5 μ 1，左、右引物(Hn-F和Hn-R)各0.4 μ 1，TAQ酶0.2 μ I加去離子水到20 μ I (所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、rTAQ酶等均購自寶生物工程大連有限公司)。PCR反應(yīng)條件如下:①940C 4分鐘，②94°C 30秒，③56°C 30秒，④72°C 2.5分鐘，⑤從②_④循環(huán)32次，⑥72°C 7分鐘，⑦4°C保存。PCR產(chǎn)物在I % (質(zhì)量/體積)的TBE瓊脂糖凝膠上電泳檢測。因為潮霉素基因為轉(zhuǎn)化載體所特有，這樣能擴增出潮霉素基因特異條帶的轉(zhuǎn)基因植株即為陽性植株。對TO代陽性植株收種子(Tl代)，為Tl代的大田種植和性狀調(diào)查做準(zhǔn)備。3)為了檢測抑制表達植株中的目標(biāo)基因表達量，抽提了 Tl代轉(zhuǎn)基因植株的總RNA，按照實施例1的方法進行反轉(zhuǎn)錄，得到產(chǎn)物后用實時熒光定量PCR的方法檢測JMJ703的表達量。試劑購自寶生物工程大連有限公司，反應(yīng)體系參見說明書。PCR儀為美國ABI公司的7500，PCR參數(shù)為95°C預(yù)變性10秒，進入循環(huán)后95°C變性5秒，60°C退火延伸40秒，40個循環(huán)。結(jié)果見圖2.
用到的JMJ703特異的引物為:ReTJmj 703-F 5’ -ATCAAGGCCCCATGTTCTCA-3’ReTJmj 703-R 5’ -CCGCAGGACTTGCAATTCA-3’B、Tl代性狀調(diào)查和表達分析:1)將Tl代植株種植大田后進行表型觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株的高度要矮于轉(zhuǎn)基因陰性植株，并且 高度的變化是由于莖桿的變短引起的，而葉片的大小卻沒有明顯的變化(圖3);2)為了進一步研究引起株高變異的原因，選取株高變矮的植株和野生型植株的莖桿為材料進行組織切片的觀察。具體操作方法為，選取相同位置的莖桿的成熟區(qū)，切成5mm左右的段，在含50% (體積/體積)乙醇的FAA(甲醛5ml，冰醋酸5ml，50%酒精90ml)中固定過夜，在分別用50%，60%，70%，80%，90%脫水各I小時后，加入曙紅染色過夜，出去染液后，用無水乙醇洗兩次，每次I小時徹底出去水分，再依次用乙醇:二甲苯=1:1和I: 3，以及純二甲苯透明各I小時，再向其中加入碎的石蠟，待石蠟慢慢溶于二甲苯后再繼續(xù)添加石蠟并置于37°C溶解，飽和后再置于60°C，直至飽和后再依次用溶于二甲苯的50%(體積/體積)，75% (體積/體積)和純的石蠟替換，最后將材料包埋在純的石蠟中，冷卻后用于石蠟切片。實驗結(jié)果顯示:突變體和野生型的細(xì)胞長度沒有明顯變化(圖4)，即植株的高矮并不是由于細(xì)胞的長短變化引起的，故推測是細(xì)胞分裂的速率影響了莖桿的高度。3)為了檢測是否是由于細(xì)胞分裂的速率影響了莖桿的高度，選取了細(xì)胞分裂比較旺盛的幼嫩的頂端分省組織區(qū)材料，抽提RNA，按照實施例1的方法進行反轉(zhuǎn)錄，用得到的產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測細(xì)胞周期相關(guān)的一些基因的表達，結(jié)果顯示，一個抑制細(xì)胞分裂的基因RBRl發(fā)生了明顯的上升(圖5)，暗示由于JMJ703基因的下降，直接或間接引起了 RBRl的上升表達，使細(xì)胞分裂速率減慢，導(dǎo)致莖桿變矮。
權(quán)利要求
1.一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
2.一種分離的DNA片段，其序列為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的蛋白質(zhì)片段，其序列為SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求I所述的一種分離的DNA片段在調(diào)控水稻株高方面中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種調(diào)控水稻莖稈高度的組蛋白去甲基化酶基因JMJ703及應(yīng)用，通過檢索染色質(zhì)蛋白數(shù)據(jù)庫，選取了其中一個組蛋白去甲基化酶及基因JMJ703，其全長cDNA登錄號為AK121381，基因ID號為4338043，預(yù)測編碼區(qū)由3717個堿基組成，編碼1238個氨基酸。通過RNA干擾的方法，將該基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到水稻中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的莖稈高度比野生型矮，但是葉片的長度卻沒有明顯的變化從而改進了水稻的柱形。通過煙草異源體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，JMJ703蛋白是一種組蛋白H3K4me1/H3K4me2/H3K4me3的去甲基化酶。本發(fā)明的JMJ703是有功能的組蛋白去甲基化酶基因并且調(diào)控水稻的莖稈伸長過程。該基因抑制表達后水稻的莖稈邊矮，更抗倒伏，但是葉片等器官發(fā)育正常，從而為育種提供了一個選擇的株型。
文檔編號A01H5/00GK103255152SQ201210037018
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者周道繡, 陳香嵩 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)