專利名稱：用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于昆蟲飼養(yǎng)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜的飼養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
褐色桔姆(Toxoptera citricida, Kirkaldy),又稱東方桔姆，屬于同翅目姆總科Aphidoidea，是一種世界性分布的柑桔害蟲，桔蚜不僅通過直接取食為害柑桔，而且是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)的有效傳播介體。柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)屬于長線形病毒屬(Closterovirus),是目前已知植物病毒基因組中最大的病毒。柑桔衰退病毒引起的柑桔衰退病是一種具有經(jīng)濟(jì)重要性的病害，廣泛分布于世界各柑桔產(chǎn)區(qū)，對全世界的柑桔產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。蚜蟲人工飼料研究始于20世紀(jì)30年代，蚜蟲人工飼料飼養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，使得蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期或長期存活。蚜蟲人工飼料可應(yīng)用于蚜蟲傳播病毒機(jī)制、營養(yǎng)生理、共生菌、毒理與殺蟲活性物質(zhì)生物測定以及昆蟲與植物相互關(guān)系等方面的研究，已發(fā)展為這些研究的重要試驗手段。植物病毒介體傳播分子機(jī)制的研究，主要集中在病毒參與傳播的基因及其產(chǎn)物的確定。目前在昆蟲傳播病毒分子機(jī)制的研究中經(jīng)常使用的方法之一是人工飼養(yǎng)昆蟲，使昆蟲在脫離寄植物后能夠正常存活，在飼養(yǎng)液中添加病毒編碼的蛋白質(zhì)、特異性蛋白抗體或在飼養(yǎng)液中添加病毒提取液、雙鏈RNA，通過比較傳毒率的變化，探討昆蟲傳播病毒的相關(guān)因子，對于一些基因組較小的病毒，使用侵染性克隆缺失突變體進(jìn)行傳毒分子機(jī)制的研究， 但CTV基因組比較大，構(gòu)建侵染性克隆缺失突變體比較困難，因此，研究傳毒分子機(jī)制時需要蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活，為研究傳毒分子機(jī)制，需要尋找適合褐色桔蚜取食和生存的實用飼料。酵母提取液作為實用飼料的成分之一，一方面可以提供營養(yǎng)，另一方面液體黃色對蚜蟲有引誘作用，有利于蚜蟲取食。糖類是生物體內(nèi)能量的主要來源，對蚜蟲具有刺激取食和營養(yǎng)雙重作用，不同的蚜蟲所需的蔗糖濃度是不同，目前已對桃蚜和豌豆蚜等不少蚜蟲種類已實現(xiàn)了人工繼代飼養(yǎng)，有桔二叉蚜在人工飼養(yǎng)上飼養(yǎng)I代的報道，但尚無褐色桔蚜人工飼養(yǎng)的資料的報道，而且柑桔衰退病毒的蚜蟲傳播分子機(jī)理進(jìn)展不大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種無毒褐色桔蚜人工飼養(yǎng)的方法，使蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活且不影響傳毒效率，以便于無毒褐色桔蚜傳毒分子機(jī)制的研究。本發(fā)明具體按如下步驟進(jìn)行(I)利用無毒柑桔苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)得到無毒褐色桔蚜從田間采桔蚜蟲源，以初孵若蚜建立無毒種群，初孵若蚜是指剛出生尚未接觸葉面的蚜蟲，用脫毒柑桔苗或?qū)嵣缭陴B(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)褐色桔蟲牙，養(yǎng)蟲室中設(shè)置溫度為25±2°C,光照黑暗為14 : IOh,為了確保連續(xù)有新稍可用于飼養(yǎng)蚜蟲，每兩周修剪20株無毒柑桔苗，追施質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%尿素或復(fù)合肥促發(fā)新稍，若蚜?xí)纬梢粋€群體，群體太多就會產(chǎn)生有翅蚜蟲。為了抑制有翅成蚜的形成和獲得狀態(tài)一致的無翅成蟲，用毛筆輕輕將30頭以上無翅成蟲放在無毒柑桔苗新稍上產(chǎn)下一代若蚜，I 2天后將成蟲轉(zhuǎn)移到另一無毒苗上，下一代的I 2日齡的無翅成蟲備用。不斷挑用毛筆輕挑無翅成蚜于嫩梢，繼代飼養(yǎng)得到無毒蚜蟲備用；(2)飼養(yǎng)液的配制與滅菌；飼養(yǎng)液為A或B兩種，飼養(yǎng)液A為去離子水配制，其配制成分為NaCl 7 10g/L，KCl O. 05 O. 2g g/L，Na2HPO4 · 12Η202· 9 5g/L, KH2PO4 O. 05 O. 2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，pH調(diào)節(jié)為7. O 8. 0，飼養(yǎng)液A在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘，可在飼養(yǎng)液A中添加用于研究傳毒分子機(jī)制的特異性蛋白或者特異性抗體；上述飼養(yǎng)液B為去離子水配制，其配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA0. 2
0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，pH調(diào)節(jié)為7. O 8. O，飼養(yǎng)液B在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘，可在飼養(yǎng)液B中添加用于研究傳毒分子機(jī)制的病毒提取液或者雙鏈RNA ；(3)將無毒褐色桔蚜和飼養(yǎng)液放入飼養(yǎng)室中進(jìn)行飼養(yǎng)飼養(yǎng)室由蚜蟲取食液囊和取食室組成，取食液囊是由雙層拉薄的泊拉膜(Parafilm)夾飼養(yǎng)液滴構(gòu)成，取食室用直徑
1.5 3cm，高2. 5 5cm的雙通管，飼養(yǎng)時，取食液囊固著于取食室的一端，將蚜蟲放人取食室，另一端圍以紗網(wǎng)，防止蚜蟲逃逸，并可起到通風(fēng)的作用，每個飼養(yǎng)室中放10 15頭蚜蟲。在飼養(yǎng)室下方放置水槽，保持一定的濕度。將飼養(yǎng)裝置放置在養(yǎng)蟲室中養(yǎng)蟲室中設(shè)置溫度為25±2°C，光照黑暗為14 10h。為了優(yōu)化，上述飼養(yǎng)液A的配制成分為NaCl 7 10g/L，KCl O. I O. 2g g/L, Na2HPO4 · 12H20 2· 9 4g/L, KH2PO4 0· I 0. 2g/L,酵母提取粉 25_50g/L，蔗糖 200 350g/ L，去離子水配制，上述飼養(yǎng)液B的配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA0. 2 O. 37g/L，酵母提取粉25 50g/L,鹿糖200 350g/L,去離子水配制。上述酵母提取液作為實用飼料的成分之一，一方面可以提供營養(yǎng)，另一方面液體黃色對蚜蟲有引誘作用，有利于蚜蟲取食。糖類是生物體內(nèi)能量的主要來源，對蚜蟲具有刺激取食和營養(yǎng)雙重作用，不同的蚜蟲所需的蔗糖濃度是不同的，本發(fā)明給出了飼養(yǎng)褐色桔蚜優(yōu)化的蔗糖濃度。有益效果(I)本發(fā)明提出的無毒無翅褐色桔蚜蟲在柑桔苗上的繼代飼養(yǎng)，實現(xiàn)了室內(nèi)、周年飼養(yǎng)褐色桔蚜的目的，可以周年獲得齡期和狀態(tài)等較為一致的蟲，克服了以往從自然發(fā)生地采集蟲源，所帶來的易受生長狀態(tài)及齡期等的影響，導(dǎo)致實驗結(jié)果存在差異的缺陷，保證了實驗試蟲的標(biāo)準(zhǔn)化。(2)本發(fā)明飼養(yǎng)方法易于操作，飼養(yǎng)室制作簡單，飼養(yǎng)液易于配制，適合褐色桔蚜成蟲取食，實現(xiàn)了成蚜蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期正常存活，且不影響傳毒效率，適用于褐色桔蚜傳播柑桔衰退病毒的分子機(jī)制的研究。(3)本發(fā)明飼養(yǎng)液A中可以添加用于研究柑桔衰退病毒傳毒分子機(jī)制的特異性蛋白或者特異性抗體，可在飼養(yǎng)液B中添加用于研究柑桔衰退病毒傳毒分子機(jī)制的病毒提取液或者雙鏈RNA ;通過比較傳毒率的變化，探討褐色桔蚜傳播病毒的相關(guān)因子，推動了柑桔衰退病毒傳毒分子機(jī)制的研究。
具體實施例方式實施例I(I)無毒褐色桔蚜蟲在柑桔苗上的繼代飼養(yǎng)桔蚜采自田間，以初孵若蚜(若蚜是指剛出生的蚜蟲，初孵若蚜是指剛出生尚未接觸葉面的蚜蟲)建立無毒種群，用脫毒柑桔苗或?qū)嵣顼曫B(yǎng)褐色桔蚜，為了保證一直有嫩稍飼養(yǎng)蚜蟲，在溫度為25±2°C的溫室每周修剪20株無毒柑桔苗，修剪后施質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 O. 5%尿素或復(fù)合肥促進(jìn)發(fā)梢，發(fā)新稍后移至養(yǎng)蟲室，養(yǎng)蟲室中設(shè)置溫度為為25±2°C，光照黑暗為14 10h，為了抑制有翅成蚜的形成和獲得狀態(tài)一致的無翅成蟲，用毛筆輕輕將 30頭以上無翅成蟲放在無毒柑桔苗新稍上產(chǎn)若蚜，I 2天后將成蟲轉(zhuǎn)移到另一無毒苗上， 下一代的I 2日齡的無翅成蟲備用。(2)飼養(yǎng)液的配制與滅菌配制飼養(yǎng)液I. 2g Tris, O. 37g EDTA，調(diào)pH于7· 8，25g酵母提取粉，配成O、10%、 20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、50 %和60 %不同蔗糖濃度的飼養(yǎng)液，用去離子水配制，定容到 IOOOmL0 121°C下高壓滅菌20分鐘。(3)飼養(yǎng)室的制備飼養(yǎng)室由蚜蟲取食液囊和取食室組成，取食液囊是由雙層拉薄的泊拉膜夾人工飼料液滴構(gòu)成，取食液囊加入300 μ L的飼養(yǎng)液，取食室用直徑I. 5cm,高2. 5cm的雙通管，飼養(yǎng)時，取食液囊固著于取食室的一端，將蚜蟲放人取食室，另一端圍以紗網(wǎng)，防止蚜蟲逃逸，并可起到通風(fēng)的作用，每個飼養(yǎng)室中放10頭蚜蟲。在飼養(yǎng)室下方放置水槽，保持一定的濕度。 將飼養(yǎng)裝置放置在養(yǎng)蟲室中，養(yǎng)蟲室中設(shè)置溫度為25±2°C，光照黑暗為14 IOh0(4)成蟲在飼養(yǎng)室的飼養(yǎng)及觀察每個蔗糖濃度下有3個飼養(yǎng)室，每個飼養(yǎng)室用毛筆輕挑10頭無翅成蟲放入每個飼養(yǎng)室，記錄詞喂48h后成姆數(shù)，結(jié)果如表I :稱量新鮮制作的飼養(yǎng)室和飼喂第3天飼養(yǎng)室的重量變化，分析結(jié)果如表2 表I不同蔗糖濃度的飼料對無翅成蚜存活的影響
權(quán)利要求
1.一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)(1)利用無毒柑桔苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)獲得無毒無翅褐色桔蚜成蟲修剪無毒柑桔苗放入養(yǎng)蟲室中，追施尿素或者復(fù)合肥促發(fā)新稍，從田間采集初孵若蚜建立無毒種群，將無毒種群放在無毒柑桔苗上飼養(yǎng)，用毛筆輕輕將產(chǎn)生的無翅成蟲轉(zhuǎn)移到無毒柑桔苗新梢上產(chǎn)生下一代若蚜，I 2天后將成蟲轉(zhuǎn)移到另一無毒苗上，獲得大量的無毒無翅褐色桔蚜成蟲備用；(2)配制飼養(yǎng)液，滅菌所述飼養(yǎng)液為A或B兩種，飼養(yǎng)液A的配制成分為NaCl7 10g/L，KCl O. 05 O. 2g g/L，Na2HPO4 · 12Η20 2· 9 5g/L, KH2PO4O. 05 0. 2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，所述飼養(yǎng)液B的配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA O. 2 O.37g/L,酵母提取粉25-50g/L,鹿糖O 600g/L,飼養(yǎng)液A和飼養(yǎng)液B均為去離子水配制；(3)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)姆蟲,然后將無毒褐色桔姆成蟲放入飼養(yǎng)室中進(jìn)行飼養(yǎng),飼養(yǎng)室置于養(yǎng)蟲室中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養(yǎng)液A為去離子水配制，其配制成分為NaCl 7 10g/L，KClO.I O. 2g g/L, Na2HPO4 · 12H20 2· 9 4g/L, KH2PO4 0· I 0. 2g/L，酵母提取粉 25_50g/ L，蔗糖 200 350g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養(yǎng)液B為去離子水配制，其配制成分為=Tris I. 2 2g/L， EDTA0. 2 O. 37g/L，酵母提取粉 25_50g/L，蔗糖 200 350g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養(yǎng)液A或飼養(yǎng)液B均在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟(3)中飼養(yǎng)室為雙通管，雙通管一端由泊拉膜封住，飼養(yǎng)液置于泊拉膜上，蚜蟲置于雙通管道中，雙通管的另一端由紗網(wǎng)封住。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜飼養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟⑴或步驟(3)中養(yǎng)蟲室的參數(shù)為溫度為25±2°C，光照黑暗為 14 10h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于傳毒分子機(jī)制研究的無毒褐色桔蚜的飼養(yǎng)方法，包括利用無毒柑桔苗進(jìn)行繼代飼養(yǎng)得到無毒無翅褐色桔蚜，配制飼養(yǎng)液與滅菌，飼養(yǎng)室的制備及飼養(yǎng)。該方法通過調(diào)整無毒柑桔苗上無翅成蚜和下一代若蚜數(shù)，有效抑制了有翅成蚜的形成，實現(xiàn)了周年無毒無翅成蚜的獲得，保證了實驗試蟲的標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的飼養(yǎng)液簡單易于配制，實現(xiàn)了無翅成蚜在脫離寄主植物后得以短期正常存活，并不影響傳毒效率，適用于蚜蟲傳播柑桔衰退病毒的分子機(jī)制研究的需求。
文檔編號A01K67/033GK102578047SQ20121004600
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉金香, 周常勇, 宋震, 李中安, 李玲娣, 王永江 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所