專利名稱：一種牡丹不定芽誘導方法
技術(shù)領(lǐng)域：
牡丹為我國國花，花大色艷，雍容華貴，也為世人普遍喜愛，但牡丹主要靠分株或嫁接繁殖，繁殖系數(shù)低，繁殖速度慢，不能滿足實際需要。目前，對于牡丹快繁的研究，多數(shù)是采用莖尖或休眠芽為外植體，該方法沒有通過細胞脫分化和再分化，屬于微扦插，繁殖系數(shù)低，獲得的幼苗主要因生根困難和移栽成活率低，難以在生產(chǎn)中推廣應用。已有文獻采用不定芽再生的途徑，但外植體一般選用成熟胚、種子或幼苗。李玉花 (2005)建立了牡丹‘鳳丹白’子葉再生體系；肖曉蓬(2008)以多花野牡丹種子為外植體成功建立了快繁體系；劉磊(2009)建立了牡丹‘鳳丹白’成熟胚經(jīng)愈傷組織途徑分化不定芽的完整再生體系，上述方式均來源于種子的再生體系，存在變異，不能保持牡丹原有品種的特性。Beruto, et al (2004)采用牡丹花瓣和花絲為外植體，僅花瓣或花瓣產(chǎn)生的愈傷組織在TDZ誘導下獲得了不定芽的再生，此種方式玻璃化現(xiàn)象較嚴重，難以形成完成的不定芽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種再生率高的牡丹不定芽誘導方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種牡丹不定芽誘導方法，以NAA 和6-BA為誘導劑，以花托為外植體進行誘導培育。本發(fā)明的牡丹不定芽誘導方法具體包括以下步驟以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70 %酒精浸泡15-25seC，清洗一次，經(jīng)浸泡液浸泡8-20min后，無菌水洗3_5次， 每次2-4min ；以花托作為外植體接種，接種到MS培養(yǎng)基添加I. 5-2. 5mg · 1^6-芐基嘌呤 6-BA+0. 1-0. 3mg · L-1 萘乙酸 NAA,蔗糖 25_35g · L_\ 瓊脂 7_8g · L-1，pH 調(diào)至 5. 8，每天光照 14h，光照強度30001uX，溫度25°C，每30天轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基。所述的新鮮培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加了 I. 5-2. 5mg · L^6-芐基嘌呤 6-BA+0. 1-0. 3mg · L-1 萘乙酸 NAA,鹿糖 25_35g · L—1,瓊脂 7_8g · I71。所述的清洗為采用無菌水進行清洗。所述的浸泡液為O. I %的HgCl2或2%的次氯酸鈉。本發(fā)明采用萘乙酸(NAA)和6-芐基嘌呤(6-BA)為誘導，以花托為外植體，花托營養(yǎng)含量豐富，酶類活性高，不定芽再生率較高，可達到100-490. 91%,且玻璃化現(xiàn)象不嚴重， 能夠?；a(chǎn)或基因轉(zhuǎn)化。
具體實施例方式實施例I
本實施例的方法具體步驟為選擇牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，70%酒精浸泡20sec,然后無菌水洗一次，經(jīng)O. I %的HgCl2浸泡IOmin后，無菌水洗4次，每次 3min。置吸水紙上把餅狀的花托分為4份，作為外植體接種；接種到MS培養(yǎng)基添加
2.Omg · L-16-BA+0. 2mg · L-1NAA,鹿糖 30g · L-I,瓊脂 7. 5g · L-I, pH 調(diào)至 5· 8 ;每天光照 14h，光照強度30001ux，溫度25°C ;每30天轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基，經(jīng)過7周的誘導培養(yǎng)，部分牡丹品種的不定芽誘導生成率達100%。實施例2本實施例的方法具體步驟為以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70%酒精浸泡 15sec，清洗一次，經(jīng)O. 1%的HgCl2浸泡15min后，無菌水洗3次，每次2min ;以花托作為外植體接種，接種到MS培養(yǎng)基添加I. 5mg · 1^6-芐基嘌呤6-BA+O. Img · Γ1萘乙酸NAA，蔗糖 25g · ΙΛ瓊脂7g · L-1，pH調(diào)至5. 8，每天光照14h，光照強度30001ux，溫度25。。，每30天轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基。經(jīng)過7周的誘導培養(yǎng)，部分牡丹品種的不定芽誘導生成率達330%。實施例3本實施例的方法具體步驟為以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70%酒精浸泡 25sec，清洗一次，經(jīng)浸泡液浸泡20min后，無菌水洗5次，每次4min ;以花托作為外植體接種，接種到MS培養(yǎng)基添加2. 5mg *^6-芐基嘌呤6-BA+O. 3mg -Γ1萘乙酸NAA，蔗糖35g · Λ 瓊脂8g Ι^,ρΗ調(diào)至5. 8,每天光照14h,光照強度30001ux,溫度25°C,每30天轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基。經(jīng)過7周的誘導培養(yǎng)，部分牡丹品種的不定芽誘導生成率達490. 91%。
權(quán)利要求
1.一種牡丹不定芽誘導方法，其特征在于以NAA和6-BA為誘導劑，以花托為外植體進行誘導培育。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牡丹不定芽誘導方法，其特征在于包括以下步驟以牡丹幼嫩花蕾，除去萼片后，用70%酒精浸泡15-25seC，清洗一次，經(jīng)浸泡液浸泡8-20min 后，無菌水洗3-5次，每次2-4min ；以花托作為外植體接種，接種到MS培養(yǎng)基添加I.5-2. 5mg · L—V 芐基嘌呤 6-BA+0. 1-0. 3mg · L—1 萘乙酸 NAA,蔗糖 25_35g · L-1，瓊脂 7-8g · L_S pH調(diào)至5. 8，每天光照14h，光照強度30001ux，溫度25°C，每30天轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牡丹不定芽誘導方法，其特征在于所述的新鮮培養(yǎng)基為 MS培養(yǎng)基中添加了 I. 5-2. 5mg · L-V芐基嘌呤6-BA+O. 1-0. 3mg · L-1萘乙酸NAA，蔗糖 25-35g · ΙΛ 瓊脂 7-8g · I/1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牡丹不定芽誘導方法，其特征在于所述的清洗為采用無菌水進行清洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牡丹不定芽誘導方法，其特征在于所述的浸泡液為O.1%的 HgCl2或2%的次氯酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡丹不定芽誘導方法，以NAA和6-BA為誘導劑，以花托為外植體進行誘導培育。本發(fā)明采用萘乙酸(NAA)和6-芐基嘌呤(6-BA)為誘導，以花托為外植體，花托營養(yǎng)含量豐富，酶類活性高，不定芽再生率較高，可達到100-490.91％，且玻璃化現(xiàn)象不嚴重，能夠?；a(chǎn)或基因轉(zhuǎn)化。
文檔編號A01H4/00GK102577968SQ20121005676
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者任志敏, 劉亞楠, 吳正景, 吳祖峰, 李冬升, 杜小紅, 胡燦麗, 金祥利, 高文 申請人:河南科技大學