專利名稱：快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，具體涉及一種通過授粉后藥物誘導(dǎo)快速、大量獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法。
背景技術(shù)：
花生是世界五種最重要的油料作物之一。品種間雜交迄今仍是花生育種的主要方法，但因花生栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄，要通過這一方法育成突破性的品種已越來越難。越來越多的花生育種工作者認(rèn)識到，花生野生種尤其是花生區(qū)組以外的不親和野生種遺傳多樣性程度顯著高于栽培種，富含抗性、優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)遺傳因子，應(yīng)該在花生育種中加以利用?；ㄉ鷧^(qū)組野生種容易與栽培種雜交獲得有生活力的雜種。花生區(qū)組以外的野生種則與栽培種雜交不親和，受精延遲、受精率低，雖然多數(shù)情況下可產(chǎn)生果針并形成莢果，但胚在早期敗育，最終只能形成有敗育種子遺跡的空果，要利用這些野生種必須借助特殊的技術(shù)手段。授粉后激素涂抹進(jìn)而進(jìn)行胚和胚珠培養(yǎng)是國際半干旱熱帶作物研究所采用的行之有效的獲得花生區(qū)組間雜種的方法。山東省花生研究所分子育種組通過果針離體培養(yǎng)技術(shù)成功獲得了栽培種與光葉野生種Arachisglabrata的種間雜種,并在國內(nèi)外育成第一個(gè)花生區(qū)組間雜交品種-花育31號。但上述方法均需要冗長繁瑣的組織培養(yǎng)步驟，育種上迫切需要簡便易行獲得花生不親和雜種的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)效果能夠彌補(bǔ)現(xiàn)行的獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種方法中需要繁瑣復(fù)雜組織培養(yǎng)步驟的缺點(diǎn)，提供一種快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，其在田間就可操作且能夠高效獲得大量種間雜種。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案其包括如下步驟(I)配制激素混合溶液；(2)收集不親和花生野生種花粉，授與花生栽培種母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培種母本花基部；(4)對收獲種子進(jìn)行分子鑒定。本發(fā)明的內(nèi)容是在花生植株開花時(shí)期，不親和野生種花粉授與栽培種母本后，使用一種激素混合溶液處理花器官，使莢果和種子能夠正常發(fā)育，從而收獲種間雜種種子。步驟(I)中激素混合溶液的配比為吲哚乙酸0.2-5mg/L、赤霉素0.5-6mg/L、 6-芐基氨基嘌呤0_4mg/L，其余為無菌去離子水。步驟(3)中用脫脂棉蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培種母本花基部。步驟(4)中分子鑒定包括如下步驟(A)收獲種子后，取花生子葉組織薄片，快速提取待測樣品DNA作為PCR模板；(B)用分子標(biāo)記方法對提取的模板進(jìn)行鑒定，若與父本有相同的特征帶，則為真雜種，否則就是假雜種。本發(fā)明的提供一種快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，其在田間就可操作且能夠高效獲得大量種間雜種，省去了冗長繁瑣的組織培養(yǎng)步驟，可簡便易行獲得花生不親和雜種。


圖I為栽培種大花生QYlOl X不親和野生種A. paraguariensis PI 331187雜交組合從母木本上收獲的種子，上排和中排為真雜種，下排為假雜種；圖2利用FAD2A AS-PCR法對區(qū)組間雜種進(jìn)行真實(shí)性鑒定部分結(jié)果示意圖。圖中M DNA marker ;AP、QY :父本 QYlOl 和母本 A. paraguariensis PI331187 ；T 真雜種；F :假雜種；箭頭所指為父本特征帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明的方法包括如下步驟(I)配制含卩引哚乙酸2mg/L、赤霉素2mg/L、6_節(jié)基氨基嘌呤2mg/L、其余為無菌去離子水的激素混合液。(2)收集不親和花生野生種花粉，授與花生栽培種母本，授粉過程同常規(guī)。(3)用脫脂棉蘸取激素混合溶液，敷于已授粉栽培種母本花基部。(4)收獲種子后，取花生子葉組織薄片，采用“花生健康組織和病組織簡便快速 DNA提取方法”(專利號=200910255786. O)快速提取待測樣品DNA作為PCR模板。(5)采用“花生Λ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法”(專利申請?zhí)?201110058563. 2，已公開)或其他分子標(biāo)記鑒定方法對提取的模板進(jìn)行鑒定，如與父本有相同的特征帶，則為真雜種，否則就是假雜種。我們用本技術(shù)的方法做了多個(gè)不親和野生種與栽培種的雜交組合，經(jīng)分子鑒定均已收獲到真實(shí)雜種。以栽培種大花生QYlOl XA. paraguariensis PI331187雜交組合為例，從母本上收獲的“雜交”種子連同雙親種子或葉片，采用“花生健康組織和病組織簡便快速DNA提取方法”(專利號=200910255786. O)所述方法非破壞性地快速提取花生種子 DNA或提取葉片DNA。采用“花生△ 12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法”(專利申請?zhí)?201110058563. 2，已公開)中所述對FAD2A準(zhǔn)確進(jìn)行基因分型的AS-PCR方法，證實(shí)了母本 QYlOl與父本A. paraguariensis PI 331187FAD2A基因分別為突變型和野生型。以此為鑒定依據(jù)，如“雜交”種子模板擴(kuò)增得到與父本相同的特征帶就是真雜種，否則是假雜種。共檢測了 42粒從母本上收獲的套有果針的種子(如圖I)，從中鑒定出26粒真雜種(圖I上排和中排為真雜種，下排為假雜種)。圖2為分子鑒定的部分結(jié)果。實(shí)施例2本發(fā)明的方法包括如下步驟(I)配制含吲哚乙酸4mg/L、赤霉素2mg/L、其余為無菌去離子水的激素混合液。(2)收集不親和花生野生種花粉，授與花生栽培種母本，授粉過程同常規(guī)。(3)用脫脂棉蘸取激素混合溶液，敷于已授粉栽培種母本花基部。
(4)收獲種子后，取花生子葉組織薄片，采用“花生健康組織和病組織簡便快速 DNA提取方法”(專利號=200910255786. O)快速提取待測樣品DNA作為PCR模板。(5)采用“花生Λ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法”(專利申請?zhí)?201110058563. 2，已公開)或其他分子標(biāo)記鑒定方法對提取的模板進(jìn)行鑒定，如與父本有相同的特征帶，則為真雜種，否則就是假雜種。我們用本技術(shù)的方法做了多個(gè)不親和野生種與栽培種的雜交組合，經(jīng)分子鑒定均已收獲到真實(shí)雜種。以栽培種大花生QYlOl XA. paraguariensis PI331187雜交組合為例，從母本上收獲的“雜交”種子連同雙親種子或葉片，采用“花生健康組織和病組織簡便快速DNA提取方法”(專利號=200910255786. O)所述方法非破壞性地快速提取花生種子 DNA或提取葉片DNA。采用“花生△ 12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法”(專利申請?zhí)?201110058563. 2，已公開)中所述對FAD2A準(zhǔn)確進(jìn)行基因分型的AS-PCR方法，證實(shí)了母本 QYlOl與父本A. paraguariensis PI 331187 FAD2A基因分別為突變型和野生型。以此為鑒定依據(jù)，如“雜交”種子模板擴(kuò)增得到與父本相同的特征帶就是真雜種，否則是假雜種。共檢測了 42粒從母本上收獲的套有果針的種子(如圖I)，從中鑒定出26粒真雜種(圖I上排和中排為真雜種，下排為假雜種)。圖2為分子鑒定的部分結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)配制激素混合溶液；(2)收集不親和花生野生種花粉，授與花生栽培種母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培種母本花基部；(4)對收獲種子進(jìn)行分子鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，其特征在于，步驟⑴中激素混合溶液的配比為卩引哚乙酸O. 2-5mg/L、赤霉素O. 5-6mg/L、6-芐基氨基嘌呤0-4mg/L,其余為無菌去離子水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法， 其特征在于，步驟(3)中用脫脂棉蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培種母本花基部。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，其特征在于，步驟(4)中分子鑒定包括如下步驟(A)收獲種子后，取花生子葉組織薄片，快速提取待測樣品DNA作為PCR模板；(B)用分子標(biāo)記方法對提取的模板進(jìn)行鑒定，若與父本有相同的特征帶，則為真雜種， 否則就是假雜種。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，具體涉及一種通過授粉后藥物誘導(dǎo)快速、大量獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法。本發(fā)明的快速獲得花生不親和野生種與栽培種種間雜種的方法，包括如下步驟(1)配制激素混合溶液；(2)收集不親和花生野生種花粉，授與花生栽培種母本；(3)蘸取激素混合液，敷于已授粉栽培種母本花基部；(4)對收獲種子進(jìn)行分子鑒定。其在田間就可操作且能夠高效獲得大量種間雜種，省去了冗長繁瑣的組織培養(yǎng)步驟，可簡便易行獲得花生不親和雜種。
文檔編號A01H1/02GK102577930SQ201210058618
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者于洪濤, 鳳桐, 吳琪, 唐月異, 唐榮華, 崔鳳高, 王傳堂, 王秀貞, 禹山林, 胡東青, 陳殿緒, 高華援 申請人:山東省花生研究所