專利名稱：一種棉花抗旱相關(guān)基因GbMYB5的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花抗旱相關(guān)基因GbMYB5，同時(shí)涉及GbMYB5基因在提高煙草抗旱能力中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
MYB類轉(zhuǎn)錄因子屬于帶色氨酸簇的轉(zhuǎn)錄因子家族，含有一段保守的DNA結(jié)合區(qū)(DBD) MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，DBD區(qū)一般包含1_3個(gè)不完全重復(fù)序列(R)，每個(gè)重復(fù)片段含有51-53個(gè)氨基酸，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。這些高度保守的氨基酸殘基使得MYB區(qū)以成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的形式與DNA大溝結(jié)合，這3個(gè)殘基間隔18-19個(gè)氨基酸，起疏水核心作用，對(duì)維持MYB的HTH構(gòu)型有重要意義。根據(jù)重復(fù)片段R的個(gè)數(shù)，可以將MYB類轉(zhuǎn)錄因子分為單一 MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R1/R2)、2R蛋白(R2R3)以及3R蛋白(R1R2R3)。Stracke等發(fā)現(xiàn)擬南芥中還存在4RMYB基因。近年來對(duì)MYB類轉(zhuǎn)錄因子的研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物發(fā)育和代謝的各個(gè)方面。組合調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，主要通過多種轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用來實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的精密調(diào)控。MYB類轉(zhuǎn)錄因子與其它轉(zhuǎn)錄因子家族成員通過組合調(diào)控的方式來調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成、次生代謝，并對(duì)外界環(huán)境刺激、激素誘導(dǎo)及病蟲害等做出應(yīng)答反應(yīng)。在植物應(yīng)答生物脅迫及非生物脅迫時(shí)，MYB基因的表達(dá)起重要作用。MYB基因被證實(shí)參與植物抗干旱脅迫、高鹽脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、UV輻射等，如厚葉旋蒴苣苔的BcMYBl能對(duì)PEG(干旱)、高鹽、低溫等脅迫產(chǎn)生一定程度的應(yīng)答，擬南芥的AtMYB2及AtMYB60參與植物抗旱，水稻0smyb4高量表達(dá)能提高植物對(duì)干旱、高鹽、UV輻射的耐受性。擬南芥中，MYB5基因是R2R3MYB基因家族的成員。植物中R2R3MYB蛋白是一個(gè)龐大的家族，其功能也非常多樣。僅在擬南芥基因組中就至少有135個(gè)基因是編碼R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的，而且其功能大部分是與調(diào)控細(xì)胞死亡、苯丙烷類代謝途徑、色氨酸合成途徑和抗旱等相關(guān)的。因此，這類基因具有比較廣泛的研究和應(yīng)用前景。植物受病原菌侵染后，引發(fā)細(xì)胞程序化死亡，即過敏性反應(yīng)(Hypersensitiveresponse, HR)，水楊酸(SA)在其中扮演重要角色，擬南芥中分離出的AtMyb30是R2R3MYB基因家族的成員，它能在HR早期瞬時(shí)表達(dá)的一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，該基因的過量表達(dá)及抑制實(shí)驗(yàn)證明，AtMYB30能夠參與SA的合成，從而調(diào)控細(xì)胞死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，世界范圍內(nèi)適于耕種的土地面積占陸地總面積的10%左右，而大部分陸地面積則處于干旱、鹽堿、沼澤等逆境下。隨著人口老齡化的加劇以及環(huán)境的不斷惡化，培育出適合在逆境環(huán)境下生長的作物勢(shì)在必行。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控多個(gè)與同類性狀有關(guān)的基因，可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子來達(dá)到植物抗逆性的綜合性改變，因此應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子提高植物的抗逆性已成為近年的研究熱點(diǎn)。棉花作為世界上最重要的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，從棉花中分離克隆出MYB轉(zhuǎn)錄因子有利于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和解析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于非生物脅迫等的調(diào)控機(jī)制，也有利于棉花品質(zhì)改良和耐受性研究工作的進(jìn)一步開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)來源于棉花的與抗旱相關(guān)的MYB型轉(zhuǎn)錄因子。本發(fā)明利用陸地棉MaxxaBAC文庫中所獲得的一個(gè)BAC克隆進(jìn)行測(cè)序分析過程中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的MYB類轉(zhuǎn)錄因子，并設(shè)計(jì)特異引物從海島棉品種H7124中克隆出GbMYB5，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，該基因共編碼277個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示，屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明蛋白還包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可以從海島棉中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成的方法得到。將發(fā)明基因與表達(dá)載體連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組載體，進(jìn)而可以通過諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因方法，將所表述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)GbMYB5基因的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明通過將外源GbMYB5基因整合到煙草基因組，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力增強(qiáng)，其生長未受到干旱脅迫的顯著影響。表明GbMYB5可用于提高煙草對(duì)干旱脅迫的抗性。本發(fā)明的提供了所述棉花基因GbMYB5在煙草品種選育中的應(yīng)用。提供了所述棉花基因GbMYB5在提高煙草抗旱能力中的應(yīng)用。


圖I :GbMYB5基因在棉花不同部位表達(dá)的RT-PCR分析。圖2 GbMYB5基因在非生物脅迫下表達(dá)分析。圖3:煙草的遺傳轉(zhuǎn)化A.愈傷組織培養(yǎng)；B.篩選培養(yǎng)；C.生根培養(yǎng)；D.再生植株。圖4 :再生煙草的PCR檢測(cè)I =Marker DS 2000 2-21 :再生煙草PCR結(jié)果。圖5 :轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測(cè)I :Marker DS 2000 2_15 :轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR結(jié)果。圖6 :卡那霉素篩選轉(zhuǎn)基因煙草。圖7 :25 % PEG6000模擬干旱下葉片生長狀況。圖8 :2 % PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱下植株生長狀況。圖9 :2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱前，植株的生長狀況。圖10 2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱2周后，植株的生長狀況。圖11 :2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱3周后，植株的生長狀況。圖12 :2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱3周后，植株的生長情況(去除培養(yǎng)基)。圖13 :2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱4周后，植株的生長情況。圖14 :2% PEG6000培養(yǎng)基模擬干旱4周后，植株的生長情況(去除培養(yǎng)基)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。I.本發(fā)明所用的生物材料海島棉(Gossypiumbarbadense) 7124、煙草(Nicotiana tabacum) K326 (CharlesS. Johnson, Jeremy A. Pattison, Elizabeth M. Clevinger et al. Clarifying the sourceof black shank resistance in flue-cured Tobacco. Plant Health Progress.Doi 10. 1094/PHP-2008-0618-02-RS)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞型(ZHANGJian, XU Jin-Xiang, KONG Ying-Zhen et al. Generation of chemical-inducibleactivation tagging insertion lines of Arabidopsis thaliana. Acta GeneticaSinica. 2005,32(10) : 1082-1088)、植物表達(dá)載體pCAMBIA2301 (Peter Hajdukiewicz，ZoraSvab,Pal Maliga. The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectorsfor plant transformation. Plant Molecular Biology. 1994,25:989-994)以及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404購自寶生物工程(大連)有限公司。BAC克隆購自 Clemson University Genomics Institute。2. GbMYB5基因的克隆根據(jù)獲得的BAC克隆中含有MYB結(jié)構(gòu)域的序列設(shè)計(jì)特異引物BamMYB19 :5; ACTGGATCCACATGGGTCGAGCTCCTTGCTGT3' (SEQ ID NO. 3),KpnMYBl122 5/ TCCAGGTACCTTGTCTCTTGCTACATAGGGTAACC3' (SEQ ID NO. 4)。引物分別添加 BamH I 和 Kpn I 酶切位點(diǎn)。CTAB 法提取海島棉 RNA,用 TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix (北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)制備cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，引物BamMYB19和KpnMYBl 122，PCR擴(kuò)增GbMYB5基因，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘，94 °C變性30秒，59 °C退火50秒，72°C延伸I分20秒，共36個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。電泳檢測(cè)得到I. IKb大小的PCR產(chǎn)物片段，將此PCR產(chǎn)物純化后克隆到pEASY-T3載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，構(gòu)建中間載體T-GbMYB5，測(cè)序工作由上海英駿生物有限公司完成。測(cè)序結(jié)果表明，該外源片段全長為1105bp，有一個(gè)長為832bp的開放式閱讀框，編碼277個(gè)氨基酸，命名為GbMYB5，在GenBank的登錄號(hào)為JF820389。經(jīng)與NCBI上注冊(cè)登錄的基因進(jìn)行BLAST分析，GbMYB5基因與模式植物擬南芥(登錄號(hào)AAC83600)和櫓豆MYB71(登錄號(hào)ABH02912)的同源基因相似性在51 %左右，是新基因。3.GbMYB5基因在不同組織中的表達(dá)根據(jù)海島棉GbMYB5基因全長序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物 MYBFrt :5 ' AGGCTTCTAATGGAAACCCTAACC3 ' (SEQ ID NO.5), MYBRrt 5' TCCATTGGTTGAAGAACAGAAGT3' (SEQ ID NO. 6)。分別提取海島棉 7124 的莖、葉、蕾、絮和未成熟種子的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定RT-PCR條件。以海島棉cDNA為模板，MYBFrt, MYBRrt為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，GbMYB5基因在這些器官均有表達(dá)，但在營養(yǎng)器官的表達(dá)量明顯高于生殖器官的表達(dá)量，尤以在葉子中的表達(dá)最高，其次在莖中也有較高的表達(dá)量，而在絮和蕾中僅有輕微的表達(dá)(見圖1，其中Histone為對(duì)照)。
4. GbMYB5基因在不同脅迫處理下的表達(dá)分析海島棉脫絨種子直接播種于營養(yǎng)土，待幼苗長至2 3片真葉時(shí)，分別對(duì)幼苗進(jìn)行重金屬、干旱、脫落酸和赤霉酸誘導(dǎo)處理。重金屬處理用5ml的IOuM的CuSO4溶液直接噴灑棉株；干旱處理用5ml濃度為20%的PEG6000澆灌棉株；脫落酸(ABA)處理用5ml的15mg/L的ABA溶液直接噴灑植株；赤霉酸(GA)處理用5ml的IOppm的赤霉酸溶液直接噴灑棉株。以上所有處理時(shí)間一致，分別取處理后24h、48h和未誘導(dǎo)的植物葉片(CK)，迅速置于液氮中，_70°C存放備提取總RNA用。在重金屬(CuSO4)處理后，GbMYB5基因表達(dá)量與對(duì)照相比明顯下降，但在處理48h后，表達(dá)量比對(duì)照略有上升。PEG模擬干旱處理下，GbMYB5基因表達(dá)在24h時(shí)稍有提高，在48h時(shí)急速增加。ABA和GA激素誘導(dǎo)處理在24h內(nèi)可顯著提高GbMYB5基因的表達(dá)，但隨時(shí)間推移，GbMYB5對(duì)兩者的響應(yīng)不同，ABA處理48h后，GbMYB5基因表達(dá)量還維持在24h時(shí)的高水平，而GA處理48h后，GbMYB5基因表達(dá)量迅速下降。這表明GbMYB5基因?qū)χ亟饘佟⒏珊?、ABA和GA誘導(dǎo)均有響應(yīng)，可能與植物抗逆有關(guān)(見圖2，其中Histone為對(duì)照)。5.重組載體的構(gòu)建以及煙草轉(zhuǎn)化用BamH I和Kpn I酶切中間載體T_GbMYB5，得到I. I. Kb大小的目的片段，與經(jīng)同 樣雙酶切處理后的PCAMBIA2301質(zhì)粒連接，獲得重組表達(dá)載體pCAMBIA2301_GbMYB5，采用凍融法將pCAMBIA2301-GbMYB5轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后保存?zhèn)溆?。本?shí)驗(yàn)采用葉盤共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化煙草。侵染將消毒好的外植體煙草葉片剪成Icm2大小，置于含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404/pCAMBIA2301-Gb (OD6tltl = O. 3-0. 4)浸染液中浸泡5_6min,然后用滅菌后的濾紙吸干。共培養(yǎng)于MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗處理48h。篩選培養(yǎng)48h后將浸染的葉片轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素和利福平的篩選培養(yǎng)基上。繼代培養(yǎng)每隔IOd左右換一次培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)篩選出生根苗，將篩選出的生根幼苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。移栽生根苗長2-3周時(shí)，煉苗后移栽至土壤中。所用培養(yǎng)基見下表。表煙草轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在煙草品種選育中的應(yīng)用。
2.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在提高煙草抗旱能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物抗旱相關(guān)的棉花GbMYB5基因，同時(shí)涉及GbMYB5基因在提高煙草抗旱能力中的應(yīng)用。本發(fā)明棉花抗旱基因GbMYB5具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。該轉(zhuǎn)錄因子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO.2；2)將序列表中SEQIDNO.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一或幾個(gè)氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有調(diào)控植物抗旱性功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锟购敌詸C(jī)制的研究，以及提高植物的抗旱性狀的改良具有重要的理論和實(shí)際意義，將在植物的抗旱基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102643830SQ201210077310
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者周璐, 張保龍, 楊郁文, 胡雪虹, 郭佳茹, 陳天子, 馬飛 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)