專利名稱：棉花Ghexp基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種棉花膨脹素Ghexp基因，本發(fā)明基因?qū)M南芥植株的葉片腺毛具有明顯的促進作用，且轉(zhuǎn)基因植株葉片氣孔密度增加。
背景技術(shù)：
植物腺毛是一種存在于植物體表的一種特化的突起結(jié)構(gòu)，其形態(tài)多樣，功能各異。(I)有的腺毛可以分泌次生代謝物質(zhì)，如青蒿素、棉酚等。次生代謝產(chǎn)物有的具有藥用價值，有的可對害蟲有忌避和毒殺作用。植物次生代謝產(chǎn)物含量高低與其貯藏器官(比如腺體、腺毛等)的有無及多少關(guān)系十分密切。腺毛是青蒿素轉(zhuǎn)移和積累的主要貯藏器官，通常以腺毛指數(shù)作為青蒿素含量的表征。唇形科的很多香料植物含有揮發(fā)性油，其揮發(fā)性油的產(chǎn)生與分泌則與腺毛的分布、類型及其結(jié)構(gòu)等有著直接的聯(lián)系。有研究表明，腺毛的分布密度越大、處于分泌時期的數(shù)量越多，其分泌能力就越強。(2)有的腺毛不分泌物質(zhì)，但可以阻礙草
食動物的侵害，如擬南芥。腺毛可作為次生代謝產(chǎn)物貯存的器官，也可保護植物免受昆蟲、病原體的侵害，防止機械損傷及其后激變，有利于植物適應(yīng)不良環(huán)境。如能從分子水平上提高腺毛的含量，則可增加次生代謝產(chǎn)物的含量，提高藥用成分，并對增加植物的抗逆性有極大的幫助。植物的氣孔是植物體與外界進行氣體交換的重要通道，其開張度與氣孔導(dǎo)度直接影響植物的光合作用和蒸騰作用，氣孔調(diào)節(jié)是水分脅迫下植物抵御干旱和適應(yīng)環(huán)境的機制之一。氣孔的分布特征、密度和面積等受到環(huán)境水分狀況的影響。小而密的氣孔同時也具有較高的靈活性，因此有利于植物保持體內(nèi)水分和保證有效的呼吸作用，是植物適應(yīng)旱生環(huán)境的表現(xiàn)。如能從分子水平上調(diào)節(jié)氣孔的數(shù)量，則可增加植物的抗旱性，提高適應(yīng)不良環(huán)境的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于獲得一種從突變體湘棉18中克隆的Ghexp基因，及其在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。從而使植物的腺毛發(fā)達，或者氣孔密度增加適應(yīng)不良環(huán)境的能力提高。一種棉花Ghexp基因包含一個開放閱讀框，其核苷酸序列為SEQ ID NOl0該基因已注冊于GenBank，登陸號為JN255197。一種重組質(zhì)粒p3301_Ghexp的序列中含有SEQ ID N01。上述重組質(zhì)粒p3301_Ghexp在培育Ghexp基因過表達的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。一種培育Ghexp基因過表達的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟
I)種植需要腺毛發(fā)達或氣孔密度增加的植物。2)制備含重組質(zhì)粒p3301_Ghexp的單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌液 a)構(gòu)建權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒p3301-Ghexp ；b)制備農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)；
c)將步驟a)中的重組質(zhì)粒和步驟b中的農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)按體積比1:20混勻，YEB培養(yǎng)基，28 °C搖培3 4h，得到單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌液。3)將步驟I)處于花期中植物的花序浸入步驟2)獲得的菌液中，浸染3 5min ；暗處培養(yǎng)24 h后恢復(fù)光照，培養(yǎng)植株至成熟，得到Ttl代種子；種植Ttl代種子，挑選潮霉素抗性植株，培養(yǎng)成熟得到T1代種子；種植T1代種子，挑選潮霉素抗性植株，培養(yǎng)成熟得到T2代種子；種植T2代種子，挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系，獲得純合T3代種子，及轉(zhuǎn)基因植物。步驟I)中所述植物為次生代謝產(chǎn)物存于腺毛中的藥用植物。本發(fā)明還提供了含有上述基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株組成型過量表達該基因的轉(zhuǎn)基因純系植株。該植株比野生型根毛長，體表腺毛更多，葉片氣孔密度增加。 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明克隆了一個促進腺毛生長的Ghexp基因，該基因可增加擬南芥植物體表腺毛數(shù)目及長度，并提高葉片氣孔密度。將該基因進行轉(zhuǎn)基因，對能產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的植株可增加次生代謝產(chǎn)物的含量，提高藥用成分，并對提高植物的抗逆性有極大的幫助。


圖I是Ghexp基因的PCR擴增結(jié)果 圖2是Ghexp基因在不同時期的表達量變化示意 圖3是Ghexp基因在T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥中的PCR鑒定結(jié)果 圖4是野生型擬南芥與轉(zhuǎn)基因擬南芥根長比較 圖5是本發(fā)明T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥莖腺毛 圖6是本發(fā)明野生型擬南芥莖腺毛 圖7是本發(fā)明T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉腺毛 圖8是本發(fā)明野生型擬南芥葉腺毛 圖9是本發(fā)明T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片腺毛電鏡 圖10是本發(fā)明野生型擬南芥葉片腺毛電鏡 圖11是本發(fā)明T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片氣孔電鏡 圖12是本發(fā)明野生型擬南芥葉片氣孔電鏡圖。
具體實施例方式實施例I Ghexp基因全長cDNA序列的克降和序列測定
根據(jù)黃瓜基因序列(NCBI No. AC007292. I)，利用Premier 5. O軟件設(shè)計基因特異性引物，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物5' -AAGCTTGAACGGTGCGGACGT-3 ;，下游引物5 ; -GAATTCCTGATATAGATAGTCA-3 ;。Ghexp基因克隆湘棉18種子萌發(fā)至2-3cm，提取總RNA。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照TaKaRa公司的RNA PCR試劑盒的使用說明。以cDNA單鏈為模板，反應(yīng)條件95°C，5 min，I次循環(huán)；(92°C 30s, 53°C 30s, 72°C2min)30次循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。經(jīng)質(zhì)量濃度I %瓊脂糖電泳后，見圖I。回收目的片段并連接PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E. coliDH5 α，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定正確后送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果見SEQ ID Nol0利用上述引物PCR擴增得到包含有Ghexp基因的基因片段，用該基因編碼一個217個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),包含一個Rare lipoprotein A (稀有脂質(zhì)A)和Pollenallergen (花粉變應(yīng)原蛋白)的結(jié)合域。實施例2 Ghexp基因的表達量分析
I、材料分別取湘棉18腺毛形成前和腺毛形成后的胚軸，胚根，子葉作為提取材料。2、Trizol 法提取總 RNA I)將上述材料分別放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末。2)待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2mL的離心管中，每IOOmg材料約加入ImL的Invitrogen公司的TRizol提取液，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘。3)加入O. 2mL氯仿(chloroform),劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘。4)4。。，12000rpm 離心 15 分鐘。5)用移液器吸出上層水相，加入到I. 5mL的新離心管中，再在該離心管中加入500 μ L的異丙醇，水相與異丙醇的體積比為1: 1，將兩者充分混勻，在_20°C下，沉淀30min。6)在4°C , 12000rpm的轉(zhuǎn)速下離心IOmin,棄去上清液。7)用ImL的75%乙醇洗滌RNA沉淀，在4°C，8000rpm的轉(zhuǎn)速下離心lOmin，收集沉淀。8)重復(fù)用75%乙醇洗滌一次RNA沉淀。9)去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入30 50 μ L的RNase-free水充分溶解(可放于-80°C長期保存)。10)用紫外分光光度法及l(fā)%Agr0Se凝膠電泳檢測RNA濃度及質(zhì)量。a)用紫外分光光度計檢測RNA的產(chǎn)量，在260nm處的吸光度，根據(jù)在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度。b)用l%Agrose凝膠電泳檢側(cè)RNA的質(zhì)量及大小，吸取上述I μ L RNA加入3 μ L的RNase-free /K，加I μ L上樣緩沖液65°C變性5分鐘，電泳后用EB染色，另取3 μ L的2kbDNAMarker作為對照。3、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)cDNA的合成
根據(jù)內(nèi)參18srRNA的擴增情況確定PCR的循環(huán)數(shù)，調(diào)整cDNA模板的加入量，進行定量PCR，結(jié)果見附圖2，表明Ghexp基因在胚軸表達最多，其次是胚根，表達量最小的是子葉。棉花腺體形成前的Ghexp基因的表達比腺體形成后少。表明腺體的形成與Ghexp基因有密切的聯(lián)系。ISsrRNA 的引物為
上游引物5 ; -TCGTAGTTGGACTTAGGGTGGG-3 ;，
下游引物5 ' -CAAATGCTTTCGCAGTTGTTCG-3 ;。實施例3轉(zhuǎn)基因功能驗證一擬南芥轉(zhuǎn)化、篩選及表型分析
I、擬南芥的種植
將野生型擬南芥種子用5%次氯酸鈉溶液(包括5%次氯酸鈉和0. 01% Triton-XlOO)消毒10分鐘，然后用無菌水漂洗3 4次，點播于1/2 MS平板，于4°C春化2_3天，然后移植到營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土與娃石按等比例混合)，在25°C培養(yǎng),16/8 h光周期,光強35 μ mo I · πΓ2 · s_1;待植株開花后,進行轉(zhuǎn)基因操作。2、擬南芥轉(zhuǎn)化
I)重組質(zhì)粒p3301-Ghexp的構(gòu)建
將經(jīng)PCR擴增后的Ghexp基因片段和經(jīng)雙酶切膠回收的p3301質(zhì)粒DNA，在16°C下連接過夜，轉(zhuǎn)化E. coli DH5ci，在含卡那霉素的瓊脂平板上篩選陽性菌落，從平板上挑取單克隆酶切驗證，正確的即為重組質(zhì)粒p3301-Ghexp。2)農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)制備
將-80°C保存的農(nóng)桿菌GV3101菌液解凍，劃線接菌于YEB固體培養(yǎng)基。挑取農(nóng)桿菌GV3101單克隆，接種于5mL YEB液體培養(yǎng)基中，28°C、200r/mim培養(yǎng)過夜；取2mL培養(yǎng)基于 50M1 YEB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，直至0D600為O. 5左右；4°C、5000r/min、離心5min，棄去上清液；用IOmL冷的20mmol/L CaCl2懸浮菌液,冰浴30min ;4°C、5000r/min,離心5min,棄去上清液；用ImL冷的CaCl2 (20mmol/L)懸浮，分裝成100 μ L /管，每管中加入IOOuL預(yù)冷的40%甘油，液氮中速凍后至-80°C保存。得到農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)。3)表達載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
將10 4 1^重組質(zhì)粒？3301-61^^ DNA加入200 4 1^農(nóng)桿菌6￥3101細(xì)胞感受態(tài)中，混勻。冰浴30min，液氮冷凍3 5min，37°C水浴5min。加入I mL YEB培養(yǎng)基，28 °C搖培3 4h。lOOOOrpm，室溫離心30s，棄上清，加入200 mL YEB培養(yǎng)基重懸菌體，涂于YEB培養(yǎng)基，28 °C培養(yǎng)2天。提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA進行PCR驗證。得到含重組質(zhì)粒p3301_Ghexp的單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌液。4)轉(zhuǎn) Ghexp 基因
具體轉(zhuǎn)化過程是挑取活化的含重組質(zhì)粒p3301-Ghexp的單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌株至5mL新鮮YEB液體培養(yǎng)基中，28°C搖培24h，得菌液。取上述菌液0. ImL接至50mL新鮮YEB液體培養(yǎng)基，28 °C 220rpm培養(yǎng)2 4h，使OD值達到0. 8左右。把50 mL菌液倒入盤中，將擬南芥倒扣并使所有花序浸入懸浮菌液中，浸染3 5min。輕輕甩掉浸液，用保鮮袋包裹以保濕，做好標(biāo)記。將托盤置暗處培養(yǎng)24 h，然后取出營養(yǎng)缽并直立放置，恢復(fù)光照，繼續(xù)培養(yǎng)植株至成熟。獲得Ttl代種子。T0代種子用5%次氯酸鈉溶液(包括5%次氯酸鈉和0. 01%Triton-X100)消毒后，點播在MS選擇培養(yǎng)板(30mg/L潮霉素)上，于4°C下春化2 3天，10天左右，挑選潮霉素抗性植株(長出真葉I 2對，根伸長至培養(yǎng)基中)并移栽到營養(yǎng)缽中，培養(yǎng)直至種子成熟得到T1代種子，采用同樣的方法種植T1代種子，挑選潮霉素抗性植株，培養(yǎng)直至種子成熟得到T2代種子，采用同樣的方法種植T2代種子，得到T2代植株，并在T2代植物中挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系，并獲得純合T3代株系進行轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測和表型鑒定。4、轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
提取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA，以其為模板，用特異引物PCR擴增，其中 上游引物5 ; -TAACTTTGCCCTCCTAACTATGCT-3 ;，
下游引物5 ' -TTTGCCAATTTGCAGGTGCCACGTT-3 ;PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45sec，58°C復(fù)性45sec，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，72°C延伸7min，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測。擴增片段長度為408bp鑒定結(jié)果見圖3，表明擬南芥植株中存在Ghexp基因。5、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型鑒定
擬南芥的種植將野生型擬南芥種子和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別用5%次氯酸鈉溶液(包括5%次氯酸鈉和O. 01% Triton-XlOO)消毒10分鐘，然后用無菌水漂洗3 4次，點播于1/2 MS平板，于4°C春化2 3天，在錐形瓶中培養(yǎng)至20天。在25°C培養(yǎng)，16/8 h光周期，光強35μηιο1 ·πΓ2 s—1;另分別取一部分春化后移植到營養(yǎng)缽中(營養(yǎng)土與娃石按等比例混合)，在25°C培養(yǎng)，16/8 h光周期，光強35 μ mo I · πΓ2 · s'表型觀察取在錐形瓶中的植株進行比較，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株的根長明顯，野生型對照植株的根長較短(附圖4)。取在營養(yǎng)缽中的植株第一輪葉的葉片進行比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片上腺毛數(shù)目增加，表皮細(xì)胞較野生型而言更多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)數(shù)目增 多(附圖5，6，9，10)，第一輪葉的葉片以上的莖進行比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的擬南芥腺毛數(shù)量有所增加(附圖7，8)。且說明本發(fā)明的Ghexp基因?qū)M南芥主根及腺毛具有促進生長的功能。通過轉(zhuǎn)Ghexp基因，植物的腺毛增加，也即次生代謝產(chǎn)物的器官數(shù)目增加，可直接促進次生代謝產(chǎn)物含量的提高，對開發(fā)和利用植物資源具有重大意義。上述轉(zhuǎn)基因植物的方法還可用于次生代謝產(chǎn)物存于腺毛中的藥用植物。從而提高腺毛的數(shù)量，則有望增加次生代謝產(chǎn)物的含量，提高藥用成分。如青蒿等。在轉(zhuǎn)基因Ghexp植株中，發(fā)現(xiàn)表皮上氣孔增多，野生型相對較少，見圖11，12，a表示保衛(wèi)細(xì)胞形成的氣孔。轉(zhuǎn)基因植株中氣孔密度大，但氣孔相對野生型而言較小。葉片氣孔密度上升，可提高干旱環(huán)境的適應(yīng)性。以上所舉實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點進行了進一步的詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所舉實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)對本發(fā)明所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。文獻
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權(quán)利要求
1.一種棉花Ghexp基因，其特征是該基因的核苷酸序列為SEQ ID NOl0
2.—種重組質(zhì)粒p3301-Ghexp，其特征是它的序列中含有SEQ ID NOl0
3.權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒p3301-GheXp在培育Ghexp基因過表達的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
4.一種培育Ghexp基因過表達的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟 1)種植需要腺毛發(fā)達或氣孔密度增加的植物； 2)制備含重組質(zhì)粒p3301-GheXp的單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌液 a)構(gòu)建權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒p3301-Ghexp； b)制備農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)； c)將步驟a)中的重組質(zhì)粒和步驟b中的農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞感受態(tài)按體積比1:20混勻，YEB培養(yǎng)基，28 °C搖培3 4h，得到單克隆陽性農(nóng)桿菌GV3101菌液； 3)將步驟I)處于花期中植物的花序浸入步驟2)獲得的菌液中，浸染3 5min;暗處培養(yǎng)24 h后恢復(fù)光照，培養(yǎng)植株至成熟，得到Ttl代種子；種植Ttl代種子，挑選潮霉素抗性植株，培養(yǎng)成熟得到T1代種子；種植T1代種子，挑選潮霉素抗性植株，培養(yǎng)成熟得到T2代種子；種植T2代種子，挑選抗性比為3:1的單插入獨立株系，獲得純合T3代種子，及轉(zhuǎn)基因植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征是步驟I)中所述植物為次生代謝產(chǎn)物存于腺毛中的藥用植物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及棉花膨脹素基因Ghexp及其在轉(zhuǎn)基因植物培育中的應(yīng)用。棉花膨脹素基因Ghexp核苷酸序列為SEQIDNo1。本發(fā)明的有益效果在于，克隆了棉花膨脹素基因Ghexp，并通過根癌膿桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，與野生型擬南芥植株相比，本發(fā)明的Ghexp基因的轉(zhuǎn)基因可明顯促進擬南芥植株的葉片、莖干的腺毛增多及增長，同時增加葉片的氣孔密度。根據(jù)本發(fā)明，可利用基因工程方法培育轉(zhuǎn)Ghexp基因植物，增加有關(guān)植株表皮毛數(shù)目，增加葉片的氣孔密度，從而增加植株的次生代謝產(chǎn)物含量或阻礙草食動物的侵害，還可以提高植株對不良環(huán)境的適應(yīng)性。
文檔編號A01H5/00GK102925452SQ201210099099
公開日2013年2月13日 申請日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者謝永芳, 梁亦龍, 曾垂省, 蔡應(yīng)繁, 向瀏欣 申請人:重慶郵電大學(xué)