專利名稱：4×Tβ4基因以及在煙草中表達4×Tβ4蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種融合基因、其表達載體及在植物中表達融合蛋白的方法，具體涉及一種4XT0 4基因、其表達載體以及在煙草中表達4XTP 4融合蛋白的方法。
背景技術：
研究表明胸腺肽P 4 (thymosin P 4, T P 4)是真核生物細胞中的一種重要的G-actin螯合因子(G-actin sequestering factor),有許多重要生理學和細胞學功能(Goldstein等.分子醫(yī)學進展，2005，11 :421-429)，包括促進細胞遷移、血管形成、細胞存活、干細胞分化、調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子、特殊蛋白酶、上調(diào)細胞質(zhì)分子的基因表達和下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子基因表達(Huff等.2001，生物化學和細胞生物學國際期刊，33 :205-220)。在皮膚疾病、眼角膜疾病、心臟病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肺病臨床和應用中有著重要的作用。目前科學研究和醫(yī)用的TP 4的來源主要有兩種一是從小牛胸腺提取，二是化學合成。從小牛胸腺中提取T3 4不僅成本高，且受材料來源和提取技術的限制，其純度不高，含量較低；同時由于人畜共患疾病，從動物牛胸腺中提取的T P 4在臨床應用存在風險。T P 4化學合成技術的成本高，因此也限制了該方法的應用。隨著基因工程的發(fā)展，利用基因工程手段生產(chǎn)T ^ 4成為可能，也將成為一個新的方向。基因工程手段生產(chǎn)重組T P 4蛋白，可以克服生物原材料提取率低或化學合成成本高的缺點。文獻《生物化學與生物物理學報，2002，34 (4) :502_505》用大腸桿菌克隆表達了Te 4，其表達水平達菌體總蛋白30%，但其純化步驟較為復雜，分別經(jīng)過了硫酸銨鹽析、SourceRPC反相柱層析和Q Sepharose HP陰離子交換柱來純化目的蛋白。文獻《東南大學學報(醫(yī)學版)，2007，26 (4) :295-298》研究了在大腸桿菌中高效表達6XHis-TP4，融合蛋白產(chǎn)量達菌體總蛋白的40%，表達產(chǎn)物經(jīng)過一步鎳柱親和層析即可獲得分離純化。文獻《第四軍醫(yī)大學學報，2008，29 (16) :1451-1454》選用真核分泌型表達載體Psec Tag2B，并采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術瞬時轉(zhuǎn)染真核SW480細胞,采用Western blot法檢測TP 4重組蛋白的表達，實現(xiàn)在真核細胞中表達。植物是外源蛋白高效表達和可實現(xiàn)靶蛋白正確修飾的高級表達系統(tǒng)，用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)TP 4具有易規(guī)?；?、低成本和安全特點?，F(xiàn)有技術尚未有用植物系統(tǒng)表達4XT P 4的相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種4XT P 4基因、其表達載體、4XT@ 4融合蛋白以及在煙草中表達4XT@ 4融合蛋白的方法。將人工合成的T3 4基因在體外完成串聯(lián)形成四聯(lián)體即4XTP4，并且利用基因工程方法在4XTP4基因添加His6-tag。通過構建植物表達載體，再采用基因工程方法轉(zhuǎn)化到煙草，在植物中表達6XHis-4XTP 4融合蛋白，該蛋白在皮膚和眼角膜傷口治愈和修復方面具有重要的生物活性和功能。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)
一種4 X T 4基因，其喊基序列如SEQ ID NO. 2所不。一種重組載體，包括目的基因和載體，所述目的基因的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示，所述載體選自質(zhì)粒、粘?；?、噬菌體中的一種。一種如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID N O. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有促細胞增殖活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。一種在煙草系統(tǒng)中表達4XTP4功能蛋白的方法，該方法包括以下步驟步驟(一)、依據(jù)現(xiàn)有技術中TP 4多肽的一級結構，按植物偏愛密碼子，同時考慮到載體構建和目標基因TP 4融合而引入相應的限制性內(nèi)切酶位點，設計合成TP 4基因的核苷酸序列(168bp)；步驟(二)、通過兩次酶切和連接，實現(xiàn)所述4XTP 4(588bp)的融合；步驟(三)、通過設計PCR引物在所述4XTP4基因中引入His6_tag，獲得含有His6-tag的基因6 X His-4X T P 4 (619bp)，連接到T載體中，然后通過酶切與連接將所述基因6 XHis-4XT P 4克隆到植物表達載體中，通過測序或酶切鑒定，在確保所述表達載體目的基因閱讀框架正確前提下，將所述表達載體用凍融法導入根癌農(nóng)桿菌中，獲得攜帶所述基因6XHis-4XTP4的根癌農(nóng)桿菌；步驟(四)、將煙草種子表面滅菌后播種于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長2周的無菌煙草葉片作為外植體用于轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌；步驟(五)、提取4XT34功能蛋白。優(yōu)選的，在所述步驟(四)中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟步驟(I)，將所述含有目的基因表達載體的根癌農(nóng)桿菌于28°C搖菌培養(yǎng)至0D_為0. 8 I. 0,室溫6000rpm離心5 8分鐘；步驟(2)，棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入所述外植體浸泡8 10分鐘；步驟(3)，將浸染結束后的所述外植體取出，吸去表面殘余菌液，然后將所述外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上在25°C共培養(yǎng)36小時；步驟(4)，共培養(yǎng)結束后將所述外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 28°C光照下培養(yǎng)至分化芽長出；步驟(5)，當所述分化芽長至3-4厘米時，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)7 10天；步驟(6)，所述分化芽形成完整根系后，將植株取出，用自來水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化并用質(zhì)量體積百分比為I %的MS粉水溶液補充營養(yǎng)和水分，7天后移入土中。優(yōu)選的，在所述步驟(五)中，所述提取包括以下步驟步驟(a)，取5g轉(zhuǎn)基因煙草葉片，在液氮中研成粉末，轉(zhuǎn)移至50mL聚丙烯離心管中，加入 5mL 預冷的 I X PBS (KH2PO4O. 2g/L, Na2HPO4L 15g/L, KCl 0. 2g/L, NaCl 8g/L)，懸浮后冰上放置2-3 ；步驟(b)，4°C條件下13000rpm離心30分鐘；
步驟(c)，收集上清于干凈離心管中保存；步驟(d),按照Bradford法進行蛋白定量分析，取2 ii L上述蛋白樣品加98 u LBradford試劑混勻后，在酶標儀下(Bio_TEK，USA)測OD595的吸光值。優(yōu)選的，所述發(fā)苗培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0.44%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%，余量為蒸餾水；所述發(fā)苗培養(yǎng)基的pH值為5. 8。優(yōu)選的，所述液體MS培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 22%、蔗糖為3 %，余量為蒸餾水；所述液體MS培養(yǎng)基的pH值為5. 8。優(yōu)選的，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0.44%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%,6-芐氨基嘌呤0. 0001 %、a -萘乙酸0. 00001%，余量為蒸餾水；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的PH值為5. 8。
優(yōu)選的，所述分化培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0.44%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%,6-芐氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%,羧芐青霉素0. 025%，余量為蒸餾水；所述分化培養(yǎng)基的pH值為5. 8。優(yōu)選的，所述生根培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0.22%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%,6-芐氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%,羧芐青霉素0. 025%，余量為蒸餾水；所述生根培養(yǎng)基的pH值為5.8。本發(fā)明提供了一種4XTP 4蛋白生產(chǎn)的新方法，本發(fā)明提供的方法按植物偏愛密碼子設計合成的6XHis-4XTP 4基因在煙草系統(tǒng)中表達融合蛋白，該蛋白在皮膚和眼角膜傷口的治愈和修復方面具有重要的生物活性和功能。本發(fā)明還提供了一種檢測、分析再生煙草基因組DNA樣品中是否存在6 XHis-4 X T P 4基因，蛋白樣品中是否含有6XHis-4XTP 4蛋白的研究方法。本發(fā)明提供的方法具有易規(guī)?；?、低成本和安全的特點。


圖I是轉(zhuǎn)基因煙草聚合酶鏈式反應(PCR)檢測結果圖；圖2是轉(zhuǎn)基因煙草DNA分子雜交(Southern blot)分析圖；圖3是實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(REAL TIME-PCR)檢測轉(zhuǎn)基因煙草中4XT 0 4基因轉(zhuǎn)錄水平的表達不意圖；圖4是轉(zhuǎn)6Xhis_4XTP4基因煙草總可溶蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖5是轉(zhuǎn)6Xhis_4XTP4基因煙草總可溶蛋白的免疫印跡(Western blot)分析圖；圖6是酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)檢測轉(zhuǎn)基因煙草6Xhis_4XT P 4蛋白水平表達量示意圖；圖7是轉(zhuǎn)基因煙草表達的4XTP 4蛋白的促淋巴細胞增殖及細胞活性測定(MTT)的結果圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例IT 0 4基因的合成及載體構建(I)基因合成本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設計合成的168bp的TP 4基因(包括保護堿基和酶切位點組成的接頭)，其序列如SEQ ID NO. I所示；合成之后連入pUC57載體，SPPUC57-T3 4。(2)4XT3 4 構建
根據(jù)Xba I和Spe I的同尾酶特點，通過兩次酶切和連接，將Xba I和Sac I酶切的小片段聯(lián)入由SpeI和SacI酶切的大片段中，實現(xiàn)4XTP 4(592bp)的融合，并命名為PUC57-4XT3 4。(3)植物表達載體構建用KOD plus 酶以 pUC57_4XT @ 4 質(zhì)粒為模板，用引物Tbeta4Fl (5 ' ggggatccatgcaccaccaccaccaccacggtaccatgtctagaatgtctga3 ' )和 Tbeta4Rl(5 ' ccgagctcttaactagtcataga 3 ')進行PCR擴增獲得帶6 X His編碼序列的目的融合基因6XHis-4XTM(619bp)，將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后連接至pMD18_T載體中，命名為pMD18-6XHis-4XTP 4，并通過測序確認；用BamHI 和 SacI 雙酶切質(zhì)粒 pMD18_6XHis_4XT P 4，回收 613bp 片段；用 BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒p2300-35S-hIGF，回收大片段；連接上述兩個片段并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，所得載體命名為P35S: :6XHis-4XTP4，用PCR方法檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，從而獲得陽性克隆。(4)植物表達載體p35S: :6XHis-4XT3 4的檢測隨機挑取抗性單菌落在含有相應抗生素(100mg/L Kan) LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌液達到一定濃度(0D_ = 0. 5 0. 8)后對目的基因進行PCR檢測；PCR 擴增體系 25 U L,包括引物 p35s (5' -ttc gtc aac atg gtg gag ca~3')和Noster (5' -aagacc ggc aac agg att ca~3')各 I U L (10 U mol/L)，0. 3 U L Taq DNA 聚合酶(5units/ ii L)，2. 5 ii L 的 10 X PCR 緩沖液，I. 5 y L 的 MgCl2 (25mmol/L) ,2u L 模板(待檢菌液)，I. 5 ii L的dNTPs (2. 5mmol/L), 15. 2 u L去離子無菌水，上覆20 u L滅菌石臘油；PCR 條件94 0C IOmin ；94 °C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 45min, 35 次循環(huán)；72 °C 延伸IOmin ;電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段長度為1140bp。實施例26XHis_4XTP4在煙草細胞中的表達I、含目的基因(4XTP4)表達載體的構建用BamHI和SacI雙酶切質(zhì)粒pMD18_4XTP 4，回收613bp片段獲得帶有His-tag并且有相應粘性末端的目的基因4XTP 4，然后將其克隆到植物表達載體pCAMBIA2300 (不限于此，也包括如PBI121或改造過的pCA2300-twin等植物表達載體)中，通過測序或酶切鑒定，在確保表達載體中的目的基因閱讀框架正確的前提下，再將表達載體質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草。2、煙草遺傳轉(zhuǎn)化將滅菌后的煙草種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周的煙草的無菌葉片，作為外植體用于轉(zhuǎn)化；將含有目的基因表達載體的工程菌于28°C搖菌培養(yǎng)至0D_ = 0. 8 I. 0時，室溫6000g離心5 8分鐘；
棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入準備好的外植體浸泡8 10分鐘；將浸染結束后的外植體取出，吸去表面殘余菌液；然后將外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上在25°C共培養(yǎng)36小時；共培養(yǎng)結束后將外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 28°C光照下培養(yǎng)，培養(yǎng)7 15天可見愈傷組織的形成，約20天后可見分化芽長出；待再生芽長至約3-4厘米時，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，7 10天左右生根；根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化并用質(zhì)量體積百分比為I %的MS粉水溶液補充營養(yǎng)和水分，一周后移入土中。3、轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測基因組DNA提取用CTAB法提取煙草基因組DNA (Stewart and Via，1993)，取50ng煙草基因組DNA作模板進行PCR檢測；PCR 擴增體系 25 U L,包括引物 P35s (5，-ttc gtc aac atg gtg gag ca_3’)和Noster (5，-aagacc ggc aac agg att ca_3，)各 I U L (10 U mol/L)各 I U L (10 U M/L)，0. 3u L Taq DNA 聚合酶(5units/y L)，2. 5 y L 的 10 X PCR 緩沖液，I. 5 y L 的 MgCl2 (25mmol/L), 2 u L 煙草基因組 DNA 模板(50ng), I. 5 y L 的 dNTPs (2. 5mmol/L), 15. 2 u L 去離子無菌水，上覆20 ii L滅菌石蠟油；PCR 條件-MV 8min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C lmin，35 次循環(huán);72°C延伸 8min ;電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段長度為1140bp ；PCR產(chǎn)物檢測用帶有 EB(ethidium bromide)的 1.0% (w/v)瓊脂糖膠在 IXTAE電泳緩沖液中電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)紫光下檢測并拍照，如圖I所示，其中，泳道M為DL2000DNA分子量標準；泳道P為含載體質(zhì)粒p35S: :6Xhis-4XT^4的農(nóng)桿菌EHA105作模板的陽性對照；泳道ck為非轉(zhuǎn)基因煙草的陰性對照；其它泳道為獨立的轉(zhuǎn)基因煙草植株1-15。4、轉(zhuǎn)基因煙草Southern blot分析(I)煙草基因組DNA提取和轉(zhuǎn)膜用CTAB 法提取煙草嫩葉基因組 DNA(Stewart and Via, 1993), Hin d III 酶切30 ii g煙草基因組DNA，I %瓊脂糖膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜上(AmershamPharmacia, Uppsala, Sweden)。(2)探針標記、雜交和信號檢測以質(zhì)粒P35S:: 6 X Hi s-4 X T 3 4為模版擴增得到含4 X T 3 4基因DNA片段，用于探針標記；探針標記、雜交和信號檢測使用Gene Images Random Primer Labeling method和 CDP-Star detection module 試劑盒(Amersham Pharmacia),按其操作說明書指導進行。在55°C雜交12小時后，用洗膜液I(1XSSC和0. 1% SDS)在62 °C下洗雜交膜2次(各15分鐘)，然后用洗膜液II (0.5X SSC和0. 1% SDS)在55°C下洗雜交膜I次(15分鐘)；滴加顯色液后將雜交膜置于富士 X-光片上暴光2-3小時檢測雜交信號，如圖2所示，其中，左側(cè)數(shù)字是與酶切基因組DNA共分離的入/Hind III的DNA分子量標準；泳道P為p35S::6Xhis-4XT^4質(zhì)粒作模板的陽性對照；泳道ck為非轉(zhuǎn)基因煙草植株；I、2、3、4、5、7、8為獨立的轉(zhuǎn)基因煙草植株。5、通過熒光定量 PCR(Real-Time Quantitative PCR, RT-QPCR)檢測6XHis-4XTP4在轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量⑴RNA提取按植物抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，上海)廠家說明抽提煙草葉片總RNA, RNA模板預先用DNase I (RNase-free, TaKaRa)處理以去除來自于煙草基因組DNA的污染。(2)反轉(zhuǎn)錄反應制備cDNA按TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)(寶生物工程(大連)有限公司)廠家說明進行煙草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄體系10 V- L,包括2 V- L的5XPrimeScript Buffer(forreal time), 0. 5 u L 的 PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1,0. 5 u L 的 Random 6 mers (100 u M),
0.5 u L 的 Oligo dT Primer (5OmM) ,lug 的總 RNA,用 RNase Free ddH20 補足到 10 u L,反應液需要在冰上配制；所需的反轉(zhuǎn)錄反應條件為37°C, 15min(反轉(zhuǎn)錄反應)；85°C, 5s (反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應)。(3)標準曲線的制作將轉(zhuǎn)基因煙草葉片組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA，取2 ii L用EASY Dilution (TaKaRaCode D9160, Shiga, Japan)分別稀釋成(單位ng/ u L) :50,5,0. 5,0. 05,0. 005 的濃度各取 2 ii L 作為模板，在 Peltier Thermal Cycler PTC200PCR 儀(BioRed, Watford, UK)上進行反應。PCR反應液組份體系25 u L，包括12. 5 ii L的SYBR PremixEx Taq (2X), I ii L的PCR Forward Primer (10 U M), I u L 的 PCR Reverse Primer (10 U M), 2 u L 的 cDNA,用 RNaseFree ddH20補足到25 u L，反應液的配制需要在冰上進行；PCR反應條件如下95°C變性20s ;95°C變性15s，58°C退火15s，72°C延伸25s，重復27個循環(huán)；最后70-95°C延伸10s。反應結束后確認Real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，制作標準曲線。(4)用qRT-PCR檢測6XHis_4XT0 4在轉(zhuǎn)基因煙草中轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量以cDNA為模板，按照標準曲線，采用確定的穩(wěn)定反應體系和最適的稀釋倍數(shù)，一般采用cDNA稀釋100倍后作為模板。以目的基因基因引物Tbeta4Fl (5' ggggatccatgcaccaccaccaccaccacggtaccatgtctagaatgtctga3')和Tbeta4Rl(5' ccgagctcttaactagtcataga 3')以及內(nèi)源基因泛素(ubiquitin)的引物 UbiF (5aagacctacaccaagcccaa3 ')和UbiR(5; aagtgagcccacacttacca3')作為Real-time PCR的引物,按照標準曲線制作方法配制PCR反應液，反應條件和融解曲線條件不變進行Real-time PCR,每個實驗組做6個平行。實驗結束后，將數(shù)據(jù)導出，采用Ct比較法用Microsoft Office Excel計算目的基因在組織中的相對表達量。轉(zhuǎn)基因煙草中4XTP4基因轉(zhuǎn)錄水平的表達結果如圖3所示，其中
1、2、3、4、5、7、8為獨立的轉(zhuǎn)基因煙草植株。6、用western blot檢測6XHis_4XTP 4蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的表達(I)蛋白提取(冰浴中進行)
取5g煙草葉片，在加有液氮的研缽中研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)移至50mL聚丙烯離心管中，并加入 5mL 預冷的 I XPBS (KH2PO4O. 2g/L, Na2HPO4115g/L, KCl 0. 2g/L, NaC18g/L)，懸浮后冰上放置2-3h ；13000rpm 4°C 離心 30 分鐘；收集上清于另一新離心管中備用。(2)蛋白定量 按照Bradford 法(Bradford, 1976),取 2 U L 蛋白樣品加 98 U L Bradford 試劑混勻后，在酶標儀下(Bio-TEK，USA)測OD595的吸光值。(3) SDS-PAGE 分離蛋白樣品中加入等體積的含50mM DTT加樣緩沖液(2 X加樣緩沖液甘油2. 4g，IMTris-HCl pH6. 81mL,溴酚蘭0. 01 %，H2O定容至20mL)，沸水浴10分鐘后置于冰上，冷卻后上樣；4°C冰箱中在100V電壓下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達到凝膠底部；聚丙烯酰胺凝膠，其中一塊用于考馬斯亮蘭(W:v = 2.5%)染色，另一塊用于Westernblot分析。轉(zhuǎn)6 Xhis_4X T P 4基因煙草總可溶蛋白SDS-PAGE電泳結果如圖4所示，其中泳道M為蛋白分子量標準；泳道ck為源自非轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總可溶蛋白；其它泳道源自轉(zhuǎn)基因煙草株系1，2，3，4，5，6，7總可溶蛋白；泳道+為用大腸桿菌表達的6Xhis-4XTP4蛋白；左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標準。(4)蛋白質(zhì)向PVDF膜上轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mM甘氨酸，48mM Tris Base，0. 037% SDS，20%甲醇)平衡凝膠和PVDF膜30分鐘；室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移Ih,凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙。(5) PVDF膜蛋白檢測將PVDF膜浸在封閉液中，37 °C緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于IOOmL的1父？85(含0.58疊氮鈉))；再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37°C洗滌2次，每次15分鐘；加入第一抗體(抗his-tag的抗體)，37°C溫育30分鐘，洗滌3次，洗滌方法同上所述；加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復合物)，37°C溫育30分鐘，洗滌兩次，洗滌方法同上所述；加入底物顯色觀察蛋白條帶，免疫印跡分析的結果如圖5所示，其中泳道M為蛋白分子量標準；泳道ck為源自非轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總可溶蛋白；其它泳道源自轉(zhuǎn)基因煙草株系1，2，3，4，5，6，7總可溶蛋白；泳道+為用大腸桿菌表達的6Xhis-4XTP4蛋白；左側(cè)的數(shù)據(jù)為蛋白分子量大小標準。7、轉(zhuǎn)6XHis_4XTP 4基因煙草的ELISA分析采用ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因煙草葉片中6XHis-4XTP 4蛋白的含量，具體操作方法如下(I)包被包被酶標板(聚苯乙烯板)時，酶標板每孔加入75 ii L包被液，25 ii L蛋白質(zhì)提取液，37°C溫 育過夜后，傾盡各孔的液體；(2)洗板用TPBS緩沖液150 y L洗漆3次，每次5min。TPBS緩沖液需37°C預熱，最后一次拍干孔內(nèi)液體；(3)封閉每孔加封閉液IOOii L，37°C溫育I 2h ;(4)洗滌用TPBS緩沖液150 y L洗漆3次，每次5min ；(5)與第一抗體反應每孔分別加入IOOii L的第一抗體(小鼠抗his-tag單克隆抗體，I 10000)，37°C溫育 I. 5 2h ;(6)洗滌用TPBS緩沖液150 y L洗漆3次，每次5min ；(7)與第二抗體反應每孔分別加入IOOii L第二抗體(山羊抗小鼠抗體-AP，I 5000)，37°C溫育 I. 5 2h ;(8)洗滌用TPBS緩沖液150 y L洗漆3次，每次5min ；(9)顯色每孔加顯色劑IOOii L，37°C溫育IOmin ；(10)測定吸光值用酶標儀測定410nm的光吸收值。ELISA檢測轉(zhuǎn)基因煙草6Xhis-4XTP4蛋白水平表達量的結果如圖6所示，其中1、2、3、4、5、7、8為獨立的轉(zhuǎn)基因煙草植株。8、煙草表達的4XTP4蛋白的生物活性檢測用MTT法檢測煙草表達的4 X T M蛋白的生物活性(Mosmann，T. (1983)J. Immunol. Methods 65,55-63)。具體操作步驟如下(I)用PBS法提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶蛋白，經(jīng)濾膜(Millipore，0. 45 u m)除菌后，用1父？85將濃度調(diào)整至0.51^/1^;(2)將Balb/c小鼠浸入到乙醚中，取出后用大頭釘固定在無菌平板上，用無菌剪刀、鑷子剪開腹部皮膚，打開腹腔，取出脾臟；(3)將脾臟放在200目的銅網(wǎng)上，充分研磨，一邊研磨一邊用含有RPMI1640(完全)培養(yǎng)基沖洗；(4) IOOOrpm 離心 IOmin,棄上清；(5)細胞沉淀用2mL紅細胞裂解液懸浮，吹打5min左右使其充分裂解，加入8mLGKN 緩沖液(NaCl 8g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 2H20 I. 77g, NaH2PO4 H2O 0. 69g,葡萄糖 2g,酚紅0. Olg，溶于1000ml雙蒸水中)終止反應；(6) IOOOrpm 離心 IOmin,棄上清；(7)沉淀中加入RPMI1640培養(yǎng)基IOmL，洗兩次；(8)用RPMI1640培養(yǎng)基IOmL懸浮，顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度為IO5個/mL ；(9)按照IO5個/mL細胞密度加在96孔板上培養(yǎng)；(10)反應體系試驗設空白對照組(I X PBS)、陽性對照組(TM蛋白，購自上海吉爾生化)、提取不同轉(zhuǎn)基因煙草株系果實的蛋白作為樣品組、以未轉(zhuǎn)基因煙草蛋白為陰性對照組。在含有淋巴細胞的96孔培養(yǎng)板中加入標準的陽性蛋白TP 4(1. Oii g) IOOii L和過濾滅菌后的轉(zhuǎn)基因煙草蛋白樣品和未轉(zhuǎn)基因煙草蛋白樣品各lOOyL，對照孔加入IXPBS100 u L，每個實驗組設5個重復；(11)輕輕混勻后，置5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)24h ；
(12)在無菌條件下向每孔加MTT(5mg/mL母液)溶液10 y L，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；(13)在倒置顯微鏡(Olympus CKX31，Japan)下定期地觀察96孔板細胞，當有清晰可見的紫色沉淀產(chǎn)生時，每一孔中加入150 ii L的DMSO (dimethyl sulfoxide),隨后輕輕地搖動96孔板，并將96孔板在室溫下(黑暗)放置15分鐘；(14)在酶標儀(Bio-TEK，USA)讀OD57tl的吸光值，以樣品劑量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。(15)依據(jù)所測定的OD57tl值，利用公式計算促細胞增殖率。促細胞增值率(％ ) = (0D y；驗-OD對照)/OD y；驗 轉(zhuǎn)基因煙草的4XTP4蛋白生物活性的MTT檢測結果如圖7所示，其中，4XT ^ 4 (tobacco)為轉(zhuǎn)6Xhis_4XT P 4煙草葉片總可溶性蛋白的促淋巴細胞增值率；TM(GLBiochem)為購于上海吉爾生化的T @ 4的促淋巴細胞增值率；CK為非轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶性蛋白促淋巴細胞增值率。實驗結果顯示轉(zhuǎn)6Xhis-4XTP4煙草葉片總可溶性蛋白的促淋巴細胞增值率為28. 59%，購于上海吉爾生化的TP 4的促淋巴細胞增值率為
8.49%，非轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶性蛋白促淋巴細胞增值率為O。結果表明通過煙草表達的6Xhis-4XTP 4蛋白對小鼠脾臟淋巴細胞具有明顯的促進增殖的生物學作用。
權利要求
1.一種4XTP 4基因，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.—種重組載體，包括目的基因和載體，其特征在于，所述目的基因的堿基序列如SEQID NO. 2所示,所述載體選自質(zhì)粒、粘粒或\噬菌體中的一種。
4.一種在煙草系統(tǒng)中表達4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 步驟一，將含有權利要求I所述4XT P 4基因的克隆載體質(zhì)粒進行酶切，回收所述.4X T P 4基因的DNA片段，獲得帶有相應粘性末端的所述4 X T P 4基因，然后將所述帶有相應粘性末端的4XTP 4基因克隆到煙草表達載體中，通過測序或酶切鑒定，在確保所述表達載體中的所述目的基因4XTP 4的閱讀框架正確的前提下，再將所述表達載體用凍融法導入根癌農(nóng)桿菌中，獲得攜帶所述目的基因4XTP4的根癌農(nóng)桿菌； 步驟二，將滅菌后的煙草種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周的無菌葉片，作為外植體用于轉(zhuǎn)化所述根癌農(nóng)桿菌； 步驟三，提取4XT@4功能蛋白。
5.根據(jù)權利要求4所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述轉(zhuǎn)化包括以下具體步驟 步驟I，將所述含有目的基因表達載體的根癌農(nóng)桿菌于28°C搖菌培養(yǎng)至0D_為0. 8 I.0,室溫6000rpm離心5 8分鐘； 步驟2，棄上清，菌體用液體MS培養(yǎng)基重懸，然后加入所述外植體浸泡8 10分鐘； 步驟3，將浸染結束后的所述外植體取出，吸去表面殘余菌液，然后將所述外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上在25°C共培養(yǎng)36小時； 步驟4，共培養(yǎng)結束后將所述外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25 28°C光照下培養(yǎng)至分化芽長出； 步驟5，當所述分化芽長至3-4厘米時，將其切下移植到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng).7 10天； 步驟6，所述分化芽形成完整根系后，將植株取出，用自來水洗去附著在根系上的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化并用質(zhì)量體積百分比為I %的MS粉水溶液補充營養(yǎng)和水分，7天后移入土中。
6.根據(jù)權利要求4或5所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述發(fā)苗培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠.0. 26%，余量為蒸餾水；所述發(fā)苗培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
7.根據(jù)權利要求5所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，所述液體MS培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 22%、蔗糖為3%，余量為蒸餾水；所述液體MS培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
8.根據(jù)權利要求5所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XTP 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠.0. 26%、6-芐氨基嘌呤0. 0001%、a -萘乙酸0. 00001 %，余量為蒸餾水；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.8。
9.根據(jù)權利要求5所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XTP4功能蛋白的方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 44%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%,6-芐氨基嘌呤0. 0001%, a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%、羧芐青霉素0. 025%,余量為蒸餾水；所述分化培養(yǎng)基的PH值為5. 8。
10.根據(jù)權利要求5所述的在煙草系統(tǒng)中表達4XT P 4功能蛋白的方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基的組分及各組分的質(zhì)量百分比為MS粉0. 22%、蔗糖3%、煙草凝膠0. 26%,6-芐氨基嘌呤0. 0001 %、a -萘乙酸0. 00001 %、卡那霉素0. 005%、羧芐青霉素0. 025%，余量為蒸餾水；所述生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種4×Tβ4基因以及在煙草中表達4×Tβ4蛋白的方法，該基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，該方法包括如下步驟將含有融合基因4×Tβ4的克隆載體質(zhì)粒進行酶切，回收目標DNA片段，獲得帶有相應的粘性末端的目的基因4×Tβ4，然后將其克隆到煙草表達載體中，通過測序或酶切鑒定，在確保表達載體中的目的基因閱讀框架正確的前提下，再將表達載體質(zhì)粒用凍融法導入農(nóng)桿菌中，獲得工程菌；將滅菌后的煙草種子播于發(fā)苗培養(yǎng)基上，取生長兩周的無菌葉片，作為外植體進行轉(zhuǎn)化；提取4×Tβ4功能蛋白。本發(fā)明提供的融合蛋白4×Tβ4在皮膚和眼角膜傷口治愈和修復方面具有重要的生物活性和功能。
文檔編號A01H5/00GK102643827SQ20121010327
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月10日 優(yōu)先權日2012年4月10日
發(fā)明者李善爽, 楊桂華, 王曉磊, 趙凌俠, 高美鳳 申請人:上海交通大學