專利名稱：一種火把梨耐干旱基因Pp14-3-3及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種火把梨耐干旱基因/^及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)以及基工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著全球性的氣候異常和生態(tài)平衡的破壞，土地日趨沙漠化和鹽堿化，水資源短缺成為全人類面臨的嚴(yán)重生態(tài)問題。我國是ー個人口大國，糧食問題始終是關(guān)系國家安全、社會穩(wěn)定的重大戰(zhàn)略問題，與其它自然災(zāi)害相比，旱災(zāi)是影響我國糧食生產(chǎn)的主要因素，因 為旱災(zāi)造成的糧食損失占全部自然災(zāi)害糧食損失的一半以上。據(jù)統(tǒng)計分析，我國受旱面積50年代為I. 7億多畝，90年代年均3. 64億畝，因干旱損失糧食50年代年均43. 5億公斤，90年代為195. 7億公斤。干旱始終困擾著我國經(jīng)濟、社會的發(fā)展，特別是農(nóng)業(yè)的發(fā)展。干旱對植物造成傷害的機理比較復(fù)雜，最直接的傷害是使植物細胞脫水、破壞細胞結(jié)構(gòu)、造成機械傷害，從而導(dǎo)致細胞死亡(Mahajan S，Tuteja N. Cold, salinity anddrougnt stresses: An overview. Arch Biocnem Biophys, 2005, 444: 139 158)。干旱脅迫除了造成直接傷害，還能引起一系列間接傷害，如抑制光合作用系統(tǒng)II的活性，光合作用系統(tǒng)II活性的下降使電子的產(chǎn)生和利用失衡，產(chǎn)生的活性氧會破壞細胞的膜脂結(jié)構(gòu)、DNA和其他生物大分子，這也是干旱對植物造成間接破壞的主要原因(Pehzer D, Dreyer E,Polle A. Differential temperature dependencies of antioxidative enzymes in twocontrasting species: Fagus sylvatica and Coleus blumei. Plant Physiol Biochem，2002, 40: 14廣150)。植物在長期的自然選擇中形成了滲透調(diào)節(jié)、減少活性氧傷害、增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等一些列有效的抵御干旱脅迫的機制(邵艷軍，山侖.植物耐旱機制研究進展.中國農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)報，2006，14(4): 16 20)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子、激酶等脅迫相關(guān)蛋白參與逆境脅迫應(yīng)答的信號通路。14-3-3蛋白做為ー種信號調(diào)控因子，已被證實廣泛參與植物對干旱等非生物脅迫的應(yīng)答(Roberts MR, Salinas J, Collinge DB. 14-3-3proteins and the response to abiotic and biotic stress. Plant Mol Biol, 2002,50:1031 1039)。14-3-3蛋白是ー類在真核生物中起重要作用且結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白，廣泛分布于真核生物中，與多種蛋白結(jié)合并相互作用，參與調(diào)控細胞內(nèi)的生命代謝過程。植物中的14-3-3 可分為 e 和非 e 兩大類,擬南芥(Arabidopsis thaliana) ii、3i、i、o、e 類14-3-3蛋白屬于e大類，K、入、V、V、u、o、(Kx屬于非e大類(Ferl RJ, ManakMS, Reyes MF. The 14_3_3s. Genome Biol, 2002, 3(7): reviews 3010. I 3010. 7)。14-3-3為酸性可溶性蛋白，単體分子量在27-32kDa之間，主要以同源或異源ニ聚體形式存在(Ferl RJ, Manak MS, Reyes MF. The 14_3_3s. Genome Biol, 2002, 3(7): reviews3010. r3010. 7)。14-3-3蛋白通過蛋白相互作用以及結(jié)合靶蛋白的磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸來實現(xiàn)其功能，目前已發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白參與細胞生長分化、細胞周期和凋亡的調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和遷移等多種生理過程(van Hemert MJ, Steensma HY, van Heusden GP. 14-3-3proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. Bioessays,2001，23(10) : 936^946) 0近年來多個植物#-基因被分離出來。研究表明植物14-3-3與能量代謝的關(guān)鍵酶結(jié)合，從而調(diào)控能量代謝過程，如14-3-3蛋白通過調(diào)節(jié)硝酸還原酶(WeinerH， Kaiser WM. 14—3—3 proteins control proteolysis of nitrate reauctase inspinach leaves. FEBS Lett, 1999，455: 75 78)、鹿糖憐酸合酶、海藻糖-6憐酸合酶(Toroser D, Athwal GSj Huber SC. Site-specific regulatory interaction betweenspinach leaf sucrose—phosphate synthase and 14-^-3 proteins. FEBb Lett, 1998，435(1): 110 114)、甘油三磷酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶(Moorhead G, Douglas P，しotelle V， et al. Phosphorylation-dependent interactions between enzymes oiplant metabolism and 14-3-3 proteins. Plant J，1999，18(1): I 12)等碳、氮代謝 關(guān)鍵酶的活性從而參與植物碳、氮代謝途徑。14-3-3蛋白還能結(jié)合質(zhì)膜H+-ATPase來控制物質(zhì)的跨膜運輸過程(Olsson A, Svennelid F，Ek B，et al. A phosphothreonineresidue at the し-terminal end of the plasma membrane H -ATPase is protected byfusi cocc in-induced 14-3-3 binding. Plant Physiol, 1998，118(2): 551 555) 研究發(fā)現(xiàn)，在大麥Q(jìng)tordeum distichum.)種子吸漲后被誘導(dǎo)表達，暗示14-3-3參與大麥的種子萌發(fā)(Testerink C，van der Meulen RMj Oppedijk BJj et al. Differences inspatial expression between 14-3-3 isoforms in germinating barley embryos. PlantPhysiol, 1999，121(1) : 8廣87)。14-3-3還能通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)控細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，14-3-3 能結(jié)合玉米 mays) (de Vetten NCj Lu G, Feri RJ. A maize proteinassociated with the Ij-dox binding complex has homology to brain regulatoryproteins. Plant Cell, 1992，4(10) : 1295 1307)和擬南芥(Lu G，DeLisle AJjde Vetten NCj et al. Brain proteins in plants: an Arabidopsis homolog toneurotransmitter pathway activators is part of a DNA binding complex. Proc NatlAcad Sci USA, 1992，89(23) : 11490^11494)的 G_box 復(fù)合體，此外，TFIIB、TBP2、VP1、EmBPl、RSG (repression of shoot growth)等多種轉(zhuǎn)錄因子均為14-3-3蛋白的革巴蛋白(Schultz TFj Medina J， Hill A， et al. 14-3-3 proteins are part of an abscisicacid-VIVIPAROUSl (VPl) response complex in the Em promoter and interact withVPl and EmBPI. Plant Cell, 1998，10(5) : 837 847)。14-3-3廣泛參與植物對逆境脅迫應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。擬南芥的2個14-3-3基因和ガ的表達能被低溫脅迫所調(diào)控(arillo JAj Capel J, LeyvaA, et al. I'wo related low-temperature-mducible genes of Arabidopsis encodeproteins showing high homology to 14—3—3 proteins, a family of putative kinaseregulators. Plant Mol Biol, 1994，25(4): 693-704);擬南芥 14-3-3 同エ蛋白能結(jié)合并激活脅迫反應(yīng)的重要蛋白-I丐依賴蛋白激酶(CPK-I) (Camoni L, Harper JFj PalmgrenMG. 14-3-3 proteins activate a plant calcium-dependent protein kinase (CDPK).FEBS Lett, 1998，430(3): 381 384)。鹽脅迫下，煙草如c" )和玉米14-3-3基因表達量上調(diào)，表明14-3-3受鹽脅迫誘導(dǎo)，將番煎(Lycopersicon esculentum)
基因(77T7)轉(zhuǎn)入擬南芥中表達，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥相對于非轉(zhuǎn)基因擬南芥型有較高的種子萌發(fā)率、干重和較長的根長，暗示14-3-3過表達能提高擬南芥對鹽脅迫的抵手幾會E力(Xu WFj Shi WM. Mecnanisms of salt tolerance in transgenic Arabidopsisthaliana constitutiveIy overexpressing the tomato 14—3—3 protein TFT7. PlantSoil, 2007，301:17 28)。14-3-3同樣能被干旱脅迫誘導(dǎo)表達，經(jīng)1%聚乙ニ醇(PEG)處理過的棉花{Gossypium hirsutum L.),其根部和葉中6種14_3_3基因家族成員的表達量均上調(diào)，其中根部最高上調(diào)了 10. 8倍，在葉中最高上調(diào)了 3. 8倍(Sun G, Xie F，ZhangB. Transcriptome-wiae identmcation and stress properties of the 14—J—3 genefamily in cotton {Gossypium hirsutum L.). Funct Integr Genom, 2011, 11(4):627飛36)。轉(zhuǎn)入擬南芥基因ス的棉花較野生型對干旱脅迫具有更高的抗 性，并表現(xiàn)“常緑”的表型(Yan J, He C，Wang J, Mao Z, et al. Overexpression ofthe Arabidopsis 14-J-3 protein GF14 lambda in cotton leads to a stay-greenphenotype and improves stress tolerance under moderate drought conditions.Plant Cell Physiol, 2004, 45(8): 1007 1014)。通過干旱處理檢測轉(zhuǎn)入玉米#-基因(み 的水稻{Oryza sativa)和非轉(zhuǎn)基因水稻的耐干旱能力，在停止灌溉18天后姨ZmGF14-6水稻表現(xiàn)出良好的生長態(tài)勢，脅迫停止后，經(jīng)過7天的正常灌溉，所有轉(zhuǎn)み 水稻能恢復(fù)正常生長,而非轉(zhuǎn)基因水稻只有小部分能恢復(fù)生長(Campo S，Peris-Peris C， Montesmos L, Penas G, et al). Expression of the maize ZmGFlzI-Ogene in rice confers tolerance to drought stress while enhancing susceptibilityto pathogen infection. J Exp Bot, 2012, 63(2): 983 999)。上述研究結(jié)果表明 14-3-3蛋白在植物抵御干旱脅迫中起重要作用。本發(fā)明的耐干旱基因/^是從云南本地的砂梨品種火把梨中克隆得到，云南火把梨不僅具有穩(wěn)定遺傳的紅色果皮表型，而且對生物脅迫和非生物脅迫的抗性均較強，抗黑星病和腐爛病，抗晚霜、耐低溫，對梨木虱也有較強的抗性。此外，火把梨對土壤適應(yīng)性也很強。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種火把梨耐干旱基因/^具體是從云南火把梨(Pyrus pyrifolia)中獲得ー個新的耐干旱基因/^該基因具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，編碼14-3-3蛋白。本發(fā)明中/^基因的編碼區(qū)是SEQ ID NO 1中所述第85-870位所示的核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的是將火把梨耐干旱基因/^ 核苷酸序列應(yīng)用在提高植物耐干旱脅迫中，將基因/^構(gòu)建到植物表達載體上并導(dǎo)入煙草中表達，對獲得的PP14-3-3轉(zhuǎn)基因煙草進行干旱脅迫處理，確認(rèn)具有耐干旱脅迫的活性，為后期利用該基因改良煙草以及其他植物耐干旱能力奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明分離克隆云南火把梨中攜帯的ー個抗逆境脅迫相關(guān)基因的完整cDNA片段，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)使目的基因轉(zhuǎn)入受體植物中并過量表達，進而通過實驗驗證該基因在植物抗逆過程中所起的作用，為后期利用該基因改良煙草以及其他植物抗逆能力奠定基礎(chǔ)，增強煙草和其他植物對干旱的抗性。本發(fā)明將這個基因命名為作
具有該基因片段的植物在一定程度上具有耐干旱脅迫的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID所示。對該基因進行序列分析，表明/^全長cDNA為1107 bp，具有786bp的開放閱讀框(ORF)、84bp的5，非翻譯區(qū)和237bp的3，非翻譯區(qū)，編碼含有261個氨基酸的蛋白質(zhì)。作#-編碼蛋白具有14-3-3家族的保守結(jié)構(gòu)域，與來自蘋果_usc/o膨sti.ca)ヽ龍眼iPimocarpus longan)和棉花以及其他物種的14_3_3蛋白高度相似,結(jié)構(gòu)域分析顯示該序列包含2個14-3-3典型結(jié)構(gòu)域，分別位于第48 - 58和220-239氨基酸殘基處。生物信息學(xué)分析表明本發(fā)明克隆基因編碼的蛋白質(zhì)屬于火把梨中的14-3-3蛋白。超量表達序列表SEQ ID所示序列可以增強煙草對干旱脅迫的抗性。本發(fā)明通過如下具體技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明目的
(I)基因的獲得以火把梨紅色果皮為材料，提取果皮的總RNA，利用RT-PCR (reversetranscription-polymerase chain reaction)擴增到的基因序列，然后將其連接到pMD-18T載體上，經(jīng)測序獲得具有目的基因的克隆。(2)植物表達載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化用限制性內(nèi)切酶及 H I和^boR I酶切pMD-18T-/^7￥-J-J載體，通過膠回收獲得目的基因片段。用同樣的內(nèi)切酶消化植物表達載體pCAMBIA2300s，膠回收獲得載體大片段。將目的基因片段與pCAMBIA2300s載體片段連接，構(gòu)建超表達載體pCAMBIA2300s-/^7￥-J-J。通過液氮凍融法將pCAMBIA2300s-/^7^-J-J植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，、\%Pp 14-3-3編碼序列導(dǎo)入煙草等植物中表達。通過抗生素篩選、基因組DNA PCR和RT-PCR篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。(3)轉(zhuǎn)基因植株抗性分析將生長健壯的轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株(非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，分別種植于花盆中。待生長穩(wěn)定之后，停止灌溉15天，觀察干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型，從而驗證轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫的抗性。本發(fā)明為增強植物對干旱的抗性提供了ー種方法，通過基因工程手段培育抗干旱植物能克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單。將來自火把梨的/^
基因?qū)胫参镏斜磉_，能增強轉(zhuǎn)基因植物對干旱的抗性，將該基因?qū)霟煵葜?，可以產(chǎn)生耐干旱的新型煙草種質(zhì)和品種。利用基因工程技術(shù)增加植物抗逆性具有明顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性。它可以為作物、花卉等大規(guī)模生產(chǎn)提供方便，大量減少因自然條件惡劣而造成的減產(chǎn)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本且提高管理水平，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。


圖I是本發(fā)明部分/^轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的PCR檢測結(jié)果。其中Marker DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp六條DNA片段組成。正對照以質(zhì)粒pMD-18T-Pp 14-3-3為模板的PCR產(chǎn)物；WT 以非轉(zhuǎn)基因煙草(即野生型煙草)總DNA為模板的PCR產(chǎn)物；空白對照PCR體系中不包含模板DNA的反應(yīng)產(chǎn)物。圖2是本發(fā)明部分陽性轉(zhuǎn)基因煙草中Ppl4-3_3轉(zhuǎn)錄水平的表達分析結(jié)果。其中Marker DL2000 DNA Marker (大連寶生物)；1_16分別為不同的陽性轉(zhuǎn)基因煙草單株；WT :非轉(zhuǎn)基因煙草總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；空白対照PCR體系中不包含模板DNA的反應(yīng)產(chǎn)物；正對照質(zhì)粒pMD-18T-/^7￥-J-J為模板的PCR產(chǎn)物。、
圖3是轉(zhuǎn)基因煙草耐干旱特性分析示意圖。其中A為WT，即野生型煙草；B為陰性對照植株，即轉(zhuǎn)入pCAMBIA2300S空載體的煙草植株；C為編號為2飽Pp14-3-3轉(zhuǎn)基因煙草；D為編號為7的/^轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實施例方式下面通過附圖和實施例對本發(fā)明作進ー步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容。 實施例I 'Pp 14-3-3 全長基因的克隆以及序列分析
用液氮將火把梨的紅色果皮研磨成粉末以后，轉(zhuǎn)入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (天根)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為取 5 iig Total RNA，依次加入 50 ng oligo(dT) 15、2 u L dNTP (2. 5mM each)、ddH20 (RNase-free)至反應(yīng)體積為13. 5 u L ;混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻 5min，然后依次加入 4 u L 5 X First-stand buffer、0. 5 u L RNasin (200U)、1 u LM-MLV (200U)、1 u L DTT (0. 1M)，混勻并短時離心，42°C溫浴 I. 5h，取出后 95°C加熱 5min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于-20°C保存?zhèn)溆?。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因/^所用引物序列分別為5’GACCAGAGAAGGTTTCAGATTTAGG3’以及 5’ TGCCATCTATTACAAAGGTCCCAAG3’。采用大連寶生物的高保真DNA聚合酶ex taq擴增出目的基因。PCR反應(yīng)條件94 °C 3min ；94°C 30s，60°C 30s, 72°C lmin,28cycles ；72°C 5 min。反應(yīng)體系(20 y L)為 I y L cDNA、2 u L10XBuffer、0. 4 u L dNTP (IOmM each) ,0. I u L 正向引物(2O y M)、0. I u L 反向引物(20 u M) >0. 2 u L ex Taq DNA polymerase (5U/ U L) > 16. 2 U L ddH20。PCR 結(jié)束后，取 5U L用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增產(chǎn)物的特異性以及大小。由于PCR產(chǎn)物只有一條DNA帶，故直接對PCR產(chǎn)物進行TA克隆，使用的試劑盒為PMD-18T vector kit (大連寶生物)，反應(yīng)體系和操作過程為取I. 5 u L PCR產(chǎn)物，依次加入 I UL pMD18_T vector (50ng/ u L)和 2. 5 u L 2XLigation solution I，混勻置于16°C過夜反應(yīng)。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中。在涂于含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個白色菌落，搖菌后用擴增作バ-的特異引物鑒定出多克隆位點插入/^的克隆。將鑒定的克隆進行測序，最終獲得的/^#-全長cDNA為1107 bp，通過NCBI ORF finder(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ gorf. html)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個 786bp 的開放讀碼框(見序列表)。PpM-3-3編碼ー個含261個氨基酸的蛋白質(zhì)，Pp 14-3-3的分子量為29. 6KDa，等電為4. 71。SignalP 3. 0分析結(jié)果顯示Ppl4_3_3沒有信號肽的存在，而且未發(fā)現(xiàn)線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細胞核等亞細胞定位序列，可見PP14-3-3屬于非分泌蛋白。實施例2 :植物表達載體的構(gòu)建
采用堿裂解法提取插入/^#-的大腸桿菌質(zhì)粒pMD-18T-/^7￥-J-J以及植物表達載體pCAMBIA2300S的質(zhì)粒，取I y L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質(zhì)粒的完整性和濃度高低。用(Fermentas)和(Fermentas)分別對質(zhì)粒 pMD-l8T-/^7^-J-J
和PCAMBIA2300S進行雙酶切(100 U L體系)，反應(yīng)體系和操作過程為取10 u LpMD-18T-/^7￥-J-J 或 pCAMBIA2300S 質(zhì)粒、依次加入 10 u L IOXTango buffer, 2 u L&oRI、2 uL fe HI,76 UL ddH20，混勻后短時離心，置于37°C過夜反應(yīng)。將所有酶切產(chǎn)物點于瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后對片段和PCAMBIA2300S大片段分別進行膠回收，整個過程使用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(上海生エ)。具體操作流程為切下含有目的DNA條帶的瓊脂糖凝膠塊置于I. 5 mL離心管中，按400 U L/100 mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer II，置于60°C水浴lOmin，使膠徹底融化；將融化的凝膠溶液轉(zhuǎn)移至2 mL收集管內(nèi)的UNIQ-IO柱中，室溫放置2min后離心Imin (6, OOOg/min);取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-IO柱放入收集管中，加入500 u L Wash Solution，室溫離心Imin (8，000g/min)，再重復(fù)此步驟一次；取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，再將UNIQ-10柱放入收集管中，室溫離心2min (12，000g/min);取下UNIQ-10柱放入新的I. 5mL離心管中，在膜中央加入預(yù)熱的20 V- L Elution Buffer,室溫放置2min,室 溫離心Imin(12，000g/min)，離心管中收集液體即為回收的DNA片段。取I U L回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置于_20°C保存?zhèn)溆谩＠肨4 DNA Ligase (大連寶生物)，將回收的Ppl4_3_3 DNA片段和PCAMBIA2300S載體片段連接起來，反應(yīng)體系(20 y L)和操作過程為取10 u L Ppl4~3~3DNA片段依次加入 2 u L pCAMBIA2300S載體DNA、2 u L 10XT4 DNA Ligase BufferU u LT4 DNA Ligase,5 u L ddH20，混勻后短時離心，置于16°C金屬浴過夜反應(yīng)。接著采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增作的特異引物進行PCR,挑選出/^與pCAMBIA2300S成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入適量甘油并置于_80°C保存?zhèn)溆?。用堿裂解法提取并純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300S-/^7￥-J-J質(zhì)粒。并制備農(nóng)桿菌LBA4404菌株的感受態(tài)細胞，操作過程為將實驗室保存的LBA4404菌株在LB固體培養(yǎng)基(含利福平20mg/L)上劃線，28°C培養(yǎng)至長出單菌落后，挑取一個單克隆于含20mg/L利福平的2 mL LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)至混濁；取5 mL菌液轉(zhuǎn)接于含20mg/L利福平的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD600為0. 5 ;4°C離心5min (5，000g/min)收集菌體，棄上清，加入10 mL預(yù)冷的0. IM CaCl2，輕輕充分懸浮菌體，冰浴20min ;接著4°C離心5min (5, 000g/min)收集菌體,棄上清,加入4 mL預(yù)冷的含15%甘油的0. IM CaCl2溶液，充分懸浮后分裝于I. 5 mL離心管中，每管200 UL，液氮速凍后置于-80°C保存?zhèn)溆?。采用液氮凍融法將上述?gòu)建的植物表達載體pCAMBIA2300S-/^7￥-J-J轉(zhuǎn)入所制備的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。操作步驟為取2 u g pCAMBIA2300S-/^7^-J-J質(zhì)粒加入含有200 U L感受態(tài)細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5min，接著轉(zhuǎn)入液氮中冷凍lmin，然后迅速置于37°C水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800 u L LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)4h。將活化后的農(nóng)桿菌涂于含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C靜止培養(yǎng)。挑選單菌落搖菌，用擴增作#-的特異引物進行PCR，檢測pCAMBIA2300S-/^7￥-J-J是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油后置于_80°C保存?zhèn)溆谩嵤├? :農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植物篩選
本實驗的轉(zhuǎn)基因受體是煙草。將煙草種子用75%的酒精浸泡30s，用無菌水洗滌后用0. 1%的HgC12浸泡8min，然后再用無菌水洗滌若干次，播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)5-8d,發(fā)芽后轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)箱(25°C, 16h/d光照),以后姆月用MS培養(yǎng)基繼代一次。從_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-/^7￥-J-J質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50mg/L Km和20mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)至渾濁。吸取I mL渾濁的菌液至含有50mg/L Km的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h。將LB固體培養(yǎng)基上的農(nóng)桿菌刮下適量接種于MGL液體培養(yǎng)基中，附加一定量的こ酰丁香酮，28°C振蕩培養(yǎng)2-3h以活化農(nóng)桿菌。取煙草無菌苗葉子切成Icm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農(nóng)桿菌的MGL液體培養(yǎng)基中，浸染15min。用無菌濾紙吸干葉片表面的菌液，將葉盤置于共培養(yǎng)基上進行室溫培養(yǎng)。共培養(yǎng)基為MS+0. 02 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA+30g/L蔗糖，培養(yǎng)時間為2d。將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)到加有抗生素的MS篩選培養(yǎng)基中分化成苗，同時篩選轉(zhuǎn)基因植株。篩選培養(yǎng)基為MS+0. 5 mg/L 6-BA+0. I mg/L NAA+30g/L蔗糖+50 mg/L Km+200 mg/ L頭孢霉素(cefotaxime sodium salt,Cef);篩選培養(yǎng)時將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)(250C，16h/d光照，8h/d黑暗)。出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進ー步篩選。將煙草再生苗移至含有50mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養(yǎng)基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗做進ー步的分子水平檢測。采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片的基因組DNA，取I U L基因組DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板用擴增Pp 14-3-3的特異引物進行PCR。PCR結(jié)束后，取8 UL產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的擴增結(jié)果如圖I所示。作轉(zhuǎn)化煙草共篩選到41株陽性轉(zhuǎn)基因植株，分別編號為I 41。實施例4 Ppl4-3-3表達分析以及轉(zhuǎn)基因植株抗干旱能力分析
取陽性轉(zhuǎn)基因單株以及非轉(zhuǎn)基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成第一鏈cDNA，并以此為模板擴增ゆ基因所用引物序列與實施例I中相同。PCR反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin，26 個循環(huán)；72°C 5min。根據(jù) PCR 結(jié)果分析各轉(zhuǎn)基因單株中Pp 14-3-3轉(zhuǎn)錄水平的表達?？俁NA提取以及RT-PCR的方法與步驟I)相同。PCR結(jié)束后，取5 UL用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結(jié)果如圖2所示。共檢測到24株轉(zhuǎn)基因單株中/^在轉(zhuǎn)錄水平有表達，這些植株分別編號為1、2、3、5、6、7、8、
11、12、13、14、15、16、19、21、22、23、27、29、30、33、34、36、39。對檢測出的陽性轉(zhuǎn)基因煙草進行組培快繁，并挑選生長健壯的/^轉(zhuǎn)基因煙草、野生型煙草和陰性對照煙草植株(轉(zhuǎn)入PCAMBIA2300S空載體煙草植株)組培苗分別種于花盆中，待生長穩(wěn)定后，停止灌溉15天，觀察干旱脅迫下各植株的生長情況。結(jié)果如圖3所示，干旱處理15天后，野生型和陰性對照出現(xiàn)明顯脫水枯萎現(xiàn)象，而ゆ7わ 轉(zhuǎn)基因煙草(編號分別為2和7)則未出現(xiàn)明顯的枯萎和脫水癥狀。在干旱脅迫下，作轉(zhuǎn)基因煙草相對于野生型煙草表現(xiàn)出更好的生長態(tài)勢。上述實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入/^基因可大大增強煙草對干旱脅迫的抵抗能力。
權(quán)利要求
1.一種火把梨耐干旱基因/^#-J-J，其特征在于其具有如SEQ ID NO: I所示核苷酸序列，編碼14-3-3蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述火把梨耐干旱基因/^其特征在于基因的編碼區(qū)是SEQ ID NO 1中所述第85-870位所示的核苷酸序列或編碼如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求I所述火把梨耐干旱基因/^核苷酸序列在提高植物耐干旱脅迫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種火把梨耐干旱基因Pp14-3-3及其應(yīng)用，Pp14-3-3基因具有SEQIDNO1所示核苷酸序列，編碼14-3-3蛋白。本發(fā)明采用功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)證實火把梨Pp14-3-3基因具有提高植物耐干旱脅迫的功能。將本發(fā)明耐旱基因Pp14-3-3構(gòu)建到植物表達載體上并轉(zhuǎn)入植物中過量表達，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出很強的耐干旱脅迫的能力。
文檔編號A01H5/00GK102643831SQ201210107049
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉亞龍, 劉迪秋, 李紅麗, 王光勇, 葛鋒, 陳朝銀, 饒健 申請人:昆明理工大學(xué)