專利名稱：一種煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)中植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)，具體而言，涉及一種煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化是植物遺傳工程的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自Abel等(1986)將煙草花葉病毒(TMV)衣殼蛋白cDNA導(dǎo)入煙草細(xì)胞，獲得抗TMV病毒的轉(zhuǎn)基因煙草植株后，先后發(fā)展了許多植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)。這些遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)可以分為兩大類，一是生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，另一類是非生物載體，即DNA直接導(dǎo)入的遺傳轉(zhuǎn)化。生物載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens,簡稱農(nóng)桿菌)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，De Cleene和De Ley (1976)報道，有138科，588屬，1193種雙子葉植物和裸子植物對農(nóng)桿菌敏感。雖然曾有用DNA病毒(如花椰菜花葉病毒，CaMV)和RNA病毒(如煙草花葉病毒，TMV)為生物載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，但因其宿主局限和轉(zhuǎn)化植株發(fā)生病癥的缺陷，已不再使用病毒為生物載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點是經(jīng)濟、且操作技術(shù)簡單，容易在一般實驗室中實施；缺點是對單子葉植物不敏感，并需要在篩選培養(yǎng)基中加入抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素，而這些抗生素對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的分離和生長有影響。在DNA直接導(dǎo)入的遺傳轉(zhuǎn)化中，又分為化學(xué)和物理的方法?；瘜W(xué)方法有聚乙二醇(PEG)法(Golovkin等，1993)、脂質(zhì)體法(Antonelli等，1990)、磷酸I丐共沉淀法(Hain等，1985)、多聚陽離子二甲亞諷(The polycation DMS0)技術(shù)(Antonelli 和 Stadler, 1989)和二乙基氨乙基葡聚糖(diethyl amino ethyl dextran,DEAE)方法。理論上,化學(xué)方法不受植物種類的限制，但由于化學(xué)方法使用的受體是原生質(zhì)體，一般需要建立原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生體系，而許多植物的原生質(zhì)體再生體系尚未建立，使這些方法的應(yīng)用受到阻礙。雖然Naqvi等(2012)將芥菜(Brassica juncea)下胚軸浸入含有包裹pCAMBIA 1300質(zhì)粒DNA的磷酸鈣納米粒子的緩沖液中，溫育后篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，但制備納米粒子的技術(shù)復(fù)雜。物理方法有微粒轟擊法或基因槍法(Klein等，1987)、微量注射法(Crossway等，1986)、電擊穿孔法(Fromm等，1985)、碳化娃纖維介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(Kaeppler等，1992)、激光介導(dǎo)法(Guo等，1995)和花粉管通道法(周光宇，1978)。物理方法遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)點是不受植物種類的限制，缺點是大多數(shù)方法要求的設(shè)備昂貴，且操作技術(shù)不容易掌握；雖然其中也有不需要昂貴儀器、技術(shù)簡單的方法，如電擊穿孔法和花粉管通道法，但是電擊穿孔法一般需要原生質(zhì)體為受體，其應(yīng)用也受到建立原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生體系的限制；花粉管通道法需要精確掌握受體的受精過程及其轉(zhuǎn)化時間，迄今該方法僅僅在陸地棉遺傳轉(zhuǎn)化中獲得成功
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有煙草(Nicotiana tabacum)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在的不足，即在篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞過程中減少抑制農(nóng)桿菌生長的措施，從而減少抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生長的影響；避免利用原生質(zhì)體作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體；減少所使用儀器的費用，使實驗操作技術(shù)容易在普通實驗室進(jìn)行，而提出的一種煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明所提供的技術(shù)方案包括以下步驟
(I)提取攜帶目的基因的重組pAHC25質(zhì)粒將含有重組pAHC25質(zhì)粒的大腸桿菌JM109接種到含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、轉(zhuǎn)速為190rpm的搖床上過夜培養(yǎng)；堿裂法提取重組pAHC25質(zhì)粒DNA后，將質(zhì)粒DNA溶液的濃度調(diào)整為0. 5 I. g/yl。酶切鑒定重組pAHC25質(zhì)粒。(2)預(yù)培養(yǎng)幼葉外植體從高20cm左右的煙草盆栽苗上剪取幼葉，按常規(guī)方法進(jìn)行表面消毒，將表面消毒的幼葉剪成0. 3 0. 5cm2的葉塊，接種在MSl培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基中添加0. 2mg/L6-芐氨基嘌呤、0. 02mg/La-萘乙酸、3%蔗糖和0. 65%瓊脂；pH為5. 6 5. 8)上，在溫度26+1 °C、光照強度40001x、光周期為16小時光照和8小時黑暗的條件下預(yù)培養(yǎng)3 8天。
(3)準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化使用的葉外植體取預(yù)培養(yǎng)后的葉塊，用解剖刀切取葉塊邊緣長3 5_、寬Imm左右的葉外植體，將20個葉外植體浸入0. 5ml、濃度為0. 5 I. 5 ii g/ ill的重組pAHC25質(zhì)粒DNA溶液中。(4)真空滲透處理將幼葉外植體與重組pAHC25質(zhì)粒DNA溶液放置在玻璃罩或玻璃干燥器中，用橡皮膠管將其與真空泵的真空吸氣口連接；接通電源，調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針移到到所需的負(fù)壓刻度，在壓強為80kPa 20kPa的條件下持續(xù)處理6 15分鐘，然后調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針回復(fù)到零位，即玻璃罩或玻璃干燥器內(nèi)的氣壓恢復(fù)到大氣壓狀態(tài)，在大氣壓狀態(tài)下保持30秒，再調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針移到相同的負(fù)壓刻度，持續(xù)處理相同的時間，然后使玻璃罩或玻璃干燥器內(nèi)的氣壓恢復(fù)到大氣壓狀態(tài)。重復(fù)相同的真空滲透處理2 5次。(5)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、誘導(dǎo)抗性愈傷組織形成和植株再生將真空滲透處理后的幼葉外植體接種到MSl培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)3天，然后把幼葉外植體轉(zhuǎn)移到MS2篩選培養(yǎng)基(MSl培養(yǎng)基中加入I. 5mg/L草丁膦，pH為5. 6 5. 8)上，在溫度26±1°C、光照強度40001x、光周期為16小時光照和8小時黑暗的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)初期2周內(nèi)每隔3 4天繼代一次，以后每隔兩周繼代一次；在MS篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 5周后，外植體上形成的抗草丁膦抗性的愈傷組織分化不定芽，不定芽繼續(xù)生長形成試管苗。(6)提取葉總DNA和PCR擴增鑒定轉(zhuǎn)基因植株用CTAB法提取再生植株的葉總DNA，以目的基因序列設(shè)計正義引物和反義引物；以葉總DNA為模板，用所設(shè)計的目的基因片段的引物進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物鑒定
轉(zhuǎn)基因植株。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(I)有利于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分裂和生長。煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法屬于非生物載體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化相比，不需要在篩選培養(yǎng)基中加入抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素，可只在MS篩選培養(yǎng)基中加入草丁膦，篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，有利于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的分裂和生長。(2)容易獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法所使用的受體是離體培養(yǎng)的煙草組織或細(xì)胞，而不是其原生質(zhì)體。與煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)相比，煙草葉片組織或細(xì)胞更容易誘導(dǎo)植株再生。因此，與化學(xué)方法導(dǎo)入外源DNA相比，本方法容易獲轉(zhuǎn)基因再生植株。(3)所需的設(shè)備簡單，操作技術(shù)容易掌握。煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法又可歸入物理方法類。對其他物理方法諸如基因槍法、碳化硅纖維介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和激光介導(dǎo)法來說，需要復(fù)雜和昂貴的儀器設(shè)備，如基因槍、顯微鏡、激光發(fā)射儀等，且操作技術(shù)不容易掌握。本方法需要的主要設(shè)備為真空泵，其價格低，容易操作，且不需要制備外源DNA微粒等復(fù)雜的技術(shù)處理。


圖I為Sac I和Xma I雙酶切攜帶DFR基因的重組pAHC25質(zhì)粒的產(chǎn)物；M =DNA分子量標(biāo)記；泳道I :Sac I和Xma I雙酶切重組pAHC25質(zhì)粒后產(chǎn)生的兩條DNA片段，分子量較大的片段(7892bp)是pAHC25質(zhì)粒DNA片段(泳道上方)，分子量較小的片段(1054bp)是兩端具有Sac I和Xma I部分堿基序列的DFR基因片段(泳道下方)圖2為在MS2篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)45天的對照外植體(左)和真空滲透處理的外植體上形成的愈傷組織及其再生植株(右)圖3為PCR擴增方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株；WT :非轉(zhuǎn)基因植株；p25 :攜帶DFR基因的重組pAHC25質(zhì)粒；H20 :反應(yīng)液中無DNA模板，加入等量重蒸水；1 7 :再生植株編號，再生植株1、2、5和7具有與重組pAHC25質(zhì)粒相同的388bp DNA片段，而從非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸驮偕仓?、4和6，以及無模板DNA的反應(yīng)液中沒有出現(xiàn)388bp DNA片段，表明再生植株1、2、5和7是轉(zhuǎn)基因植株，而再生植株3、4和6是假陽性的非轉(zhuǎn)基因植株；M DNA分子量標(biāo)記，單位bp
具體實施例方式實施例I，提取攜帶目的基因DFR的重組pAHC25質(zhì)粒(I)培養(yǎng)大腸桿菌JM109細(xì)胞重組pAHC25質(zhì)粒(8938bp)攜帶的目的基因為二氫黃酮醇還原酶基因(dihydrof lavono 14-reductase, DFR) (1044bp ;GenBank 登錄號AY323494),克隆于安祖花(Anthurium andreanumHort)火焰品種的佛焰荀cDNA,兩端添加Sac I和Xma I酶切位點的堿基序列；將重組PAHC25質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細(xì)胞后甘油保存在_20°C冰箱中。取_20°C下甘油保存的、含重組pAHC25質(zhì)粒的JM109細(xì)胞，涂布在LB固體培養(yǎng)基(含100mg/L氨芐青霉素，下同)上，37°C培養(yǎng)(下同)。挑取單菌落于2ml的LB液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為190rpm的搖床上過夜培養(yǎng)，然后吸取0. 5ml菌液于50ml LB液體培養(yǎng)基中，在同樣轉(zhuǎn)速的搖床上過夜培養(yǎng)。(2)堿裂法提取重組PAHC25質(zhì)粒與酶切鑒定
采用常規(guī)堿裂法提取重組pAHC25質(zhì)粒，得到純化的重組pAHC25質(zhì)粒后，用NanoVue超微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA溶液的濃度，將質(zhì)粒DNA溶液的濃度調(diào)整為I. O Ii g/ Ii Io在20ia酶切反應(yīng)體系中，加入0 5ilg重組pAHC25質(zhì)粒、15U Sac I、15U Xma I和雙酶切Tango 緩沖液，37°C水浴中反應(yīng)6小時。取5 yl酶切液，在含溴化乙錠的I %瓊脂糖凝膠板中電泳，TAE電泳緩沖液，電壓4V/cm。將瓊脂糖凝膠板置于凝膠成像儀下，觀察到兩條大小為7892bp和1054bp的DAN片段(圖I)，表明實驗中使用的重組pAHC25質(zhì)粒攜帶的目的基因是DFR基因。實施例2，煙草遺傳轉(zhuǎn)化(I)預(yù)培養(yǎng)幼葉外植體以煙草K326品種為材料，從高20cm左右的盆栽苗上剪取幼葉，用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺上，將葉片放入無菌燒杯中，用70%酒精浸泡葉片30秒，然后用10%次 氯酸納溶液浸泡葉片，表面消毒6分鐘，無菌水清洗5次。然后，將無菌葉片剪切成大小為
0.3 0. 5cm2的葉塊，接種到MSl培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基添加0. 2mg/L 6-芐氨基嘌呤、
0.02mg/La -萘乙酸、3%蔗糖和0. 65%瓊脂；pH為5. 6 5. 8)上，在溫度26± 1°C、光照強度40001X、光周期為16小時光照和8小時黑暗的條件下，培養(yǎng)6天。(2)準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化使用的葉外植體取預(yù)培養(yǎng)后的葉塊，用解剖刀切取葉塊邊緣長3 5mm、寬Imm左右的葉外植體；吸取0. 5ml、濃度為I. 0 ii g/ ill的重組pAHC25質(zhì)粒DNA溶液于內(nèi)徑為I. 2cm的平底指形玻璃管(指形管)中，將20個葉外植體浸入質(zhì)粒DNA溶液，用有透氣孔的封口膜(上海稼豐園藝用品有限公司)封閉管口，將指形管放置在IOOml燒杯內(nèi)。(3)真空滲透處理用橡皮膠管將AP-9925無油真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)的真空吸氣管與玻璃罩下方的托盤側(cè)面的出氣管連接，將放置指形管的燒杯置于托盤中央，蓋上玻璃罩。接通電源，調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針移到_70kPa時(即玻璃罩內(nèi)壓強為30kPa)計時，持續(xù)處理lOmin，然后調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針回復(fù)到零位，即玻璃罩內(nèi)的氣壓恢復(fù)到大氣壓狀態(tài)，在大氣壓狀態(tài)下保持30秒；再調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針移到_70kPa時計時，持續(xù)處理lOmin，然后調(diào)節(jié)負(fù)壓旋鈕使真空表指針回復(fù)到零位，使玻璃罩內(nèi)的壓強恢復(fù)到大氣壓狀態(tài)，關(guān)閉電源。真空滲透處理重復(fù)2次。(4)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、誘導(dǎo)抗性愈傷組織形成和植株再生將真空滲透處理后的幼葉外植體接種到MSl培養(yǎng)基上，在溫度26土 1°C的黑暗條件下培養(yǎng)3天，然后將幼葉外植體轉(zhuǎn)移到MS2篩選培養(yǎng)基(MSl培養(yǎng)基加入I. 5mg/L草丁膦，pH為5. 6 5. 8)上，在溫度26±1°C、光照強度40001x、光周期為16小時光照和8小時黑暗的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)初期2周內(nèi)每隔3 4天繼代一次，以后每隔兩周繼代一次；在MS2篩選基上培養(yǎng)3 5周后，外植體上形成的抗草丁膦抗性的愈傷組織分化不定芽，不定芽繼續(xù)生長形成試管苗(圖2)。根據(jù)接種外植體數(shù)和產(chǎn)生抗性愈傷組織的外植體數(shù)，在壓強為30kPa的條件下煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率為13. 75%。實施例3，PCR擴增鑒定轉(zhuǎn)基因植株(I) CTAB法提取葉片總DNA取0. 05 0. Ig再生植株葉片，置于I. 5ml離心管中，浸泡液氮后快速研磨成粉，加入0. 5ml、65°C預(yù)熱的CTAB提取液，顛倒混勻，65°C水浴中提取30min ;再按照常規(guī)CTAB方法純化DNA，最后將純化的DNA溶于20 30 ill TE緩沖液中，取2 DNA溶液電泳，估計DNA溶液的濃度。(2) PCR 擴增以DFR基因序列設(shè)計正義引物5 ’ -AACCGCCTGACCCTCTGGAA-3 ’和反義引物5’-CGATGTTGTTCTTCTCCGCG-3’，擴增片段大小為388bp。在50 y I的PCR擴增反應(yīng)體系中，加入IOOng葉總DNA或20ng重組pAHC25質(zhì)粒DNA，20 P mo I/L正義和反義引物，200 u mol/L dNTP，2U DNA聚合酶和5 ill 10XDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液。PCR擴增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，然后94°C變性I分鐘，55°C退火I分鐘，72°C延伸2分鐘，35次循環(huán)，最后在72°C下延伸10分鐘。PCR擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠的I. 2%瓊脂糖凝膠板中電泳，TAE電泳緩沖液，電壓4V/cm。電泳結(jié)果表明(圖3)，再生植株1、2、5和7植株的PCR產(chǎn)物具有與重組pAHC25質(zhì)粒一樣的388bp DNA片段，表明DFR基因整合到1、2、5和7植株的基因組中，它們是轉(zhuǎn)基因植株；而再生植株3、4和6的PCR產(chǎn) 物沒有388bp DNA片段，表明它們是假陽性的非轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
1.一種煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法，其特征在于，將預(yù)培養(yǎng)后的煙草幼葉外植體浸入濃度為0. 5 I. 5 i! g/ ill的PAHC25質(zhì)粒DNA溶液中，在壓強為80kPa 20kPa的條件下持續(xù)保持6 15分鐘，然后在大氣壓狀態(tài)下保持30秒，重復(fù)相同的真空滲透處理2 5次；將真空滲透處理后的幼葉外植體接種到MS培養(yǎng)基上，黑暗條件下培養(yǎng)3天，再將幼葉外植體轉(zhuǎn)移到含草丁膦的MS培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)初期2周內(nèi)每隔3 4天繼代一次，以后每隔兩周繼代一次；篩選培養(yǎng)3 5周后，從抗草丁膦抗性的愈傷組織上再生不定芽，不定芽繼續(xù)生長形成試管苗，利用PCR擴增方法鑒定轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的預(yù)培養(yǎng)后的幼葉外植體，其特征在于，從高20cm左右的盆栽苗上剪取幼葉，表面消毒后，剪成大小為0. 3 0. 5cm2的葉塊，接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度26+l°C、光照強度40001X、光周期為16小時光照和8小時黑暗的條件下培養(yǎng)3 8天后，用解剖刀切取葉塊邊緣長3 5_、寬Imm左右的葉外植體，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PAHC25質(zhì)粒，是指攜帶目的基因的重組PAHC25質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求I和權(quán)利要求2所述的MS培養(yǎng)基，其特征在于，MS基本培養(yǎng)基中添加0.2mg/L 6-芐氨基嘌呤、0. 02mg/L a -萘乙酸、3%蔗糖和0. 65%瓊脂；pH為5. 6 5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草真空滲透直接遺傳轉(zhuǎn)化的方法，本方法將預(yù)培養(yǎng)后的煙草幼葉外植體浸入攜帶目的基因的pAHC25質(zhì)粒DNA溶液中，進(jìn)行真空滲透處理后，將葉外植體培養(yǎng)在含草丁膦的篩選培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)外植體上形成的抗草丁膦抗性的愈傷組織分化不定芽，不定芽繼續(xù)生長形成試管苗，利用PCR擴增方法鑒定攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，可將目的基因直接導(dǎo)入煙草細(xì)胞，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化相比，減少了抑制農(nóng)桿菌生長的措施；與聚乙二醇等化學(xué)方法的遺傳轉(zhuǎn)化相比，減少了從原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的環(huán)節(jié)；與基因槍等物理方法的遺傳轉(zhuǎn)化相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作技術(shù)簡單。
文檔編號A01H5/00GK102618574SQ20121011368
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者何艷, 商慶凱, 張彥, 李朝霞, 潘芳, 肖尊安, 鄭利文 申請人:北京師范大學(xué)