專利名稱：一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)和離體快速繁殖，尤其涉及一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法。
背景技術：
小秦究是龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬多年生草本植物,是我國著名的傳統(tǒng)中藏藥材，收載于2005版《中國藥典》和藏藥志中，其分布于海拔800 4500m的高山草甸、灌叢、林緣、山坡草地、山溝及河灘。在我國小秦艽主要分布于四川北部及西北部、西北、華北、東北等地區(qū)，為常用的傳統(tǒng)中、藏藥材，以干燥根入藥，可用于治療扁桃體炎、蕁 麻疹及風濕性關節(jié)炎等癥。目前小秦艽需求量逐年增加，小秦艽藥材長期依賴野生采挖來滿足國內(nèi)外市場需求，種質(zhì)資源破壞嚴重、蘊藏量急劇減少，小秦艽種群遭到了毀滅性破壞，致使其資源已無法滿足市場需要。尤其是近年來隨著國內(nèi)外對小秦艽需求量的增加，大量掠奪性采挖，使小秦艽逐漸面臨物種喪失、資源枯竭的危險，所以，進行種質(zhì)資源保護和擴大小秦艽繁育勢在必行，而通過組織培養(yǎng)技術建立小秦艽無性快繁體系是解決資源短缺的有效途徑之一 O植物組織培養(yǎng)技術是利用細胞的全能性(即個體的某個器官或組織已經(jīng)分化的細胞再生成完整個體的遺傳潛力。)，取植物個體上的細胞團或組織，通過人工配制的培養(yǎng)基，使這些細胞團或組織形成成千上萬個植株。利用組織培養(yǎng)進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內(nèi)均可快速大量繁殖；(2)便于保持優(yōu)良生物學特性；⑶在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優(yōu)勢的小秦艽突變體或一個具明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣等等。本發(fā)明首次采用幼苗莖尖外植體組織培養(yǎng)方法，開展野生小秦艽種質(zhì)離體繁殖研究工作，這為挽救小秦艽種質(zhì)資源，開展遺傳改良、促進小秦艽的工廠化育苗提供了一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種易于操作、可進行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，用質(zhì)量濃度為O. 19Γ0. 2%的升汞浸泡滅菌51分鐘，并用無菌去離子水沖洗4飛次后，即得消毒后的外植體莖尖；
⑵外植體接種將所述消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中接種I棵所述消毒后的外植體莖尖；在溫度為25°C ±1°C、光照強度為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的條件下培養(yǎng)2(Γ25天，在莖尖基部形成淺黃色致密愈傷組織；
⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將所述愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25°C ±1°C、光照強度為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的條件下增殖45飛O天，愈傷組織表面分化出幼小的單個芽，形成小秦艽單芽； ⑷生根誘導將所述小秦艽單芽進行分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml所述生根培養(yǎng)基中接種I棵所述小秦艽單芽；在25°C ±1°C、光照強度為3(T60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h .Cf1的條件下培養(yǎng)15 20天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗；
(5)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)；所述育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)；
(6)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株；所述一棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。所述步驟⑴中的小秦艽為龍膽科龍膽屬多年生草本植物。所述步驟⑵中的愈傷組織誘導培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液l(T20ml，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液l(T20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟⑶中的愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有機成分母液IOml,鐵鹽母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液30ml,濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟⑷中的生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有機成分母液IOml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。所述步驟(5)中育苗基質(zhì)的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質(zhì)含量為20%。所述大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(ΚΙ) 0. 83mg/L，鑰酸鈉(NaMoO4 2Η20)0. 25mg/L，硫酸銅(CuSO4 5H20) O. 025mg/L,氯化鈷(CoCl2'6H20) O. 025mg/L 的混合液。
所述有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素O. lmg/L,鹽酸吡哆醇O. 5mg/L,煙酸O. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點
I、本發(fā)明首次采用幼苗莖尖外植體通過生物工程技術一組織培養(yǎng)技術進行組織培養(yǎng)，克服了小秦艽育苗周期過長(2年)、繁殖系數(shù)低的問題；同時開展野生小秦艽種質(zhì)資源離體繁殖研究工作，為挽救小秦艽種質(zhì)資源，開展遺傳改良、促進小秦艽的工廠化育苗提供了一條新途徑，提供了一種能進行 小秦艽的人工繁殖、種質(zhì)資源離體保存、利用及選育藥用成分含量高的突變系的組織培養(yǎng)離體繁殖方法。2、由于本發(fā)明所用培養(yǎng)基中含有植物激素一玉米素，該激素屬細胞分裂素類，且為分裂素類中藥劑的活性作用最強，具有快速促進細胞分裂與擴大、誘導芽的分化，促進側(cè)芽萌發(fā)生長、抑制組織或器官衰老等特點，，因此誘發(fā)時間短、出苗快、增殖頻率高，尤其出苗齊，煉苗后可直接成活，易于操作，可進行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。3、本發(fā)明利用組織培養(yǎng)進行離體快速繁殖有以下幾方面重要意義⑴繁殖速度快，不受外界氣候因素影響，一年四季在室內(nèi)均可快速大量繁殖，即啟動快；⑵便于保持優(yōu)良生物學特性，即同步性好；(3)在保存和繁育優(yōu)良突變體或優(yōu)良雜種一代方面有非常重要的意義，一株具有明顯優(yōu)勢的小秦艽突變體或一個具明顯優(yōu)勢的后代經(jīng)組織培養(yǎng)后可大面積推廣等等。
具體實施例方式實施例I 一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，在超凈工作
臺上用質(zhì)量濃度為O. 1%的升汞浸泡滅菌8分鐘，并用無菌去離子水沖洗4飛次后，即得消毒后的外植體莖尖。⑵外植體接種將消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養(yǎng)基中接種I棵消毒后的外植體莖尖；在溫度為25V ±1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 25天，在莖尖基部形成淺黃色致密愈傷組織。愈傷組織誘導培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液IOml,濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C 土1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)增殖45 60天，愈傷組織表面分化出幼小的單個芽，形成小秦艽單芽。
愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液30ml，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將小秦艽單芽進行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的芽剝離下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵小秦艽單芽；在25°C ±1°C、光照強度為3(T60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 14 h . Cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 20天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉 片，可以獨立進行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為
O.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115°C溫度下進行高溫消毒，20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質(zhì)含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株，一般成活率在65%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例2 —種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，在超凈工作
臺上用質(zhì)量濃度為O. 2%的升汞浸泡滅菌5分鐘，并用無菌去離子水沖洗4飛次后，即得消毒后的外植體莖尖。⑵外植體接種將消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養(yǎng)基中接種I棵消毒后的外植體莖尖；在溫度為25V ±1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 25天，在莖尖基部形成淺黃色致密愈傷組織。愈傷組織誘導培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液20ml，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織增 殖及分化培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C ±1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)增殖45 60天，愈傷組織表面分化出幼小的單個芽，形成小秦艽單芽。愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液30ml，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將小秦艽單芽進行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的芽剝離下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵小秦艽單芽；在25°C ±1°C、光照強度為3(T60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 14 h . Cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 20天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為
O.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在121°C溫度下進行高溫消毒，15min后即得消毒后
的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質(zhì)含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株，一般成活率在65%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。實施例3 —種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟
⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，在超凈工作
臺上用質(zhì)量濃度為O. 15%的升汞浸泡滅菌6分鐘，并用無菌去離子水沖洗4飛次后，即得消毒后的外植體莖尖。⑵外植體接種將消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織誘導培養(yǎng)基中接種I棵消毒后的外植體莖尖；在溫度為25V ±1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 25天，在莖尖基部形成淺黃色致密愈傷組織。愈傷組織誘導培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液15ml,濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml,濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，其中每25ml愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基中接種2塊愈傷組織；在溫度為25°C 土1°C、光照強度為30 60 umol · m_2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)增殖45 60天，愈傷組織表面分化出幼小的單個芽，形成小秦艽單芽。愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素(ZT)母液30ml，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三 角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。⑷生根誘導將小秦艽單芽進行分株，即在無菌超凈工作臺內(nèi)，打開瓶口封口膜，用消過毒的鑷子將生長旺盛的芽剝離下來，然后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml生根培養(yǎng)基中接種I棵小秦艽單芽；在25°C ±1°C、光照強度為3(T60 umol . πΓ2. s—1、光照時間為12 14 h . Cf1的的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 20天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗，該完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已長出了小葉片，可以獨立進行自養(yǎng)生長的幼小植株。生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為
O.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液8ml,后加雙蒸懼水至IOOOml刻度處,攪勻后,加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。(5)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在118°C溫度下進行高溫消毒，ISmin后即得消毒后
的育苗基質(zhì)。其中育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)，該育苗基質(zhì)的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質(zhì)含量為20%。(6)植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株，一般成活率在65%以上；一棵完整再生小苗種植在消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。上述實施例1 3中的小秦HGentieum dahurica Fischer)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana L.)多年生草本植物；超凈工作臺，型號為BCM-1000A,由蘇州安泰空氣技術有限公司生產(chǎn)。愈傷組織誘導培養(yǎng)基、愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中大量元素母液是指含有硝酸銨(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L,硫酸鎂(MgSO4) 370mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170mg/L,氯化鈣(CaCl2_ 2H20) 440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸錳(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸鋅(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(KI) O. 83mg/L,鑰酸鈉(NaMoO4 2H20) O. 25mg/L,硫酸銅(CuSO4 5H20) O. 025mg/L,氯化鈷(CoC12_6H20) O. 025mg/L的混合液；有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素O.lmg/L,鹽酸卩比卩多醇O. 5mg/L,煙酸O. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L，Na2 EDTA.2H20 37. 3 mg/L 的混合液。
權利要求
1.一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，包括以下步驟 ⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，用質(zhì)量濃度為O. 19Γ0. 2%的升汞浸泡滅菌51分鐘，并用無菌去離子水沖洗4飛次后，即得消毒后的外植體莖尖； ⑵外植體接種將所述消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中接種I棵所述消毒后的外植體莖尖；在溫度為25°C ±1°C、光照強度為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h · cf1的條件下培養(yǎng)2(Γ25天，在莖尖基部形成淺黃色致密愈傷組織； ⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將所述愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，其中每25ml所述愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基中接種2塊所述愈傷組織；在溫度為25°C ±1°C、光照強度為30 60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h · (T1的條件下增殖45飛O天，愈傷組織表面分化出幼小的單個芽，形成小秦艽單芽； ⑷生根誘導將所述小秦艽單芽進行分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其中每25ml所述生根培養(yǎng)基中接種I棵所述小秦艽單芽；在25°C ±1°C、光照強度為3(T60 umol . πΓ2· s—1、光照時間為12 14 h .Cf1的條件下培養(yǎng)15 20天后，小苗基部出現(xiàn)白色、粗壯短根，并長出完整根系，即得完整再生小苗； (5)育苗基質(zhì)消毒將育苗基質(zhì)在115 121°C溫度下進行高溫消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基質(zhì)；所述育苗基質(zhì)是指腐殖質(zhì)與珍珠巖按2 1重量比混合而成的混合基質(zhì)； (6)植株移栽將所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株；所述一棵完整再生小苗種植在所述消毒后的育苗基質(zhì)IOcm2的范圍內(nèi)。
2.如權利要求I所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑴中的小秦艽為龍膽科龍膽屬多年生草本植物。
3.如權利要求I所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑵中的愈傷組織誘導培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的玉米素母液l(T20ml,濃度為O. lmg/ml的萘乙酸母液5ml,濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液l(T20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
4.如權利要求I所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑶中的愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml,鹿糖30克,濃度為O. lmg/ml的玉米素母液30ml,濃度為O. lmg/ml的萘乙酸母液IOml,濃度為O. lmg/ml的6-芐氨基腺嘌呤母液20ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，力口入ImM NaOH溶液調(diào)整pH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
5.如權利要求I所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟⑷中的生根培養(yǎng)基是指在IOOOml的燒杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液10ml，有機成分母液10ml，鐵鹽母液5ml，檸檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，濃度為O. lmg/ml的萘乙酸母液5 10ml，后加雙蒸餾水至IOOOml刻度處，攪勻后，加入ImM NaOH溶液調(diào)整PH值至5. 8，最后加入瓊脂粉6. O克，在IOOml三角瓶中每25ml分裝為一瓶，經(jīng)121°C高溫消毒即得。
6.如權利要求I所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述步驟(5)中育苗基質(zhì)的總孔隙度為70°/Γ75%，有機質(zhì)含量為20%。
7.如權利要求3、4或5所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述大量元素母液是指含有硝酸銨1650mg/L，硝酸鉀1900mg/L，硫酸鎂370mg/L，磷酸二氫鉀170mg/L,氯化I丐440mg/L的混合液。
8.如權利要求3、4或5所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述微量元素母液是指含有硫酸錳22. 3mg/L，硫酸鋅8. 6mg/L，硼酸.2mg/L，碘化鉀O.83mg/L，鑰酸鈉O. 25mg/L，硫酸銅O. 025mg/L，氯化鈷O. 025mg/L的混合液。
9.如權利要求3、4或5所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述有機成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，鹽酸硫胺素O. lmg/L，鹽酸吡哆醇O. 5mg/L，煙酸O.5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。
10.如權利要求3、4或5所述的一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，其特征在于所述鐵鹽母液是指含有硫酸亞鐵27.8mg/L，Na2_EDTA_2H20 37.3 mg/L的混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小秦艽組織培養(yǎng)離體快速繁殖方法，該方法包括以下步驟⑴外植體的選擇和消毒處理取溫室兩年生小秦艽幼苗的莖尖為外植體，經(jīng)浸泡滅菌、沖洗，即得消毒后的外植體莖尖；⑵外植體接種將消毒后的外植體莖尖接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，形成愈傷組織；⑶愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)將愈傷組織接種到愈傷組織增殖及分化培養(yǎng)基上，形成小秦艽單芽；⑷生根誘導將小秦艽單芽進行分株后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成完整再生小苗；⑸育苗基質(zhì)消毒；⑹植株移栽將完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基質(zhì)中，煉苗后即長成正常小秦艽植株。本發(fā)明克服了小秦艽育苗周期過長、繁殖系數(shù)低的問題，易于操作、可進行工廠化快速育苗。
文檔編號A01H4/00GK102630569SQ20121014378
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優(yōu)先權日2012年5月10日
發(fā)明者周國英, 徐文華 申請人:中國科學院西北高原生物研究所