專利名稱：用于器官的灌注液和/或保存溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于保存、灌注和/或再灌注 用于移植的器官特別是心臟的溶液。該溶液包含蛋白激酶CP II (PKC￠11)和/或蛋白激酶C 4 (PKC ^ )的肽抑制劑和/或蛋白激酶C 6 (PKC 6 )的肽激活物。
背景技術(shù)：
成功的器官移植通常因局部缺血/再灌注損傷的原因而受到限制。缺氧超過4小時的分離的人的心臟逐漸失去活力且通常在受體宿主中不能存活。其他器官例如腎、肝臟、胰腺和肺，當在移植前從其宿主中取出時，也遭受組織和細胞損傷。該損傷是由于低氧狀態(tài)和缺乏循環(huán)造成的，所述循環(huán)通常遞送生理濃度的氧和營養(yǎng)物和清除由器官的細胞產(chǎn)生的毒性化合物。當從其宿主切取后立即進行移植時，器官移植具有更高的成功率。近年來的進步已増加了成功的器官移植和器官手術(shù)例如冠狀動脈旁路手術(shù)的比例。首先包括器官保存和器官灌注液。第二是用于遞送器官灌注液至器官的改進的方法和裝置。目前通過在心臟停搏后冷凍貯藏來提供短期心肌保護。存在多種方法，然而它們的差異在于所用溶液的組成、保存溫度和施用方案。已發(fā)展了用于使心臟停跳和保存心臟的不同溶液以在心臟手術(shù)中保護心肌。這些溶液的實例包括克-漢ニ氏溶液(Krebs-Henseleit solution)、Uff 溶液、St. Thomas II 溶液、Collins 溶液和 Stanford 溶液。(參見，例如，美國專利 Nos. 4，798，824 和 4，938，961; Southard和 Belzer, Ann. Rev. Med. 46: 235-247 (1995);以及 Donnelly 和 Djuric, Am. J. Hosp.Pharm. 48:2444-2460 (1991))。然而，由于在取出的時間和在受體中恢復(fù)血流的時間之間移植的器官的狀況惡化的原因，器官排異反應(yīng)仍然存在。血流的恢復(fù)是在例如移植期間治療經(jīng)歷長時間局部缺血的器官組織的首要目的。然而，血流的再灌注引起內(nèi)皮和肌細胞損傷，從而導致器官功能障礙(Buerke等人，細I Physiol 266:H128-136, 1994;Lucchesi 和 Mullane, Ann Rev Pharmacol Toxicol26:2011-2024，1986;和 Lucches i 等人，J MoI Cell Cardiol 21:1241-1251,1989)。與再灌注損傷相關(guān)的系列事件由特征在于再灌注后前2. 5-5分鐘內(nèi)的基底內(nèi)皮細胞釋放ー氧化氮(NO)的下降的內(nèi)皮功能障礙引發(fā)(Tsao和Lefer, Am J Phyiol259:H1660-1666, 1990)。內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的NO的減少與內(nèi)皮細胞膜和多形核(PMN)白細胞膜上的粘附分子上調(diào)相關(guān)(Ma等人，Circ Res 72:403-412，1993;和Weyr i ch等人，JLeuko Biol 57:45-55, 1995)。該事件促進了再灌注后10至20分鐘之內(nèi)發(fā)生的PMN/內(nèi)皮相互作用，且再灌注后30分鐘內(nèi)觀察到隨后的PMN至心肌的浸潤(Lefer和Hayward，In TheRole of Nitric Oxide in Ischemia-Reperfusion Contemporary しaraiology, Loscalzo等人(Ed s. ), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 357-380，2000;Lefer 和 Lefer, CardiovascRes 32:743-751, 1996; Ts ao 等人，Circulation 82. 1402-1412，1990;和 Weyrich 等人，JLeuko Biol 57:45-55， 1995)。從再灌注組織釋放的趨化物質(zhì)和血漿因子激活PMN，這促進了 PMN在局部缺血/再灌注后釋放細胞毒性物質(zhì)(即過氧化物陰離子)并促成了器官功能障礙(Lucchesi等人 J Mol Cell Cardiol 21:1241-1251，1989;Ma等人，Circ Res 69:95-106，1991;Tsao 等人，Circulation 82:1402-1412，1990;和 Tsao 等人，Am Heart J123:1464-1471，1992)。過氧化物結(jié)合NO以產(chǎn)生過硝酸鹽陰離子，從而減少了 NO的生物利用度和在心肌局部缺血/再灌注后促進內(nèi)皮功能障礙和PMN浸潤(Clancey 等人，J Clin Invest 90:1116-1121, 1992; Hansen, Circulation 91:1872-85，1995; Lucches i 等人，J Mol Cell Cardiol21:1241-1251，1989;Rubanyi 和 Vanhoutte, Am J Physiol 250:H815_821, 1986;Tsao 等人，Am Heart J123:1464-1471，1992;和 Weiss, New Eng J Med 320:365-375，1989)。因此，存在對提高的質(zhì)量的溶液的需要，該溶液可延長用于移植的器官的保存時間和保護器官免受局部缺血后再灌注損傷，從而使器官可在血流恢復(fù)后重新開始適當?shù)墓}^:。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于器官特別是心臟的保存、灌注和/或再灌注的溶液，其包含蛋白激酶CP II (PKCPII)和/或蛋白激酶C 4 (PKC ^ )的肽抑制劑和/或蛋白激酶CS (PKC 6 )的肽激活物。當從循環(huán)系統(tǒng)分離器官或器官經(jīng)歷減少的血流(局部缺血)吋，所述溶液保護所述器官組織和細胞免受損傷。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)蛋白激酶CP II和/或蛋白激酶C (的肽抑制劑和/或蛋白激酶C S (PKC 6 )的肽激活物増加NO釋放或抑制內(nèi)皮/PMN過氧化物釋放，這可在經(jīng)歷局部缺血/再灌注的器官中產(chǎn)生保護效應(yīng)。在一個實施方案中，所述溶液包含溶解在鹽溶液中的大約5-10 ii M PKCP II的肽抑制劑和/或大約2. 5-5 u M PKC ^的肽抑制劑和/或5-10 U M PKC 6的肽激活物。本發(fā)明的溶液可用作灌注液或保存液。作為灌注液，將其灌注入器官的脈管系統(tǒng)以保護所述器官組織和細胞。作為保存液，其用作將器官浸沒于其中的浴液。優(yōu)選地，用本溶液灌注器官并將器官浸沒在其中。此外，當局部缺血后對器官恢復(fù)血流時，本發(fā)明的溶液也用作再灌注溶液。本發(fā)明也包括使用本發(fā)明的溶液的方法。這些方法包括用于保存移植用的器官、用于保護局部缺血的器官免受損傷、用于在局部缺血后減輕器官功能障礙、用于維持局部缺血的器官中的一氧化氮的釋放和用于當從循環(huán)系統(tǒng)分離時保護器官免受損傷的方法。附圖概述圖I.假手術(shù)、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKC4肽抑制劑(5 y M)灌注的大鼠心臟中的LVDP (左心室形成壓=左心室收縮末期壓-左心室舒張末期壓)的時程。開始時(基線)和局部缺血20分鐘后0至45分鐘的再灌注時的LVDP數(shù)據(jù)。假手術(shù)組(n=6)在整個80分鐘的方案中保持相同的LVDP。I/R(n=6)組恢復(fù)至初始基線值。I/R+PMN組(n=6)，與I/R+PMN+PKC ^肽抑制劑(n=6)組相比，表示顯著的和持續(xù)的LVDP的減少。所有值都表示為平均值土SEM。*p〈0. 05 和 #p〈0. 01，I/R+PMN+PKC ^ 肽抑制劑組與 I/R+PMN 相比。圖2.來自局部缺血前(I)(初始)和再灌注(R)后45分鐘(終)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的以mmHg表示的初始和終LVDP。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導顯著的收縮功能障礙，該收縮功能障礙可被PKC (肽抑制劑減輕，但被Ng-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME)顯著地阻斷。所有的值表示為平均值土SEM。被檢查的心臟數(shù)目示于柱的底部。**p〈0.01，與終I/R+PMN相比;NS=不顯著。圖3.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟中以mmHg/s表示的初始和終最大LVDP (+dP/dtmax)率。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導明顯的收縮功能障礙，該收縮功能障礙被PKC 4肽抑制劑減輕，但被L-NAME阻斷。所有值都以平均值土SEM表示。所檢查的心臟的數(shù)目示于柱的底部。**p〈0.01，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。圖4a.分離的灌注的大鼠心臟樣品(從每組3只大鼠 和每個心臟10個區(qū)域采集所述樣品)中的總的血管內(nèi)PMN和浸潤PMN的組織學評價。PKCC肽抑制劑顯著減少再灌注后的心肌組織中的和附著至冠狀脈管系統(tǒng)的總的血管內(nèi)和浸潤的PMN的數(shù)目。陰影標示的塊(box)代表非PMN灌注的心臟，黑色塊表示PMN灌注的心臟。**P〈0. 01，與I/R+PMN相比。圖4b.分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟樣品(從每組3只大鼠和每個心臟10個區(qū)域采集所述樣品)中附著至冠狀脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)PMN的組織學評價。附著至冠狀脈管系統(tǒng)的PMN的數(shù)目與I/R+PMN差異不顯著。陰影線標示的塊代表非PMN灌注的心臟，黒色塊代表PMN灌注的心臟。所有值為心臟面積土SEM的PMN的平均數(shù)目/mm2。圖5.來自大鼠主動脈節(jié)段的NO釋放的測量。在PKC ^肽抑制劑(2. 5-15 ii M)處理的和こ酰膽堿(Ach，200nM)處理的節(jié)段中，內(nèi)皮NO釋放與基線NO釋放相比顯著地増加。在提供400iiM L-NAME的兩個組中和除去內(nèi)皮的(裸露的)節(jié)段中，NO釋放顯著減少。所有值都表示為平均值土 SEM。柱底部的數(shù)目是每組分開實驗的次數(shù)。*p〈0. 05，**p〈0. 01，與基線值相比。圖6.來自大鼠PMN的過氧化物的釋放。在佛波醇-12-十四酸酯-13-醋酸鹽(PMA)(15nM)刺激后從5X IO6個PMN測量過氧化物的釋放。過氧化物歧化酶(SOD) (10 y g/ml)用作陽性對照。在加入PMA后360秒測量吸光率的改變(A)(峰響應(yīng))。過氧化物釋放顯著地被PKC ;肽抑制劑抑制(**p〈0. 01,2. 5、5和15 uM) o所有值都表示為平均值+SEM0柱底部的數(shù)目是每組分開實驗的次數(shù)。圖7.假手術(shù)I/R、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+3 II肽抑制劑(10 U M)灌注的大鼠心臟中的LVDP的時程。初始時(基線)和20分鐘局部缺血后0至45分鐘再灌注時的LVDP數(shù)據(jù)。假手術(shù)組(n=6)在整個80分鐘的方案中保持相同的LVDP。I/R+PMN組(n=9)，與I/R(n=6)和I/R+PMN+P II肽抑制劑組(n=7)相比，表現(xiàn)明顯的和持續(xù)的LVDP的減少。所有值都表示為平均值土SEM。*p〈0. 05和#p〈0. 01，與I/R+PMN相比。圖8.來自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)45分鐘(終)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的以mmHg表示的初始和終LVDP。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導顯著的收縮功能障礙，該收縮功能障礙可被PKCP II肽抑制劑減輕，但因L-NAME的存在而顯著地被阻止。所有的值表示為平均值土SEM。所檢查的心臟的數(shù)目示于柱的底部。**p〈0. 05 和 #p〈0. 01，與終 I/R+PMN 相比；NS=不顯著。圖9.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟中以mmHg/s表示的初始和終+dP/dt_。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導明顯的收縮功能障礙，該收縮功能障礙被PKCP II肽抑制劑減輕，但被L-NAME阻斷。所有值都以平均值土SEM表示。所檢查的心臟的數(shù)目示于柱的底部。*p〈0. 05和林p〈0. 01，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。


圖10.來自大鼠主動脈節(jié)段的NO釋放的測量。在PKCP II肽抑制劑(1、2. 5、5和
10u M)處理和こ酰膽堿(Ach，500nM)處理的節(jié)段中，內(nèi)皮NO釋放與基線NO釋放相比顯著地增加。在提供400 ii M L-NAME的兩個組中，NO釋放顯著減少。所有值都表示為平均值土SEM。柱底部的數(shù)目是每組分開的實驗的次數(shù)。*ロ 〈0.05，*郵〈0.01，與基線值相比。
圖11.來自大鼠PMN的過氧化物的釋放。在甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP) (200nM)刺激后從5X106個PMN測量過氧化物的釋放。S0D(10iig/ml)用作陽性對照。在fMLP加入后90秒測量吸光率的改變(A)(峰響應(yīng))。PKCP II肽抑制劑抑制劑(** 〈0.01，5、10和2011|1)顯著地抑制過氧化物釋放。所有值都表示為平均值土SEM。柱底部的數(shù)目是每組分開實驗的次數(shù)。
圖12.假手術(shù)、I/R、I/R+PMN 和 I/R+PMN+PKC ^ II(IOuM) +PKC ^ (5 u M)肽抑制劑灌注的大鼠心臟中的LVDP的時程。初始時(基線)和20分鐘局部缺血后0至45分鐘再灌注時的LVDP數(shù)據(jù)。假手術(shù)組(n=6)在整個80分鐘的方案中保持相同的LVDP。I/R組(n=6)部分地恢復(fù)至初始基線值。I/R+PMN 組(n=ll)，與 I/R+PMN+PKC ^ II(IOuM) +PKC ^ (5 u M)肽抑制劑組(n=7)相比，表現(xiàn)了明顯的和持續(xù)的LVDP的減少。所有值都表示為平均值土SEM。*p〈0. 05，與 I/R+PMN 相比。
圖13.來自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R) 45分鐘(終)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的以mmHg表示的初始和終LVDP。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導顯著的收縮功能障礙，該收縮功能障礙在PKC P II和PKC (肽抑制劑存在的情況下被減輕。該保護效應(yīng)被L-NAME阻斷。所有的值表示為平均值土 SEM。所檢查的心臟的數(shù)目標示在柱的底部。**p〈0. 05，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。
圖14.局部缺血前(I)和再灌注后(R)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟中以mmHg/s表示的初始和終+dP/dt max。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導明顯的收縮功能障礙，該收縮功能障礙被PKC P II和PKC (肽抑制劑減輕。該保護效應(yīng)被L-NAME阻斷。所有值都以平均值土SEM表示。所檢查的心臟的數(shù)目標示在柱的底部。*p〈0.05，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。
圖15.分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟樣品(從每組3只大鼠和每個心臟10個區(qū)域采集所述樣品)中總的血管內(nèi)和浸潤的PMN的組織學評價。PKCP II和PKC 4肽抑制劑顯著地減少再灌注后的心肌組織中的和附著至冠狀脈管系統(tǒng)的總的血管內(nèi)和浸潤的PMN的數(shù)目。陰影線塊代表非PMN灌注的心臟，黑色塊代表PMN灌注的心臟。**P〈0. 01，與I/R+PMN相比。
圖16.附著至分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟中的冠狀脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)PMN的組織學評價。附著至用PKC P II和PKC ^肽抑制劑處理的心臟的冠狀脈管系統(tǒng)的PMN的數(shù)目比I/R+PMN心臟低。陰影線塊代表非PMN灌注的心臟，黑色塊代表PMN灌注的心臟。所有值都以心臟面積土SEM的PMN的平均數(shù)目/mm2表示。#P〈0. 01，與I/R+PMN相比。
圖17.來自大鼠主動脈節(jié)段的NO釋放的測量。在PKCP II和PKC ;肽抑制劑處理和こ酰膽堿(Ach，500nM)處理的節(jié)段中，內(nèi)皮NO釋放與基線NO釋放相比顯著地增加。在提供400 ii M L-NAME的兩個組中，NO釋放都顯著減少。所有值都表示為平均值土SEM。柱底部的數(shù)目是每組分開的實驗的次數(shù)。**P〈0.01，與基線值相比。
圖18.來自大鼠PMN的過氧化物的釋放。在PMA (15nM)刺激后從5X106個PMN測量過氧化物的釋放。S0D(10 u g/ml)用作陽性對照。在PMA加入后360秒測量吸光率的改變(A )(峰響應(yīng))。過氧化物釋放顯著地被PKC 3 II和PKC ;肽抑制劑抑制(*p〈0. 05，林p〈0.01)。所有值都表示為平均值土SEM。柱底部的數(shù)目表示每組分開實驗的次數(shù)。
圖19.假手術(shù) I/R、I/R、I/R+PMN 和 I/R+PMN+PKC S 肽激活物(IOyM)灌注的大鼠心臟中的LVDP的時程。初始時(基線)和20分鐘的局部缺血后0至45分鐘再灌注時的LVDP數(shù)據(jù)。假手術(shù)組(n=6)在整個80分鐘的方案中保持相同的LVDP。I/R(n=6)組恢復(fù)至初始基線值。I/R+PMN組(n=6)，與I/R+PMN+ PKC S肽激活物(n=6)組相比，表現(xiàn)明顯的和持續(xù)的LVDP的減少。所有值都表示為平均值土SEM。林p〈0. 01，與I/R+PMN相比。圖20.來自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R) 45分鐘(終)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的以mmHg表示的初始和終LVDP。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導顯著的收縮功能障礙，該收縮功能障礙被PKC S肽激活物減輕。所有的值都表示為平均值土SEM。所檢查的心臟的數(shù)目標示在柱的底部。*p〈0. 05和**p〈0. 01，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。圖21.來自局部缺血前(I)(初始)和再灌注后(R)的分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的以mmHg表示的初始和終+dP/dt max。在PMN存在或不存在的情況下灌注心臟。PMN誘導顯著的收縮功能障礙，該收縮功能障礙被PKC S肽激活物減輕。所有的值都表示為平均值土SEM。檢查的心臟的數(shù)目示于柱的底部。**p〈0.01，與終I/R+PMN相比；NS=不顯著。圖22.來自大鼠PMN的過氧化物的釋放。在PMA (15nM)刺激后從5X IO6個PMN測量過氧化物的釋放。在PMA加入后360秒測量吸光率的改變(A )(峰響應(yīng))。過氧化物釋放顯著地被PKC 6肽激活物抑制(林p〈0. 01，5和10 ii M)。所有值都表示為平均值土 SEM。柱底部的數(shù)目表示每組分開實驗的次數(shù)。圖23a.分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟樣品(從每組3只大鼠和每個心臟10個區(qū)域采集所述樣品)中總的血管內(nèi)和浸潤的PMN的組織學評價。PKCS肽激活物顯著減少再灌注后的心肌組織中的和附著至冠狀脈管系統(tǒng)的總的血管內(nèi)和浸潤的PMN的數(shù)目。陰影線標示的塊代表非PMN灌注的心臟，黑色塊代表PMN灌注的心臟。圖23b.分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟樣品(從每組3只大鼠和每個心臟10個區(qū)域采集所述樣品)中附著至冠狀脈管系統(tǒng)的血管內(nèi)PMN的組織學評價。PKCS肽激活物減少了附著至冠狀脈管系統(tǒng)的PMN的數(shù)目。陰影線標示的塊代表非PMN灌注的心臟，黑色塊代表PMN灌注的心臟。所有值都是心臟面積土 SEM的PMN/mm2的平均數(shù)目。圖24.假手術(shù)的、I/R、I/R+PMN和I/R+PMN+PKC S肽激活物(IOyM)灌注的大鼠心臟中的左心室舒張末期壓(LVEDP)的時程。初始時(基線)和20分鐘的局部缺血后0至45分鐘的再灌注時的LVEDP數(shù)據(jù)。假手術(shù)組(n=6)在整個80分鐘的方案中保持相同的LVEDP0 I/R(n=6)組部分恢復(fù)至初始基線值。I/R+PMN組(n=6)，與I/R+PMN+PKC 6肽激活物組(n=6)相比，表現(xiàn)顯著和持續(xù)的LVEDP的升高。所有值都表示為平均值土SEM。*p〈0. 05和 **p〈0. 01，與 I/R+PMN 相比。優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明提供了用于保存、灌注和/或再灌注器官特別是心臟的溶液。所述溶液包含蛋白激酶C e II (PKC @ II)和/或蛋白激酶C 4 (PKC ^ )的肽抑制劑和/或PKC S的肽激活物。優(yōu)選地，PKCP II的肽抑制劑或PKC 6的肽激活物以大約5-10 u M的量存在于溶液中；PKC ;的肽抑制劑以大約2. 5-5 u M的量存在。在優(yōu)選的實施方案中，PKCP II的肽抑制劑具有SEQ ID NO: I的氨基酸序列；PKC (的肽抑制劑具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；所述肽激活物具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列。同樣，在其他實施方案中，優(yōu)選地所述肽抑制劑/激活物是十四烷基化的以提高進入器官的細胞的吸收。在優(yōu)選實施方案中，將所述肽抑制劑或肽激活物溶解在鹽溶液優(yōu)選地生理鹽水(0. 9%NaCl)溶液中。也可將所述肽抑制劑溶解在已知的保存液例如Krebs-Henseleit溶液、UW溶液、St. Thomas II溶液、Collins溶 液、Stanford溶液等中。所述溶液也可包含濃度分別為大約4-7mM、大約0. 2-0. 3mM、大約108_132mM、大約13_16mM、大約18_22mM、大約2-4mM、大約 0. 5-lmM、大約 27_33mM、大約 0. 9-1. ImM、大約 2. 7-3. 3mM、大約 25_35mM 和大約80-120mM的鈉(Na+)、鉀(K+)、鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)、谷氨酸、精氨酸、腺苷、甘露醇(manitol )、別嘌呤醇、谷光苷肽、棉子糖和乳糖酸中的ー種或多種。Na+可以以NaOH的形式存在；K+可以以KCl和/或KH2PO4的形式存在，最優(yōu)選以大約2-3. 5mM KCl和大約2_3. 5mM KH2PO4的比例存在；Ca2+可以以CaCl2的形式存在；而Mg2+可以以MgCl2的形式存在。所述溶液優(yōu)選地保持大約7. 2-7. 4的生理pH。本發(fā)明的溶液可在器官特別是心臟、移植體的所有時期中使用，所述時期包括，但不限于I)從供體分離器官(心臟停跳液)；2)保存器官(低溫保存/運輸)；和3)在受體中再植入器官(再灌注液)。在灌注或再灌注期間，特別是對于心臟，優(yōu)選地以大約ImL/分鐘的速率灌注器官大約5分鐘?？筛淖児嘧⑺俾?，但其不應(yīng)當超過大約25mL/分鐘。總之，灌注速率不應(yīng)當高至對器官的脈管系統(tǒng)產(chǎn)生過度的壓力。可通過I)將肽抑制劑和不同的組分溶解和稀釋在蒸餾水中；2)用例如用NaOH將pH調(diào)節(jié)至大約7. 2-7.4;和3)通過例如用0. 2 iim過濾器過濾使溶液滅菌來制備本發(fā)明的溶液。然后將滅菌的溶液與環(huán)境中的污染物保持分離。無需進一步描述，一般認為本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用前面的描述和下列舉例說明的實施例可制備和使用本發(fā)明的化合物并實踐所述方法。提供下列實施例以舉例說明本發(fā)明。應(yīng)當理解本發(fā)明不限定于實施例中描述的特定條件或細節(jié)。實施例I PKCC的肽抑制劑的作用通過60mg/kg戍巴比妥鈉腹膜內(nèi)(i. p.)注射來麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(275-325g,Ace Animals, Boyertown, PA)。也通過腹膜內(nèi)注射施用肝素鈉(1，000U)。快速切取心臟，將導管插入升主動脈，然后在80mmHg恒定壓力下用維持在37°C的改良的Krebs緩沖液開始逆行灌注心臟。所述Krebs緩沖液具有下列組成(以mmol/1表示)17葡萄糖、120NaCl、25NaHC03、2. 5CaCl2、0. 5EDTA、5. 9KC1 和 I. 2MgCl2。用 95%02 和 5%C02 充入灌注液并將其在PH 7. 3-7. 4下平衡。靠近心臟流入插管的灌注管中的兩個側(cè)臂允許PMN、無PKC 4肽抑制劑的血漿(對照心臟)或包含不同濃度的PKC 4肽抑制劑(1、2. 5或5iiM)的血漿直接灌注入冠脈流入管。由流量計(T106, Transonic System, Inc. , Ithaca, NY)監(jiān)測冠脈血流量。使用壓カ傳感器(SPR-524, Millar Instruments, Inc. , Houston, TX)監(jiān)測 LVDP 和 +dP/dtmax,將所述壓カ傳感器置于左室腔中。將心臟浸在裝有160mL維持在37°C的Krebs緩沖液的水套忙器中。使用與計算機連接的Powerlab Station采集系統(tǒng)(ADInstruments, GrandJunction, CO)記錄冠脈血流量、LVDP 和 +dP/dtmax。每5分鐘測量LVDP、+dP/dtmax和冠脈血流量，進行15分鐘，以平衡心臟和獲得基線測量。將LVDP定義為左心室收縮末期壓減去左心室舒張末期壓。15分鐘后，將Krebs緩沖液的流量減少至0，進行20分鐘，以引發(fā)全心缺血。在再灌注吋，以ImL/分鐘的速率用懸浮在5mLKrebs緩沖液和5mL血漿中的200X IO6個PMN灌注心臟5分鐘。在一些實施方案中，以1、2. 5或M的終濃度向血衆(zhòng)中加入PKC 肽抑制劑(Genemed Synthesis, Inc. , SanFrancisco, CA)。假手術(shù)I/R心臟不接受局部缺血和不用PMN灌注。使用下列分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟組 組I:假手術(shù)的局部缺血/再灌注(I/R)心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注，但在進入灌注的第35分鐘時用5mL血漿(ImL/分鐘)(在相同的時間點給I/R心臟提供5mL血漿，15分鐘的基線記錄和20分鐘的局部缺血)進行灌注。這些心臟代表用于確定分離的大鼠心臟在整個80分鐘的方案中是否可保持LVDP和+dP/dt_的對照組(n=6)。組2 :假手術(shù)I/R+PKC ;肽抑制劑(5 U M)心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注。在進入灌注的第35分鐘給這些心臟施用PKC ^肽抑制劑(5 u M，將在水中配制的5mM母液溶解在血漿中)。該組(n=6)用于確定PKC (肽抑制劑是否引起強心作用或心臟功能抑制作用。組3:將I/R心臟接受20分鐘的局部缺血，然后在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注，但不用PMN灌注。這些心臟代表了對照組(n=6)，用于確定20分鐘的局部缺血之后進行再灌注是否使心臟昏迷(s tun)，但在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax將恢復(fù)至基線值(初始值)。第4組將I/R+PKC ^肽抑制劑(5 U M，溶解在血漿中)心臟接受20分鐘的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿+PKC (抑制劑灌注這些心臟。該組(n=6)用于確定PKC 4肽抑制劑是否在無PMN的I/R背景中引起心臟功能抑制作用。組5:將I/R+PMR心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)和PMN (重懸浮于5mL Krebs緩沖液中)進行灌注。這些心臟代表對照組(n=6)，該對照組用于確定20分鐘的局部缺血后在PMN(200x IO6)存在的情況下進行45分鐘的再灌注在整個45分鐘的再灌注期間是否導致，與初始基線值(n=6)相比，持續(xù)的心肌收縮功能障礙。組6 :將I/R+PMNs+PKC ;肽抑制劑(I U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用IuM PKC 4肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表用于確定PKC 4抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組7:將I/R+PMNs+PKC ^肽抑制劑(2. 5 U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用2. 5 u M PKC ^肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表用于確定PKC (抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組8 :將I/R+PMNs+PKC ^肽抑制劑(5 U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5 ii M PKC 4肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表用于確定更高PKC (肽抑制劑濃度上的PKC (抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組9 :將 I/R+PMNs+PKC ^ 肽抑制劑(5 U M) +Ng-硝基-L-精氨酰甲酷(L-NAME，50 u M)心臟接受20分鐘的局部缺血，然后在再灌注的第一個5分鐘期間用5 ii M PKC 4肽抑制劑(溶解在5mL血漿中)和50 ii ML-NAME (將50mM水中配制的母液溶解在Krebs緩沖液中)和PMN(200xl06)進行灌注。在整個連續(xù)的45分鐘的再灌注期將L-NAME (50 u M)連續(xù)灌注入心臟。這些心臟代表組(n=5)，所述組用于確定使用ー氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)是否可阻斷PKC (肽抑制的心臟保護作用。
在再灌注后的45分鐘中，每5分鐘記錄數(shù)據(jù)。在進行各實驗后，分離左心室，將其在4%的多聚甲醛中固定并在4°C下貯存以備用于以后的組織學分析。圖I顯示心肌收縮功能(S卩，LVDP)的時程。來自假手術(shù)I/R、I/R、I/R+PMN+PKC ;肽抑制劑(5 U M)和I/R+PMN組的數(shù)據(jù)說明在80分鐘的灌注期期間LVDP的相對變化。如所顯示的，假手術(shù)I/R在整個灌注期保持在初始基線值的100%的附近或大于初始基線值的100%。I/R心臟在再灌注開始時經(jīng)歷LVDP的降低，但在再灌注結(jié)束時恢復(fù)至初始基線值的95 ±7%。相反地，遭受嚴重心肌收縮功能障礙的I/R+PMN心臟在再灌注后45分鐘時只恢復(fù)至初始基線值的47 ±7%。相反地，I/R+PMN+PKC (肽抑制劑(5 y M)心臟在灌注后45分鐘時恢復(fù)至84±4%。為確定PKC (肽抑制劑對心肌收縮功能是否產(chǎn)生直接的收縮能效應(yīng)，用PKC ^肽抑制劑(5 PM)灌注非局部缺血性假手術(shù)I/R心臟。使用PKC (肽抑制劑處理假手術(shù)I/R心臟在80分鐘的灌注期不導致LVDP (圖2)或+dP/dt (圖3)的任何顯著改變，表明5iiM的PKC(肽抑制劑對心肌收縮功能不產(chǎn)生直接作用。開始檢測了 15iiM PKC (肽抑制劑濃度，因為該濃度對應(yīng)于85%的PMN過氧化物釋放抑制。然而，15uM產(chǎn)生心臟功能抑制作用(假手術(shù)I/R心臟的LVDP降低了 50%)，從而不能用于這些實驗(數(shù)據(jù)未顯示)。圖2和3顯示來自分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值。對于所有組初始基線都相似。然而，與其初始基線相比，對于用PMN再灌注的I/R心臟，終LVDP和+dP/dt_ (再灌注后45分鐘)分別顯著地減少了(p〈0. 01) 47 土 7%和41 土 7%。PKC ^肽抑制劑(2.5UM和5yM濃度)顯著地減弱了與使用PMN的局部缺血后的再灌注相關(guān)的LVDP和+dP/dtmax的下降。在接受5 u M的藥物的組中，對于終LVDP和+dP/dtmax，與其初始基線相比，心臟恢復(fù)至84±4%和76±5%。在2. 5 ii M觀察到最低有效劑量；與初始基線值相比，對于LVDP這些心臟恢復(fù)至83土4%，對于dP/dt_恢復(fù)至75土5%。在L-NAME (50 u M)存在的情況下，PKCC肽抑制劑(5yM)的心臟保護作用被阻斷。在再灌注后45分鐘，對于LVDP和+dP/dtmax，與其初始基線相比，心臟分別只恢復(fù)至58±7%和54±9%。這些心臟與IR+PMN組(47±7%和41 ±7%的LVDP、+dP/dtmax)相似。在再灌注后45分鐘，對于LVDP和+dP/dtmax，與其初始基線相比，在IuM PKcl肽抑制劑處理的心臟接觸I/R+PMN后分別只恢復(fù)至57±10%和46±6%。在該較低的劑量上，在再灌注后45分鐘時，這些心臟與對照I/R+PMN心臟無顯著差異。該模型中與I/R相關(guān)的心臟損傷與在45分鐘的再灌注期內(nèi)大量PMN浸潤心肌密切相關(guān)。在再灌注期間，大量PMN遷移入心肌，從假手術(shù)I/R心臟中低于25個PMN/mm2增加至在再灌注期結(jié)束時I/R+PMN心臟中超過180個PMN/mm2 (圖4a)。相反地，在1、2. 5和5 ii M上，I/R+PMN+PKC ^肽抑制劑處理的心臟分別經(jīng)歷了 20±6%、46±4%和48±3%的PMN浸潤入再灌注后的心肌組織的顯著減少(p〈0.01);且該效應(yīng)在L-NAME存在的情況下被阻斷。此外，2.5和M處理的心臟，與Iii M處理的心臟(p〈0. 01) (Fig. 4a)相比，具有顯著更少的浸潤的PMN。也在總的血管內(nèi)的和浸潤的PMN的評價中評估PMN對冠狀脈管內(nèi)皮的附著。如圖4b中所見，在I/R+PMN+PKC 4肽抑制劑心臟(5iiM)中附著至冠狀動脈內(nèi)皮的PMN的數(shù)目未顯著減少(43±10%，p〈0.06)(圖4b)。測量大鼠主動脈內(nèi)皮的NO釋放，用于確定PKC 4肽抑制劑是否通過涉及増加內(nèi)皮釋放NO的機制提 供心臟保護作用。在圖5中，PKC(肽抑制劑處理的內(nèi)皮產(chǎn)生，與基線NO釋放相比，顯著更多的NO，增加了 47土2%(2. 5 u M, p〈0. 05)、54±5%(5iiM，p〈0. 01)和 91±15%(15iiM，p〈0. 01)。在 Iy M 時，NO 釋放與基線 NO 釋放無顯著差異。こ酰膽堿(200nM)在NO測定中用作陽性對照，且與基線NO釋放相比，NO釋放顯著地增加了 67±4%(p〈0. 01)。為了將NO的基線釋放減少至0，將eNOS抑制劑L-NAME用作另ー種對照。通過用L-NAME (400 PM)處理內(nèi)皮組織完全抑制了こ酰膽堿和PKC 4肽抑制劑誘導的NO的產(chǎn)生。為了證實NO的來源歸因于內(nèi)皮組織，使用除去內(nèi)皮的(裸露的)大鼠主動脈節(jié)段與PKCC肽抑制劑(5iiM) —起溫育，該除去內(nèi)皮的大鼠主動脈節(jié)段與L-NAME處理的節(jié)段無差異。PKCC肽抑制劑的心臟保護效應(yīng)的另ー個機制可能涉及過氧化物釋放的抑制。除了在I U M (在該處與PMA刺激的大鼠PMN的懸浮液無差異)，PKC ^肽抑制劑顯著抑制過氧化物的釋放達33-82%(2. 5-15 u M, p〈0. 01)(圖6)。SOD (10 u g/mL)在過氧化物測定中用作陽性對照，由PMA刺激的大鼠PMN產(chǎn)生的過氧化物釋放下降99%(p〈0. 01;圖6)。實施例2-PKC ^ 11的肽抑制劑的作用基本上如實施例I中對于PKC ^肽抑制劑所描述的ー樣進行使用PKC P II肽抑制劑的實驗。使用下列分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟組組I :假手術(shù)I/R心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注，但在進入灌注的第35分鐘(在相同的時間點給I/R心臟提供5mL血漿，15分鐘的基線記錄和20分鐘的局部缺血)用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注。這些心臟代表對照組(n=6)，用于確定所述分離的大鼠心臟在整個80分鐘的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax。組2:假手術(shù)I/R+PKCP II肽抑制劑(10 U M)心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注。在進入灌注的第35分鐘給這些心臟施用PKCP II肽抑制劑(10 u Mjf 5mM在水中配制的母液溶解在血漿中)。該組(n=6)用于確定PKC ^ II肽抑制劑是否引起強心或心臟功能抑制作用。組3:將I/R心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注，但不用PMN進行灌注。這些心臟代表了對照組(n=6)，所述對照組用于確定在20分鐘的局部缺血后進行再灌注是否使心臟昏迷，但在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax將恢復(fù)至基線值(初始值)。組4:將I/R+PKC ^ II肽抑制劑(10 U M，溶解在血漿中)心臟接受20分鐘的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL的血漿+PKC ^ II肽抑制劑灌注這些心臟。該組(n=6)用于確定PKCP II肽抑制劑是否在無PMN的I/R背景中引起心臟功能抑制效應(yīng)。組5:將I/R+PMN心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)和PMN (重懸浮于5mL Krebs緩沖液中)進行灌注。這些心臟代表了對照組(n=9)，所述對照組用于確定在20分鐘的局部缺血后在PMN(200xl06)存在的情況下進行45分鐘的再灌注是否在整個45分鐘的再灌注期導致，與初始基線值相比，持續(xù)的心肌收縮功能障礙。組6:將I/R+PMNs+PKC ^ II肽抑制(I U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用I y M PKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中 )和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定PKCP II肽抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組7:將I/R+PMNs+PKC ^ II肽抑制劑(5 U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5 ii M PKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高PKCP II抑劑濃度上的PKCP II肽抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=7)。組8:將I/R+PMNs+PKCP II肽抑制劑(10 U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用10 ii M PKC P II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高PKCP II肽抑制劑濃度上的PKCP II抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=7)。組9:將 I/R+PMNs+PKCP II 肽抑制劑(10 y M)+Ng-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME，50 u M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用10 ii M PKC P II肽抑制劑(溶解在5mL血漿中)和50 ii M L-NAME (將50mM的水中配制的母液溶解在Krebs緩沖液中)和PMN(200xl06)進行灌注。在整個45分鐘的再灌注期間將L-NAME (50yM)連續(xù)地灌注入心臟。這些心臟代表了用于確定PKCP II肽抑制的心臟保護效應(yīng)是否可用ー氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)阻斷的組(n=6)。前面的研究顯示，給予PMN的假手術(shù)I/R心臟，與初始對照值相比，沒有顯示變化(Lefer等人，Circulation 100:178-184，1999)。在再灌注后45分鐘中姆5分鐘記錄數(shù)據(jù)。在進行每個實驗之后，分離左心室，將其在4%的多聚甲醛中固定并在4°C下貯存以用于以后的組織學分析。圖7顯示假手術(shù)I/R、I/R、I/R+PMN+PKC ^ II抑制劑(10 U M)和I/R+PMN組的心肌收縮功能(LVDP)的時程和舉例說明了在80分鐘的灌注期期間LVDP的變化。假手術(shù)I/R組中的心臟在整個灌注期期間保持在初始基線值的103±4%。I/R組中的心臟在再灌注的初始階段期間經(jīng)歷了 LVDP的降低，但在再灌注結(jié)束時，其已恢復(fù)至初始基線值的94±6%。然而，I/R+PMN組中的心臟展示嚴重的心肌收縮功能障礙，在再灌注結(jié)束時只恢復(fù)至初始基線值的43±5%。相反地，I/R+PMN+PKC@ II肽抑制劑(IOyM)中的心臟，盡管最初在進入再灌注的第15分鐘時顯示LVDP降低為初始基線值的61 ±10%，但恢復(fù)至基線的82±9%。為了確定PKCP II肽抑制劑是否對心肌收縮功能產(chǎn)生任何直接的收縮能效應(yīng)，用PKCP II肽抑制劑(IOyM)灌注假手術(shù)I/R心臟。該組用作用于所述研究的ー個對照。這些心臟在80分鐘的再灌注期結(jié)束時沒有顯示LVDP (圖8)或+dP/dtmax (圖9)的任何顯著變化，因此，表明在該劑量上，PKCP II肽抑制劑對心肌收縮功能沒有直接作用。對假手術(shù)I/R心臟進行20 ii M劑量的PKCP II肽抑制劑的檢測，在該劑量上沒有明顯的心臟功能抑制作用。圖8和9分別顯示來自分離的經(jīng)灌注的心臟的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值。所有研究的組的初始基線值之間沒有顯著的差異。在假手術(shù)I/R、I/R、假手術(shù)I/R+PKC3 II肽抑制劑(5 U M)和I/R+PKCP II肽抑制劑(10 u M)組的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值之間沒有顯著的差異。然而，I/R+PMN組的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值之間存在顯著差異。觀察到，在再灌注后45分鐘，LVDP顯著降低至初始基線的43±5%(p〈0. 01)，+dP/dtmax顯著降低至基線的42±6%(p〈0. 01)。以5 ii M和IOii M劑量存在的PKC P II肽抑制劑減弱了與使用 PMN的局部缺血后灌注相關(guān)的LVDP和+dP/dt_的降低。10 y M的劑量是最具心臟保護作用的，因為在再灌注后第45分鐘，I/R+PMN+PKC ^ II肽抑制劑(10 u M)中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別恢復(fù)至初始基線的82±9%和79±10%。這些值與再灌注后45分鐘的I/R+PMN顯著不同(p〈0. 01)。盡管與10 y M劑量的程度不同，5 u M的劑量也具有心臟保護作用，因為在再灌注后第45分鐘，I/R+PMN+PKC ￠11肽抑制劑(5iiM)中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別恢復(fù)至初始基線的69±7%和63±7%。5iiM劑量的LVDP值與再灌注后第45分鐘的I/R+PMN顯著不同(p〈0. 05)。I y M劑量的PKCP II肽抑制劑不具有心臟保護作用，因為I/R+PMN+PKC @ II肽抑制劑(I U M)組中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別只恢復(fù)至57±4%和53±6%。I y M劑量組的LVDP和+dP/dtmax的終值與I/R+PMN組的終值沒有顯著差異。PKC 3 11肽抑制劑(IOu M)的心臟保護效應(yīng)被IR+PMN+PKC 3 II肽抑制劑(10 u M) +L-NAME (50 u M)組中存在的L-NAME (50 u M)阻斷，因為在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax值分別只有初始基線值的56 ±2%和53 ±5%，并且與IR+PMN組的終值無顯著差異(圖3和4)。測量來自大鼠主動脈內(nèi)皮的NO釋放以確定PKCP II肽抑制劑是否通過涉及増加內(nèi)皮NO釋放的機制提供心臟保護作用。
圖10顯示當在5iiM(p〈0. 05)和10uM(p<0. 01)上與基線NO釋放相比時，用PKCP II肽抑制劑處理的內(nèi)皮節(jié)段產(chǎn)生顯著更多的NO。測得NO釋放的基線值為I. 85±0. 18pmole N0/mg組織。存在用PKC@ II肽抑制劑刺激內(nèi)皮的明確的劑量響應(yīng)效應(yīng)，因為luM、2. 5iiM、5iiM和IOii M分別產(chǎn)生高于基線0. 75±0. 19、I. 91 ±0. 44、2. 54±0. 29 和 3. 49±0. 62pmole N0/mg 組織的 NO 釋放的增加。こ酰膽堿(Ach，500nM)在該測定中用作陽性對照且刺激所述內(nèi)皮產(chǎn)生高于基線基礎(chǔ)值的3. 75±0. 58pmole N0/mg組織的增加。為了將NO的基礎(chǔ)釋放減少至0，將L-NAME用作另ー種對照。通過用L-NAME (400 u M)處理內(nèi)皮完全抑制こ酰膽堿和PKC P II肽抑制劑誘導的NO的產(chǎn)生?？商峁㏄KC3 II肽抑制劑的心臟保護效應(yīng)(S卩，LVDP)的另ー種機制可能是PMN過氧化物釋放的抑制。PKCP II肽抑制劑顯著地抑制來自fMLP刺激的大鼠PMNS的懸浮物的過氧化物的釋放(即，吸光率)，對于5 ii M、10ii M和20 ii M的抑制劑，過氧化物的釋放從 0. 13±0.01 分別減少至0.05±0.009(ロ〈0.01)、0.02±0.004(ロ〈0.01)和0. 02±.007(p〈0. 01)(
圖11)。在IuM劑量上沒有顯著的過氧化物的抑制。SODdOu g/ml)用作陽性對照且其清除由fMLP刺激的大鼠PMN釋放的過氧化物，從而將響應(yīng)減少至0. 0016±0. 0006。 實施例3-PKC P II和PKC (的肽抑制劑的協(xié)同效應(yīng)基本上如實施例I和2中所描述的那樣進行使用PKC P II和PKC ^肽抑制劑的實驗。使用下列分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟組組I:假手術(shù)I/R心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注 ，但在進入灌注的第35分鐘(在相同的時間點給I/R心臟提供5mL血漿，15分鐘的基線記錄和20分鐘的局部缺血)用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注。這些心臟代表對照組(n=6)，用于確定所述分離的大鼠心臟在整個80分鐘的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax。組2:假手術(shù)I/R+PKC^ IKlOu M) +PKC ^ (5 U M)肽抑制劑(5 U M)心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注。在進入灌注的第35分鐘給這些心臟施用PKCP II和PKC ^肽抑制劑(分別為10 ii M和5 ii M，將在水中配制的5mM母液溶解在血漿中)。該組(n=6)用于確定肽抑制劑是否引起強心或心臟功能抑制作用。組3:使I/R心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注，但不用PMN進行灌注。這些心臟代表了對照組(n=6)，所述對照組用于確定在20分鐘的局部缺血后進行再灌注是使心臟昏迷，但在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax將恢復(fù)至基線值(初始值)。組4:將I/R+PKCP II(10iiM)+PKC4 (5 U M)肽抑制劑(溶解在血漿中)心臟接受20分鐘的局部缺血但不用PMN灌注。在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL的血漿+PKC^ 11+PKC ^肽抑制劑灌注這些心臟。該組(n=6)用于確定所述肽抑制劑是否在無PMN的I/R背景中引起心臟功能抑制效應(yīng)。組5:將I/R+PMN心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)和PMN (重懸浮于5mL Krebs緩沖液中)進行灌注。這些心臟代表了對照組(n=ll)，所述對照組用于確定在20分鐘的局部缺血后在PMN(200x IO6)存在的情況下進行45分鐘的再灌注在整個45分鐘的再灌注期是否導致，與初始基線值相比，持續(xù)的心肌收縮功能障礙。組6:將 I/R+PMN+PKC^ II (5 U M) +PKC ^ (2. 5 U M)肽抑制劑心臟接受 20 分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用IiiMPKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定PK⑶II抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=7)。組7:將 I/R+PMNs+PKCP II (IOiiM)+PKC 4 (2. 5 u M)肽抑制劑心臟接受 20 分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5 ii MPKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高PKCP II肽抑劑濃度上的PKC3 II抑制在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組8:將 I/R+PMNs+PKCP II (IOiiM)+PKC 4 (5 u M)肽抑制劑心臟接受 20 分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用10 ii M PKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高PKCP II肽抑劑濃度上的PKC3 II抑制在減弱PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=7)。組9:將 I/R+PMNs+PKC ^ II(IOuM) +PKC ^ (5 u M)肽抑制劑 +Ng-硝基-L-精氨酰甲酯(L-NAME，50 PM)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用IOuM PKC P II和5 ii M PKC 4肽抑制劑(溶解在5mL血漿中)和50 y M L-NAME (將在水中配制的50mM母液溶解在Krebs緩沖液中)和PMN(200xl06)進行灌注。在整個45分鐘的再灌注期間將L-NAME (50 PM)連續(xù)地灌注入心臟。這些心臟代表了用于確定所述肽抑制劑的心臟保護效應(yīng)是否可用ー氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)阻斷的組(n=5)。根據(jù)
圖12的時程，PKC @ II(IOiiM)和PKC 4 (5 U M)肽抑制劑的組合導致了與I/R心臟的恢復(fù)速率匹配的恢復(fù)速率。當單獨使用PKCP II (10 ii M)或PKC ^ (5 u M)肽抑制劑(實施例I和2)時沒有觀察到該結(jié)果，在所述實施例中，所述肽抑制劑處理的心臟的恢復(fù)速率比I/R心臟的恢復(fù)速率慢。
圖13和14顯示分別來自分離的經(jīng)灌注的心臟的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值。如所預(yù)期的和與實施例I和2相似，在45分鐘再灌注后，I/R+PMN組的LVDP和dP/dtmax的初始值和終值發(fā)生了顯著改變，與初始基線相比，LVDP下降了大約50%(p〈0. 01)，+dP/dtmax 下降了大約 45%(p〈0. 01)。PKCP II和PKCC肽抑制劑的存在減弱了與使用PMN的局部缺血后灌注相關(guān)的LVDP和+dP/dtmax的降低。IOuM PKCP II和5 ii M PKC 4肽抑制劑劑量是最具心臟保護作用的，將PKCP II肽抑制劑劑量從5 u M增加至10 ii M不導致心臟保護效應(yīng)的顯著改變。在另一方面，將PKC ^肽抑制的劑量從2. 5 ii M增加至5 ii M導致心臟保護效應(yīng)的邊際性地(marginal)增加。PKCMI和PKC (肽抑制劑組合的心臟保護效應(yīng)被IR+PMN+PKCP II(10iiM)+PKC4 (5iiM)肽抑制劑 +L-NAME (50 y M)組中存在的L-NAME (50 u M)阻斷，因為在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax值分別只有初始基線值的50%和40%，與IR+PMN組的終值無顯著差異(
圖13和14)。該模型中與I/R相關(guān)的心臟損傷與在45分鐘的再灌注期內(nèi)大量PMN浸潤心肌密切相關(guān)。在再灌注期間，大量PMN遷移入心肌，再灌注期結(jié)束時從假手術(shù)I/R心臟中低于25個PMN/mm2增加至I/R+PMN心臟中超過175個PMN/mm2 (
圖15 )。相反地，I/R+PMN+PKCP II+PKC(肽抑制劑處理的心臟經(jīng)歷了 PMN浸潤入再灌注后的心肌組織的顯著減少。該效應(yīng)在L-NAME存在的情況下被阻斷。此外，將PKCP II肽抑制劑的劑量從5 ii M加倍至10 u M，同時將PKC ;肽抑制劑的劑量保持在2. 5 ii M，未顯著地減少PMN浸潤。在另一方面，將PKC ^肽抑制劑的劑量從2. 5 ii M加倍至5 u M，同時將PKC P II肽抑制劑的劑量保持在10 u M，邊際性地減少了 PMN浸潤(
圖15)。也在總的血管內(nèi)的和浸潤的PMN的評價中評價PMN對冠狀動脈內(nèi)皮的附著。如
圖16中所見，在I/R+PMN+PKC P 11+PKC ;肽抑制劑心臟中附著至冠狀動脈內(nèi)皮的PMN的數(shù)目減少。該保護效應(yīng)在L-NAME存在的情況下被逆轉(zhuǎn)。在
圖17中，用PKC 3 II和PKC 4肽抑制劑特別是以IOiiM PKC 3 II和5 ii M PKCC肽抑制劑的劑量處理的心臟內(nèi)皮產(chǎn)生，與基線NO釋放相比，顯著更多的NO。こ酰膽堿(500nM)在NO測定中用作陽性對照，其與基線NO釋放相比，顯著增加了 NO釋放。為了將NO的基線釋放減少至0，將L-NAME用作另ー種對照。通過用L-NAME (400 u M)處理內(nèi)皮組織完全抑制了こ酰膽堿和肽抑制劑誘導的NO的產(chǎn)生。PKCP II和PKC (肽抑制劑的心臟保護效應(yīng)的另ー個機制可能涉及過氧化物釋放的抑制。如從
圖18中所見，當與PMA刺激的大鼠PMN的懸浮物相比或當與単獨使用的PKCP II或PKC (肽抑制劑相比吋，PKCP II和PKC (肽抑制的組合顯著地抑制了過氧化物的釋放。S0D(10ii g/mL)在過氧化物測定中用作陽性對照，其將由PMA刺激的大鼠PMN產(chǎn)生的過氧化物釋放減少了 99% (
圖18)。所述實施例都顯示足夠量的PKC P II肽抑制劑和/或PKC (肽抑制劑的存在都通過減輕PMN誘導的心臟功能障礙來提供顯著的心臟保護效應(yīng)。實施例4-PKCS的肽激活物的效應(yīng)
基本上如實施例I中對于PKC 4肽抑制劑所描述的那樣進行使用PKC S肽激活物的實驗。使用下列分離的經(jīng)灌注的大鼠心臟組組I :假手術(shù)I/R心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注，但在進入灌注的第35分鐘用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注(在相同的時間點給I/R心臟提供5mL血衆(zhòng)，15分鐘的基線記錄和20分鐘的局部缺血)。這些心臟代表用于確定所述分離的大鼠心臟在整個80分鐘的方案中是否可保持LVDP和+dP/dtmax的對照組(n=6)。組2:假手術(shù)VR+PKC 6肽激活物(10 ii M)心臟不接受局部缺血和不用PMN進行灌注。在進入灌注的第35分鐘給這些心臟施用PKC 6肽激活物(10 u M，將5mM的在水中配制的母液溶解在血漿中)。該組(n=6)用于確定PKC S肽激活物是否引起強心或心臟功能抑制作用。組3:將I/R心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)進行灌注，但不用PMN灌注。這些心臟代表了對照組(n=6)，所述對照組用于確定在20分鐘局部缺血后進行再灌注是使心臟昏迷，但在45分鐘的再灌注期結(jié)束時LVDP和+dP/dtmax將恢復(fù)至基線值(初始值)。組4:將I/R+PKC 6肽激活物(10 u M，溶解在血漿中)心臟接受20分鐘的局部缺血但不用PMN進行灌注。在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL的血漿+PKC S肽激活物灌注這些心臟。該組(n=6)用于確定PKC S肽激活物是否在無PMN的I/R背景中引起心臟功能抑制效應(yīng)。組5:將I/R+PMN心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5mL血漿(ImL/分鐘)和PMN (重懸浮于5mL Krebs緩沖液中)進行灌注。這些心臟代表了對照組(n=10)，所述對照組用于確定在20分鐘的局部缺血后在PMN(200xl06)存在的情況下進行45分鐘的再灌注在整個45分鐘的再灌注期是否導致，與初始基線值相比，持續(xù)的心肌收縮功能障礙。組6:將I/R+PMNs+PKC 6肽激活物(I u M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用I y M PKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定PKC S肽激活在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。組7:將I/R+PMNs+PKC 6肽激活物(5 u M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用5 ii M PKCP II肽抑制劑(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高的PKC S肽激活物濃度上的PKC S激活在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。
組8:將I/R+PMNs+PKC 6肽激活物(10 U M)心臟接受20分鐘的局部缺血并在再灌注的第一個5分鐘期間用IOiiM PKC 6肽激活物(溶解在血漿中)和PMN(200x IO6)進行灌注。這些心臟代表了用于確定更高PKC S肽激活物濃度上的PKC S激活在減輕PMN誘發(fā)的心肌收縮功能障礙中的作用的組(n=6)。前面的研究顯示在給予PMN的假手術(shù)I/R心臟，與初始對照值相比，沒有表現(xiàn)出變化(Lefer等人，Circulation 100:178-184,1999)。在再灌注后的45分鐘中姆5分鐘記錄數(shù)據(jù)。在進行每個實驗之后，分離左心室，將其在4%的多聚甲醛中固定并在4°C下貯存以備用于以后的組織學分析。
圖19 顯示了假手術(shù) I/R、I/R、I/R+PMN+PKC 8 激活物(10 u M)和 I/R+PMN 組的心肌收縮功能(LVDP)的時程和舉例說明了在80分鐘的灌注期期間LVDP的變化。假手術(shù)I/R組中的心臟的LVDP在整個灌注期期間保持在初始基線值的103±4%。I/R組中的心臟在再灌注的初始階段期間經(jīng)歷了 LVDP的降低，但在再灌注末期，其已恢復(fù)至初始基線值的82±3%。然而，I/R+PMN組中的心臟表現(xiàn)了嚴重的心肌收縮功能障礙，在再灌注結(jié)束時只恢復(fù)至初始基線值的46±9%。相反地，I/R+PMN+PKC S激活物(IOyM)中的心臟，盡管最初顯示在進入再灌注的第15分鐘LVDP降低為初始基線值的58±8%，但恢復(fù)至基線的83±3%。為了確定PKC S激活物是否對心肌收縮功能產(chǎn)生任何直接的收縮能效應(yīng)，用PKC 6激活物(IOyM)灌注假手術(shù)I/R心臟。該組用作所述研究的ー個對照。這些心臟在80分鐘的再灌注期結(jié)束時沒有顯示LVDP (圖20)或+dP/dtmax(圖21)的任何顯著變化，因此，表明在該劑量上，PKC 6肽激活物對心肌收縮功能沒有直接作用。圖20和21顯示分別來自分離的經(jīng)灌注的心臟的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值。所有研究的組的初始基線值之間沒有顯著的差異。在假手術(shù)I/R、I/R、假手術(shù)I/R+PKC 6肽激活物和I/R+PKC 6肽激活物(10 u M)組的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值之間沒有顯著的差異。然而，I/R+PMN組的LVDP和+dP/dtmax的初始值和終值之間存在顯著差異。觀察到在45分鐘的再灌注后，LVDP顯著地降低至初始基線的46±9%(p〈0. 01)，+dP/dtmax顯著地降低至初始基線值的45±8%(p〈0. 01)。以5iiM和IOii M劑量存在的PKC S肽激活物減弱了與使用PMN的局部缺血后灌注相關(guān)的LVDP和+dP/dt_的降低。10 y M的劑量是最具心臟保護作用的，因為在再灌注后第45分鐘，I/R+PMN+PKC 6肽激活物(10 u M)中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別恢復(fù)至初始基線的83±3%和79±5%。這些值在再灌注后第45分鐘與I/R+PMN顯著不同(p〈0. 01)。盡管與10 y M劑量的程度不同，5 u M的劑量也具有心臟保護作用，因為在再灌注后第45分鐘，I/R+PMN+PKC 6肽激活物(5 u M)中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別恢復(fù)至初始基線的80±9%和67±7%。再灌注后第45分鐘5 ii M劑量的LVDP值與I/R+PMN顯著不同(p〈0. 05)。
IU M劑量的PKC 6肽激活物不具有心臟保護作用，因為I/R+PMN+PKC 6肽激活物(I u M)組中的心臟的LVDP和+dP/dtmax分別只恢復(fù)至60土 13%和51 土5%。I y M劑量組的LVDP和+dP/dtmax的終值與I/R+PMN組的終值沒有顯著差異?？商峁㏄KC 8肽激活物的心臟保護效應(yīng)(即LVDP)的機制可能是PMN的過氧化物釋放的抑制。PKC 6肽激活物顯著地抑制來自PMA刺激的大鼠PMNS的懸浮物的過氧化物的釋放(即，吸光率)，對于5 ii M和10 ii M的抑制劑，過氧化物的釋放從0. 49 ±0. 03分別減少至 0. 32±0. 03(p〈0. 01)、0. 32±0. 02(p〈0. 01)(圖 22)。在 I U M 劑量上沒有顯著的過氧化物的抑制。盡管此處已明確地描述了本發(fā)明的某些目前優(yōu)選的實施方案，但對于與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來說，很明顯的是可進行此處顯示的和描述的各種實施方案的變化和改變而不背離本發(fā)明 的精神和范圍。因此，本發(fā)明只限定于由所附的權(quán)利要求和適用的法律的規(guī)則所要求的程度。
權(quán)利要求
1.用于器官保存用的灌注、保存和/或再灌注的溶液，其包含蛋白激酶Cζ(PKCζ)的至少一種肽抑制劑。
2.權(quán)利要求I的溶液，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
3.權(quán)利要求I的溶液，其還包含氯化鉀。
4.權(quán)利要求I的溶液，其中所述PKCC的至少一種肽抑制劑選自SEQID N0:2和G66983。
5.權(quán)利要求I的溶液，其中所述PKCζ的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ M0
6.權(quán)利要求I的溶液，其中所述器官是心臟。
7.權(quán)利要求I的溶液，其中所述器官是哺乳動物的器官。
8.權(quán)利要求7的溶液，其中所述哺乳動物是人。
9.權(quán)利要求I的溶液，其中保存所述器官以用于移植。
10.權(quán)利要求I的溶液，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
11.用于保存移植用器官的方法，其包括用權(quán)利要求1-10任一項的溶液灌注所述器官的步驟。
12.權(quán)利要求11的方法，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
13.權(quán)利要求11的方法，其還包括氯化鉀。
14.權(quán)利要求11的方法，其中PKCC的至少一種肽抑制劑選自SEQID ΝΟ:2和G66983。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述PKCζ的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ Μ。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述器官是心臟。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述器官是哺乳動物的器官。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述哺乳動物是人。
19.權(quán)利要求11的方法，其中保存所述器官以用于移植。
20.權(quán)利要求11的方法，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
21.權(quán)利要求11的方法，其還包含將所述器官浸沒在權(quán)利要求1-10任一項的溶液中的步驟。
22.權(quán)利要求11的方法，其中以低于20mL/分鐘的速率進行灌注步驟。
23.權(quán)利要求11的方法，其中以ImL/分鐘的速率進行灌注步驟。
24.權(quán)利要求11的方法，其中所述灌注步驟是逆行灌注。
25.權(quán)利要求11的方法，其中所述灌注步驟持續(xù)5分鐘。
26.權(quán)利要求1-10任一項的溶液制備用于保護局部缺血的器官免受損傷的藥物的用途，所述藥物用于灌注所述器官。
27.權(quán)利要求26的用途，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
28.權(quán)利要求26的用途，其還包括氯化鉀。
29.權(quán)利要求26的用途，其中PKCζ的至少一種肽抑制劑選自SEQ ID ΝΟ:2和Go69830
30.權(quán)利要求26的用途，其中所述PKCζ的的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ Μ。
31.權(quán)利要求26的用途，其中所述器官是心臟。
32.權(quán)利要求26的用途，其中所述器官是哺乳動物的器官。
33.權(quán)利要求32的用途，其中所述哺乳動物是人。
34.權(quán)利要求26的用途，其中保存所述器官以用于移植。
35.權(quán)利要求26的用途，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
36.權(quán)利要求26的用途，其還包含將所述器官浸沒在權(quán)利要求1-10任一項的溶液中的步驟。
37.權(quán)利要求26的用途，其中以低于20mL/分鐘的速率進行灌注步驟。
38.權(quán)利要求26的用途，其中以ImL/分鐘的速率進行灌注步驟。
39.權(quán)利要求26的用途，其中所述灌注步驟是逆行灌注。
40.權(quán)利要求26的用途，其中所述灌注步驟持續(xù)5分鐘。
41.權(quán)利要求1-10任一項的溶液制備用于減輕局部缺血后器官功能障礙的藥物的用途，所述藥物用于灌注所述器官。
42.權(quán)利要求41的用途，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
43.權(quán)利要求41的用途，其還包括氯化鉀。
44.權(quán)利要求41的用途，其中PKCζ的至少一種肽抑制劑選自SEQ ID ΝΟ:2和Go69830
45.權(quán)利要求41的用途，其中所述PKCζ的的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ Μ。
46.權(quán)利要求41的用途，其中所述器官是心臟。
47.權(quán)利要求41的用途，其中所述器官是哺乳動物的器官。
48.權(quán)利要求47的用途，其中所述哺乳動物是人。
49.權(quán)利要求41的用途，其中保存所述器官以用于移植。
50.權(quán)利要求41的用途，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
51.權(quán)利要求41的用途，其還包含將所述器官浸沒在權(quán)利要求1-10任一項的溶液中的步驟。
52.權(quán)利要求41的用途，其中以低于20mL/分鐘的速率進行灌注步驟。
53.權(quán)利要求41的用途，其中以ImL/分鐘的速率進行灌注步驟。
54.權(quán)利要求41的用途，其中所述灌注步驟是逆行灌注。
55.權(quán)利要求41的用途，其中所述灌注步驟持續(xù)5分鐘。
56.權(quán)利要求1-10任一項的溶液制備用于在局部缺血的器官中維持一氧化氮釋放的藥物的用途，所述藥物用于灌注所述器官。
57.權(quán)利要求56的用途，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
58.權(quán)利要求56的用途，其還包括氯化鉀。
59.權(quán)利要求56的用途，其中PKCζ的至少一種肽抑制劑選自SEQ ID ΝΟ:2和G66983。
60.權(quán)利要求56的用途，其中所述PKCζ的的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ Μ。
61.權(quán)利要求56的用途，其中所述器官是心臟。
62.權(quán)利要求56的用途，其中所述器官是哺乳動物的器官。
63.權(quán)利要求62的用途，其中所述哺乳動物是人。
64.權(quán)利要求56的用途，其中保存所述器官以用于移植。
65.權(quán)利要求56的用途，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
66.權(quán)利要求56的用途，其還包括將所述器官浸沒在權(quán)利要求1-10任一項的溶液中的步驟。
67.權(quán)利要求56的用途，其中以低于20mL/分鐘的速率進行灌注步驟。
68.權(quán)利要求56的用途，其中以ImL/分鐘的速率進行灌注步驟。
69.權(quán)利要求56的用途，其中所述灌注步驟是逆行灌注。
70.權(quán)利要求56的用途，其中所述灌注步驟持續(xù)5分鐘。
71.權(quán)利要求1-10任一項的溶液制備用于在從循環(huán)系統(tǒng)分離后保護器官免受損傷的藥物的用途，所述藥物用于灌注所述器官。
72.權(quán)利要求71的用途，其中將所述肽抑制劑溶解在鹽溶液中。
73.權(quán)利要求71的用途，其還包括氯化鉀。
74.權(quán)利要求71的用途，其中PKC4的至少一種肽抑制劑選自SEQID NO:2和G56983。
75.權(quán)利要求71的用途，其中所述PKCζ的的至少一種肽抑制劑的濃度是2. 5-5 μ Μ。
76.權(quán)利要求71的用途，其中所述器官是心臟。
77.權(quán)利要求71的用途，其中所述器官是哺乳動物的器官。
78.權(quán)利要求77的用途，其中所述哺乳動物是人。
79.權(quán)利要求71的用途，其中保存所述器官以用于移植。
80.權(quán)利要求71的用途，其中所述肽抑制劑是十四烷基化的。
81.權(quán)利要求71的用途，其還包括將所述器官浸沒在權(quán)利要求1-10任一項的溶液中的步驟。
82.權(quán)利要求71的用途，其中以低于20mL/分鐘的速率進行灌注步驟。
83.權(quán)利要求71的用途，其中以ImL/分鐘的速率進行灌注步驟。
84.權(quán)利要求71的用途，其中所述灌注步驟是逆行灌注。
85.權(quán)利要求71的用途，其中所述灌注步驟持續(xù)5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于保存、灌注和/或再灌注用于移植的器官特別是心臟的溶液。該溶液包含蛋白激酶CβII(PKCβII)和/或蛋白激酶Cζ(PKCζ)的肽抑制劑和/或蛋白激酶Cδ(PKCδ)的肽激活物。也公開了使用本發(fā)明的溶液的用途，包括用于保存移植用的器官、用于保護局部缺血的器官免受損傷、用于減輕局部缺血后器官的功能障礙、用于在局部缺血的器官中維持一氧化氮的釋放和/或抑制過氧化釋放以及用于當從循環(huán)系統(tǒng)分離時保護器官免受損傷的用途。
文檔編號A01N1/02GK102763638SQ20121014418
公開日2012年11月7日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日
發(fā)明者L·H·揚 申請人:整骨療法費城醫(yī)學院