專利名稱：與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
養(yǎng)豬業(yè)是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)的主體，其產(chǎn)值長(zhǎng)期以來始終都是畜牧業(yè)總產(chǎn)值的第一位。隨著人們生活水平的提高，對(duì)肉食品的數(shù)量和質(zhì)量需求不斷提高，如何培育出生長(zhǎng)速度 快并且肉質(zhì)風(fēng)味好的豬種成為當(dāng)前豬育種工作的熱點(diǎn)。我國(guó)豬種資源豐富，為豬育種提供良好的素材，也為研究重要的與經(jīng)濟(jì)相關(guān)性狀的基因和分子標(biāo)記提供良好的材料。藏豬是我國(guó)特有的高原型豬種，體小皮薄、肉嫩味美，風(fēng)味濃郁，肉質(zhì)細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特，素有“高原之珍”的美譽(yù)(劉軒，強(qiáng)巴央宗，王強(qiáng)等.藏豬繁殖性狀多基因效應(yīng)分析.遺傳，2010，32 (5) :480-485)。藏豬產(chǎn)于我國(guó)青藏高原海拔250(T4300m區(qū)域，對(duì)高原低氧、低溫和粗放的飼養(yǎng)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性，是發(fā)展我國(guó)高海拔地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的重要品種資源。滇南小耳豬是云南省西雙版納州小型地方品種，具有適應(yīng)熱帶雨林地區(qū)高溫潮濕的生態(tài)環(huán)境，早熟易肥、屠宰率高、抗逆性強(qiáng)、皮薄骨細(xì)、肉質(zhì)鮮嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)。藏豬和滇南小耳豬均是小型地方品種，是研究豬生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀基因的良好材料。隨著分子數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān)分子遺傳標(biāo)記和標(biāo)記輔助選擇的研究被廣泛開展，并在畜禽育種中應(yīng)用，產(chǎn)生了巨大的影響。生長(zhǎng)性狀是豬育種中選擇的主要目標(biāo)之一，不同品種或類型的豬生長(zhǎng)速度有明顯的差別。從分子水平上鑒定影響生長(zhǎng)速度的基因或標(biāo)記是目前豬功能基因研究的熱點(diǎn)之一(姜運(yùn)良，李寧，杜立新，吳常信.豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因5’調(diào)控區(qū)T —A突變與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系分析.遺傳學(xué)報(bào).2002，29(5):413 416)。研究者曾通過對(duì)基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析，認(rèn)為生長(zhǎng)激素基因(PaszekAA, Wilkie P J, Wilkie P J, Flickinger G H, et al. Intervalmappingof growth in divergent swine cross. Mamm Genome. 1999,10(02) :117 122 ;Bidanel J P， Milan D， Iannuccelli N， et al.Detection ofquantitative traitloci for growth and fatness in pigs. Genet SeIEvoI. 2001,5-6,33 (03) :289 309 ;LEE S J，McPherron A C. Myostatinand the control of skeletal muscle mass. CurrOpin Genet Dev. 1999，9 (05) :604-607)、類胰島素生長(zhǎng)因子 I 基因、PITl 基因(Yu T P，SchmitzC B，Rothschild M F，Tuggle C K. Association of PITl poIymorphismswithgrowth and carcass traits in pigs. J Anim Sci. 1995，73(05):1282 1288)、MC4R基因(Kim K S，Larsen N，Short T，et al. Amissense variant of the porcinemelanocortin-4receptor(MC4R)gene isassociated with fatnsee growth,and feedintake traits. Mamm Genome. 2000，11:131 135)和痩素受體(Kennes Y M，Murphy B D，PothierFiPalin M F. Characterization of swine leptin(LEP)polymorphisms andtheirassociation with production traits. Anim Genet. 2001，32 (04) : 215-218)等與豬的生長(zhǎng)速度有關(guān)。但目前，在豬分子育種實(shí)踐中仍然缺少功能明確、效應(yīng)顯著的主效基因和分子標(biāo)記。生長(zhǎng)激素促分泌素受:體(growthhormone secretagogue receptor, GHSR)屬于α 螺旋 7 次跨膜的 G 蛋白偶聯(lián)受體(Herrington J, Hille B. Growth hormone-releasinghexapeptide elevates intracellular calciumresponse in rat somalotrophes bytwo mechanisms. Endocrinology. 1994,135 :1100-1108.)與生長(zhǎng)激素分泌素(Ghrelin)結(jié)合，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)速度(Howard A D, Feighner S D, Cully D F, etal. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormonerelease. Science, 1996, 273(5277) :974-977)?；谠摶蛟谏L(zhǎng)發(fā)育過程中起到的重要作用，因此將其作為豬生長(zhǎng)相 關(guān)的候選基因，采用PCR測(cè)序技術(shù)篩選不同類型豬群體間差異的SNP位點(diǎn)，從而建立起快速檢測(cè)方法，為尋找影響豬生長(zhǎng)性狀的SNP位點(diǎn)及相關(guān)分子遺傳標(biāo)記的開發(fā)提供了新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)所述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記的引物及含有該引物的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其位于豬GHSRla基因5’側(cè)翼區(qū)上，它的核苷酸序列如SEQ IDN0. I所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長(zhǎng)性狀相關(guān)，如果該堿基C突變?yōu)锳，則與豬慢速生長(zhǎng)性狀相關(guān)。本發(fā)明還提供用于檢測(cè)上述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記的引物，包括正向引物F5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’ 和反向引物 R5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’。本發(fā)明還提供上述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記在鑒定豬種中的應(yīng)用，其包括步驟1)提取待測(cè)豬的基因組DNA ；2)以待測(cè)豬的基因組DNA為模版，利用所述引物F和R，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出豬GHSRl a基因5’側(cè)翼區(qū)177bp片段；3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中151bp處的堿基為C，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度快的豬品種，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中151bp處的堿基為A，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度慢的豬品種。前述應(yīng)用中，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 μ I計(jì)為IOOng/μ I模板DNAl μ l，5pmol/y I 弓丨物 F和 R各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. O μ l,5U/y L Taq DNA聚合酶
0.5 μ 1，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1，余量為水。前述應(yīng)用中，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的條件為95°C 5分鐘；95°C 30秒，58°C 30秒，720C 20秒，36個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。前述應(yīng)用中，步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP法，具體為用內(nèi)切酶AccII對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果僅為一條帶，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度慢的豬品種，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)兩條帶，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度快的豬品種。本發(fā)明還提供含有所述引物F和R的用于檢測(cè)豬生長(zhǎng)速度的試劑盒。所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。優(yōu)選所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
本發(fā)明進(jìn)一步提供所述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記在豬分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用，既采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測(cè)序技術(shù)篩選到與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，并通過限制片段多態(tài)性(RFLP)方法來檢測(cè)待測(cè)豬的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行豬的選育，從而加快豬的育種進(jìn)程。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于(一)本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受豬的年齡、性別等限制，可用于豬的早期選育，甚至在豬剛出生時(shí)就可準(zhǔn)確地進(jìn)行選留，可大大縮短世代間隔，加快豬的育種進(jìn)程；(二)檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確。


圖I為本發(fā)明較佳實(shí)施例大約克豬與藏豬、滇南小耳豬GHSRl α基因5’側(cè)翼區(qū)序列比對(duì)結(jié)果。 圖2為本發(fā)明豬GHSRl α基因5’側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增結(jié)果；其中，瓊脂糖膠濃度為1% ;圖中泳道M為DM2000plus Marker ;泳道1_4為藏豬，泳道5_7為滇南小耳豬，泳道8_10為大
約克豬。圖3為本發(fā)明豬GHSRl α基因AccII-RFLP檢測(cè)結(jié)果；其中，瓊脂糖膠濃度為3% ；圖中泳道M為DM2000plus Marker ;泳道6為AA基因型，泳道2、5和7為AC基因型，泳道
1、3、8、9、10、11、12 和 13 為 CC 基因型。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I豬GHSRl α基因5’側(cè)翼序列片段的獲得及SNP位點(diǎn)篩選選擇中國(guó)地方品種“藏豬”(采自西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)牧場(chǎng))、“滇南小耳豬”(采自云南省西雙版納州滇南小耳豬資源保護(hù)場(chǎng))和引進(jìn)品種“大約克豬”(采自云南省昆明市云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)習(xí)豬場(chǎng))為試驗(yàn)材料。藏豬和滇南小耳豬生長(zhǎng)速度較慢，大約克豬生長(zhǎng)速度較快。根據(jù)Genbank中豬的GHSRla基因序列(登錄號(hào)NC_010455)，利用PrimerPremier 5. O軟件設(shè)計(jì)以下引物正向引物F : 5’ -AGCCGCTTAATACCAGTCTG-3’反向引物R : 5’ -TAGAACCTATCATCCGTCGTG-3’用上述弓丨物對(duì)藏豬、滇南小耳豬、大約克豬基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為 25yL，其中 10\ 0 反應(yīng)緩沖液2.5 4 1^，10臟01/1(1見13 mix 2. O μ L，5pmol/μ L 的正反向引物各 I μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L, DNA 模板 I μ L(DNA 約 IOOng)，加 dd H2O至25 μ L。PCR反應(yīng)條件為第I步95° C變性5min ;第2步95° C變性30s ;第3步58° C復(fù)性30s ;第4步72° C延伸30s ;重復(fù)第2至第4步36個(gè)循環(huán)，之后再72° C延伸7min，最后降溫至4° C保存。對(duì)上述3個(gè)豬種的PCR產(chǎn)物經(jīng)Gel Extraction Kit試劑盒(購自上海生物工程技術(shù)有限公司，按照試劑盒說明書操作)純化。每個(gè)豬種分別選10個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)體的PCR產(chǎn)物各取8 μ L，混池成一個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序(北京諾賽生物科技公司)。上述PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為869bp，如SEQ ID NO. 6所示。三個(gè)豬種的測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)，其中位于該P(yáng)CR擴(kuò)增片段的第48bp處(位于5’側(cè)翼區(qū)-1595bp處)的C堿基突變?yōu)锳堿基(圖I)，該突變位點(diǎn)可被Acc II內(nèi)切酶(識(shí)別序列為CGCG)識(shí)別。
實(shí)施例2豬GHSRl α基因5’側(cè)翼區(qū)多態(tài)性PCR-RFLP檢測(cè)方法建立為了快速方便的檢測(cè)豬GHSRl α基因5’側(cè)翼區(qū)_1595bp處多態(tài)性，針對(duì)實(shí)施例I中發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)新的擴(kuò)增引物，引物序列為正向引物F : 5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’反向引物 R : 5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’用該對(duì)弓丨物對(duì)藏豬、滇南小耳豬、大約克豬等基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為 25μ L，其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ L, 10mmol/L dNTP mix2. O μ L，5pmol/μ L 的引物各
Iμ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 5 μ L，DNA 模板 I μ L (DNA 約 IOOng)，加 dd H2O M 25 μ L0PCR反應(yīng)條件為第I步95° C變性5min;第2步95° C變性30s ;第3步58° C復(fù)性30s ;第4步72° C延伸20s ;重復(fù)第2至第4步36個(gè)循環(huán)，之后再72° C延伸7min，最后降溫至4° C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴(kuò)增效果，可見到片段大小為177bp的清晰條帶(圖2)。該P(yáng)CR產(chǎn)物用AccII內(nèi)切酶酶切，反應(yīng)體系為10X反應(yīng)緩沖液I μ L，AccII內(nèi)切酶O. 25 μ L(濃度為IOU/μ L)，PCR產(chǎn)物4 μ LjPdd H2O至10 μ L。37° C環(huán)境中酶切4_8h。然后，將得到的酶切產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)中觀察(圖3)，判斷基因型。當(dāng)擴(kuò)增片段的151bp處堿基均為C時(shí)，AccII內(nèi)切酶可識(shí)別該位點(diǎn)，即可將PCR擴(kuò)增片段切成兩個(gè)片段，一個(gè)為150bp，另一個(gè)片段為27bp，該基因型記為CC型；當(dāng)151bp處的堿基都為A時(shí)，Acc II內(nèi)切酶不可識(shí)別，即PCR擴(kuò)增片段不能被切開，凝膠中只有一條帶，長(zhǎng)度為177bp，該基因型記為AA型；當(dāng)151bp處既含有C堿基又含有A堿基時(shí)，即凝膠電泳中含有三條帶，長(zhǎng)度分別為177bp，150bp和27bp，該基因型記為雜合型AC型。實(shí)施例3本發(fā)明篩選的遺傳標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性檢測(cè)采用實(shí)施例2中建立的PCR-RFLP技術(shù)，測(cè)定藏豬、滇南小耳豬、大約克豬群體GHSRl α基因5’側(cè)翼區(qū)_1595bp的PCR-Acc II -RFLP多態(tài)性分布，檢測(cè)結(jié)果如表I所示。表I豬GHSRl α基因5 ^偵彳翼區(qū)_1595bp位點(diǎn)多態(tài)性分布
品- 樣品教基
ΛΛ AC’ CCAC
藏豬45 0.62 0.29 0.09 0,77 0.23
> Η Ι^'ε 40 0.25 0—55 CUO (152 O—4S 龕夏著 45OOIO 藏豬和滇南小耳豬同屬生長(zhǎng)速度慢的豬品種，等位基因C頻率分別為23%和48%，而生長(zhǎng)速度快的品種大約克豬等位基因C頻率為100%。表I結(jié)果表明該基因位點(diǎn)的基因型和等位基因分布在不同生長(zhǎng)性能的豬群間差異明顯，可能與生長(zhǎng)性能相關(guān)。實(shí)施例4淮豬新品系GHSRla基因型與生長(zhǎng)速度的關(guān)聯(lián)分析
采集122頭淮豬新品系(采自安徽科鑫養(yǎng)豬育種有限公司，為該新品系的4世代群體)耳組織樣品，個(gè)體間無親緣關(guān)系，所有個(gè)體測(cè)定和計(jì)算達(dá)30kg體重的日齡和達(dá)90kg體重的日齡2個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)(表2)。表2淮豬新品系4世代生長(zhǎng)性能
權(quán)利要求
1.一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其特征在于，其位于豬GHSRl a基因5'側(cè)翼區(qū)上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長(zhǎng)性狀相關(guān)，如果該堿基C突變?yōu)锳，則與豬慢速生長(zhǎng)性狀相關(guān)。
2.用于檢測(cè)權(quán)利要求I所述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記的引物，其特征在于，包括正向引物F5 ' -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3 '和反向引物R5' -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3'。
3.權(quán)利要求I所述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記在鑒定豬種中的應(yīng)用，其包括步驟 1)提取待測(cè)豬的基因組DNA； 2)以待測(cè)豬的基因組DNA為模版，利用權(quán)利要求2所述引物F和R，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出豬GHSRl a基因5'側(cè)翼區(qū)177bp片段； 3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中151bp處的堿基為C，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度快的豬品種，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中151bp處的堿基為A，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度慢的豬品種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以 25 ii I 計(jì)為IOOng/ii I 模板 DNA I y 1，5pmol/y I 引物 F 和 R 各 I y 1，10mmol/L dNTPmix2. Ou l,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0. 5 yl，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2. 5 yl，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR反應(yīng)使用的條件為95°C5分鐘；95°C 30 秒，58 0C 30 秒，72 °C 20 秒，36 個(gè)循環(huán)；72°C 7 分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟3)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用RFLP法，具體為用內(nèi)切酶Acc II對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果僅為一條帶，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度慢的豬品種，檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)兩條帶，則待測(cè)豬屬于生長(zhǎng)速度快的豬品種。
7.含有權(quán)利要求2所述引物的用于檢測(cè)豬生長(zhǎng)速度的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
10.權(quán)利要求I所述與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記在豬分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記及其應(yīng)用，其位于豬GHSR1α基因5′側(cè)翼區(qū)上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，151bp處的堿基C與豬快速生長(zhǎng)性狀相關(guān)，如果該堿基C突變?yōu)锳，則與豬慢速生長(zhǎng)性狀相關(guān)。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和測(cè)序技術(shù)篩選到與豬生長(zhǎng)速度相關(guān)的遺傳標(biāo)記，并通過限制片段多態(tài)性(RFLP)方法來檢測(cè)待測(cè)豬的基因型，根據(jù)基因型進(jìn)行豬的選育，從而加快豬的育種進(jìn)程。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102649958SQ20121015726
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者史利華, 吳克亮, 張 浩, 李慶崗, 陶著 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)