專利名稱：一種人參高效組織培養(yǎng)和再生的方法
技術領域：
本發(fā)明為生物技術，特別是涉及一種人參高效組織培養(yǎng)和再生的方法。
背景技術：
植物組織培養(yǎng)是根據植物細胞具有全能性的理論，在近幾十年來發(fā)展起來的ー項無性繁殖新技木。植物的組織培養(yǎng)又稱為離體培養(yǎng)，是指從植物體分離出符合需要的組織、器官、細胞或原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其它產品的技術，也指在培養(yǎng)過程中從各種器官脫分化產生愈傷組織，愈傷組織經過再分化形成再生植物的過程。
自從1958年，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部細胞進行培養(yǎng)，最終獲得了完整的可育再生植株，從而證實了哈伯蘭特在五十多年前關于細胞全能的預言，已有大量植物已經可以通過組織培養(yǎng)技術獲得再生植株。植物組織培養(yǎng)技術，需要以植物體的某種組織或細胞為材料，在合適的培養(yǎng)基(誘導培養(yǎng)基)上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的組織或細胞一般脫分化形成愈傷組織，經過繼代培養(yǎng)，在合適的培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基)上，分化出芽、根等器官，進而形成可以脫離培養(yǎng)基獨立生活的完整再生植株。某些植物組織在組織培養(yǎng)過程中，在合適的培養(yǎng)條件下，可以不經過愈傷組織誘導階段，直接形成體細胞胚胎，隨后分化形成完整的再生植株。不同植物的組織培養(yǎng)，以及同種植物組織培養(yǎng)的不同階段，需要不同種類的基本培養(yǎng)基及激素?；九囵B(yǎng)基中含有各種大量元素、微量元素、有機物質(維生素、氨基酸等)、碳源等，常用的基本培養(yǎng)基有MS、B5、N6等。激素包括植物生長素類[如吲哚こ酸(IAA)、萘こ酸(NAA)、2，4- ニ氯苯氧こ酸(2，4-D)等]、細胞分裂素[如玉米素(Zt)、6_芐基嘌呤(6-BA或BAP)和激動素(Kt)]以及赤霉素[赤霉酸(GA3)]。MS培養(yǎng)基是ー種常用的植物組織培養(yǎng)基，可廣泛適用于多種植物的組織培養(yǎng)，其基本組成為
硝酸鉀(KNO3) 1900mg/L，硝酸銨(NH4N03) 1650mg/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 170mg/L,磷酸ニ氫鉀(KH2PO4) 370mg/L，氯化鈣(CaCl2*2H20) 440mg/L，硫酸錳(MnS04*4H20) 22. 3mg/し硫酸鋅(ZnS04*4H20) 8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化鉀(ΚΙ) O. 83mg/L，鑰酸鈉(Na2MoO4CH2O) 0. 25mg/L，硫酸銅(CuS04*5H20) O. 025mg/L，氯化鈷(CoC12*6H20) O.025mg/L，硫酸亞鐵(FeS04*7H20) 27. 8mg/L，Na2-EDTA 37. 3mg/L，甘氨酸 2mg/L，鹽酸硫胺素(Thiamine HCl) O. lmg/L,鹽酸批P多醇(Pyridoxine HCl) O. 5mg/L,煙酸(Nicotinicacid) 0. 5mg/L,肌醇(Inositol) lOOmg/L,鹿糖 30000mg/L,瓊脂 8000mg/L。

發(fā)明內容

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種人參、Panax ginseng)高效組織培養(yǎng)、再生的方法。是以人參植株的任何組織為外植體，其中特別以莖節(jié)為外植體產生的愈傷組織效率最高，經過誘導產生愈傷組織，這種愈傷組織可以在繼代培養(yǎng)基上長期旺盛生長，至少能夠繼代、擴大培養(yǎng)100次以上，這種愈傷組織大量產生可供制藥使用的多種人參次生代謝產物一人參皂甙、甾醇、多糖等。而且經過長期繼代培養(yǎng)之后的愈傷組織，在轉換培養(yǎng)條件為再生培養(yǎng)基時，仍能保持高效率的芽和根再生能力，并產生大量完整再生植株，可以在到土壤中繼續(xù)栽種。采用組織培養(yǎng)方法，從人參成株取材，經過組織培養(yǎng)產生愈傷組織，可以長期繼代產生大量愈傷組織；此種愈傷組織依次在適當的再生、生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，可以產生大量再生植株，作為種苗在土壌中栽種。取人參成株的任意組織(其中以莖節(jié)的愈傷組織誘導和植株再生效率最高)作為外植體，經過滅菌、接種到誘導培養(yǎng)基，一周后可以得到愈傷組織；此后每三周進行一次轉接到繼代培養(yǎng)基的繼代培養(yǎng)，使愈傷組織的產量不斷擴大。應用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可以使愈傷組織在多次繼代后，仍能保持旺盛的愈傷組織形成能力，以及較高的再生能力，當把愈傷組織轉移到誘導培養(yǎng)基上后，經過一段時間的誘導，可以從愈傷組織上產生大量綠點，隨后從綠點上分化出不定芽，形成芽叢，待芽叢生長到展開I厘米以上的幼葉時，將帶有幼葉的愈傷組織塊從誘導培養(yǎng)基上轉接到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)后從幼葉基部的愈傷組織中長出根，形成再生植株；在生根培養(yǎng)基中生長到合適大小的幼苗，可以經過煉苗后移栽到土壌中，成為可以獨立生活的植株。所用的愈傷組織誘導培養(yǎng)體系為MS基本培養(yǎng)基+CH (5-500mg/L) +2，4-D(O. l-20mg/L) +6-BA(O.ト5mg/L) +NAA(O.ト5mg/L);所用的繼代培養(yǎng)體系為 MS 基本培養(yǎng)基 + CH(5-500mg/L) + 2，4-D (O. 1-lOmg/L)+6-BA (O. l_5mg/L)+NAA (O. l_5mg/L) +KT (0. 1-lmg/L);分化培養(yǎng)體系為 1/4MS 基本培養(yǎng)基 + CH(5-500mg/L) + NAA(O. 5-10mg/L) + 6-BA (O. l_5mg/L) + KT (0. 1-lmg/L)。有益效果
本發(fā)明提供了ー種利用組織培養(yǎng)技術，大量、長期生產人參愈傷組織的方法，可用于從愈傷組織中提取人參活性物質作為制藥原料，以及珍稀人參種質的保藏。采用本發(fā)明方法培養(yǎng)人參獲得的愈傷組織，可以長期保持其再分化能力(達10年以上)，當把這種愈傷組織轉移到再生培養(yǎng)基上時，還能有較強的再生能力，可以形成大量與原始取材植株性狀一致的再生植株，用做人參栽培種苗。


圖I為人參愈傷組織。以人參的任意組織為外植體，經過誘導培養(yǎng)后約10天后即可產生愈傷組織，其后經過兩次繼代培養(yǎng)(毎次間隔21天)，產生大量乳黃色、致密的顆粒狀愈傷組織。圖2為完整人參再生植株將再生芽生長到I厘米以上的幼苗，轉移到生根培養(yǎng)基中，約7天后可見在長出幼苗的基部與培養(yǎng)基交接處出現根組織，再過約30天的生根培養(yǎng)，即可長成如圖所示根長度I厘米以上的完整再生植株，這種幼苗可以移栽到土壌中繼續(xù)生長。
圖3為移栽到土中成活的人參再生植株。在生根培養(yǎng)基上的幼苗，生長到具有2片以上葉片、至少5條長度3厘米以上的根時，可以再經過煉苗7-10天，然后移栽到土壌中，成為可以獨立生活的植株。
具體實施例方式采用組織培養(yǎng)方法，取人參成株的任意組織(其中以莖節(jié)的愈傷組織誘導和植株再生效率最高)作為外植體，經過滅菌、接種到誘導培養(yǎng)基，得到愈傷組織；此后多次轉接到繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，使愈傷組織的產量不斷擴大。應用本發(fā)明培養(yǎng)方法產生的愈傷組織，在多次繼代后，仍能保持旺盛的愈傷組織形成能力和較高的再生能力，在需要產生人參再生植株時，把愈傷組織轉移到誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從愈傷組織上產生大量綠點，然后形成不定芽叢，將帶有芽叢的愈傷組織塊轉接到生根培養(yǎng)基，在幼葉基部的愈傷組織中長出根，即形成再生植株；在生根培養(yǎng)基中生長到合適大小的再生植株，經過煉苗后移栽到土壤中，成為可以獨立生活的植株。具體步驟如下
愈傷組織的誘導及繼代取人參的任意組織，在超凈臺中用鋒利刀片切成3-5毫米大小的組織塊，放入50毫升三角瓶中，用70%酒精浸泡30秒、O. 1%升汞滅菌10分鐘，然后用無菌蒸餾水徹底漂洗5-6適。用無菌鑷子將組織塊轉移到成有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。每3周進行一次繼代培養(yǎng)，在超凈臺中用無菌鑷子將生長旺盛的愈傷組織從原瓶中轉移到有新鮮繼代培養(yǎng)基的三角瓶中，然后繼續(xù)25°C暗培養(yǎng)。植株再生在愈傷組織繼代培養(yǎng)2次之后的任何時候，可以取愈傷組織進行分化，本發(fā)明目前所用的愈傷組織于10年前誘導出、已經繼代超過100代，仍能保持較高的完整植株再生頻率。在超凈臺中用無菌鑷子將愈傷組織塊從繼代培養(yǎng)基上取出，轉移到含有分化培養(yǎng)基(芽再生培養(yǎng)基)的三角瓶中，在培養(yǎng)箱中25°c光培養(yǎng)(光周期16小時光照+8小時黑暗，光照強度3000LUX)。約10天以后，可見愈傷組織部分突起處出現緑色芽點，此后芽點不斷生長、延長，約2-3周后變成幼芽。將幼芽在無菌條件下轉移到含有生根培養(yǎng)基的三角瓶中，繼續(xù)光培養(yǎng)，約7天后可見幼苗的基部與培養(yǎng)基交接處出現根組織，再過約30天的生根培養(yǎng)，即可長成根長度I厘米以上的完整再生植株。煉苗及移栽打開三角瓶的封ロ膜，將三角瓶連同里面的幼苗在培養(yǎng)箱中放置3天，然后將它們放入即將栽種幼苗的溫室中3天煉苗。將幼苗完整地從培養(yǎng)基中取出，小心地除去附著在上面的愈傷組織和培養(yǎng)基碎塊，并用蒸餾水反復沖洗干凈，然后將幼苗栽入滅菌營養(yǎng)土中，注意保持環(huán)境濕度和潔凈度，2-3周后幼苗即可成活。材料
組織培養(yǎng)所用的人參外植體可以為人參的任意組織，其中以莖節(jié)的誘導、再生效果最好。所用的愈傷組織誘導培養(yǎng)體系為MS基本培養(yǎng)基+CH (5-500mg/L) +2，4-D (O. l-20mg/L)+6-BA(0. l-5mg/L)+NM(0. l_5mg/L);所用的繼代培養(yǎng)體系為 MS 基本培養(yǎng)基 + CH(5-500mg/L) + 2, 4-D (O. l-10mg/L)+6-BA(0. l-5mg/L)+NM (0. l_5mg/L) +KT (0. 1-lmg/L);分化培養(yǎng)體系為 1/4MS 基本培養(yǎng)基 + CH (5-500mg/L) + NM (O. 5-10mg/L) + 6-BA (O.ト5mg/L) + KT (O.トlmg/L)。
植物組織基本培養(yǎng)基配制按照下表中的各種元素含量配制MS基本培養(yǎng)
基權利要求
1.一種人參高效組織培養(yǎng)和再生的方法，其特征是具體步驟如下 1).愈傷組織的誘導及繼代取人參的任意組織，在超凈臺中用鋒利刀片切成3-5毫米大小的組織塊，放入三角瓶中，用70%酒精浸泡、0. 1%升汞滅菌，然后用無菌蒸餾水徹底漂洗5-6遍。
2.將組織塊轉移到成有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每3周進行一次繼代培養(yǎng)，在超凈臺中生長旺盛的愈傷組織從原瓶中轉移到有新鮮繼代培養(yǎng)基的三角瓶中，然后繼續(xù)25°C暗培養(yǎng)； 2).植株再生在愈傷組織繼代培養(yǎng)2次之后的任何時候，可以取愈傷組織進行分化，在超凈臺中將愈傷組織塊從繼代培養(yǎng)基上取出，轉移到含有分化培養(yǎng)基即芽再生培養(yǎng)基的三角瓶中，在培養(yǎng)箱中25°C光培養(yǎng)，即光周期16小時光照+8小時黑暗，光照強度為3000Lux, 10天以后，可見愈傷組織部分突起處出現綠色芽點，約2-3周后變成幼芽，將幼芽在無菌條件下轉移到含有生根培養(yǎng)基的三角瓶中，繼續(xù)光培養(yǎng)，7天后可見幼苗的基部與培養(yǎng)基交接處出現根組織，再過約30天的生根培養(yǎng)，即可長成根長度I厘米以上的完整再生植株。
3.3).煉苗及移栽打開三角瓶的封口膜，將三角瓶連同里面的幼苗在培養(yǎng)箱中放置3天，然后將它們放入即將栽種幼苗的溫室中3天煉苗，將幼苗完整地從培養(yǎng)基中取出，小心地除去附著在上面的愈傷組織和培養(yǎng)基碎塊，并用蒸餾水反復沖洗干凈，然后將幼苗栽入滅菌營養(yǎng)土中，保持環(huán)境濕度和潔凈度，2-3周后幼苗即可成活； 組織培養(yǎng)所用的人參外植體為人參的任意組織，其中以莖節(jié)的誘導、再生效果好。
4.所用的愈傷組織誘導培養(yǎng)體系為MS基本培養(yǎng)基+CH(5-500mg/L) +2，4-D (0. l-20mg/L) +6-BA (0. l_5mg/L) +NAA (0. l_5mg/L);所用的繼代培養(yǎng)體系為 MS 基本培養(yǎng)基 + CH(5-500mg/L) + 2，4-D (0. l-10mg/L)+6-BA (0. l_5mg/L)+NAA (0. l_5mg/L) +KT (0. 1-lmg/L);分化培養(yǎng)體系為 1/4MS 基本培養(yǎng)基 + CH(5-500mg/L) + NAA(0. 5-10mg/L) + 6-BA (0. l_5mg/L) + KT (0. 1-lmg/L)。
5.植物組織基本培養(yǎng)基配制按照下表中的各種元素含量配制MS基本培養(yǎng)基
全文摘要
本發(fā)明為生物技術，特別是涉及一種使人參經過長時間多次繼代培養(yǎng)后仍能保持分化再生能力技術的方法。是以人參的特定組織為外植體，其中特別以莖節(jié)為外植體產生的愈傷組織效率最高，在經過優(yōu)化的以MS培養(yǎng)基為主的培養(yǎng)體系中，經過誘導產生愈傷組織，這種愈傷組織可以在繼代培養(yǎng)基上長期旺盛生長，繼代。這種愈傷組織大量產生可供制藥使用的多種人參次生代謝產物——人參皂甙、甾醇、多糖等。而且經過長期繼代培養(yǎng)之后的愈傷組織，在轉換培養(yǎng)條件為再生培養(yǎng)基時，仍能保持高效率的芽和根再生能力，并產生大量完整再生植株，可以在到土壤中繼續(xù)栽種。
文檔編號A01H4/00GK102657095SQ20121016522
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權日2012年5月25日
發(fā)明者劉寶, 劉曉東, 龐勁松, 李樹珍, 賀紅利 申請人:東北師范大學