專利名稱：高免疫原性單純皰疹病毒gG1轉(zhuǎn)基因花生的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種高免疫原性單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生的制備方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因植物作為一種可行的表達系統(tǒng)，具有產(chǎn)物可修飾、安全、廉價、營養(yǎng)、易推廣、可進行大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是今后疫苗發(fā)展的方向。目前，已有多種病原微生物亞單位疫苗抗原在轉(zhuǎn)基因植物中表達成功，而且在動物實驗中獲得了滿意的結(jié)果。研究較多的受體植物是煙草和馬鈴薯。研究較多的亞單位疫苗抗原是乙型肝炎病毒表面抗原和人類免疫缺陷病毒包膜蛋白。在轉(zhuǎn)基因植物疫苗研究中發(fā)現(xiàn)的主要問題是機體口服后易產(chǎn)生免疫耐受性。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)能與哺乳動物細胞表面神經(jīng)節(jié)苷酯GM I結(jié) 合，具有粘膜佐劑活性。將LTB與單純皰疹病毒gGl基因都作為目的基因一起轉(zhuǎn)移到花生中表達，以發(fā)揮LTB的黏膜佐劑作用，減少了機體口服耐受性，提高了單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是植物表達量低和機體口服后易產(chǎn)生免疫耐受性。本發(fā)明根據(jù)花生密碼子的偏好性，修飾gGl和LTB基因序列，但不改變gGl和LTB氨基酸序列，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB，使gGl和LTB在花生中
聞表達。本發(fā)明公開了一種植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB，是將植物組成型啟動子CaMV35S基因、經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因、經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因、NOS終止子，分別通過EcoR I/BamH I, BamH I/Sph I, Sph I/Pst I, Pst I/Hind III 酶切位點插入到載體PCAMBIA1301中而得到；其中所述經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因序列如SEQ ID No. 12所示，所述經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因序列如SEQ ID No. I所示。本發(fā)明還公開了上述植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB在制備高免疫原性單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。一種高免疫原性單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生的制備方法，是用上述植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后篩選獲得陽性農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)基因花生轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提高了 gGl和LTB基因在花生中的表達量；運用LTB基因，其基因產(chǎn)物具有粘膜免疫佐劑作用，機體服用后能提高單純皰疹病毒gGl蛋白的免疫原性。


圖I.植物表達載體pCAMBIA1301_gGl的構(gòu)建LB :左邊界；RB :右邊界；Hyg :潮霉素抗性基因；Pro :啟動子；Ter :終止子；gus 3—半乳糖醛酸酶。
圖2.植物表達載體pCAMBIA1301-gGl-LTB的構(gòu)建LB :左邊界；RB :右邊界；Hyg :潮霉素抗性基因；Pro :啟動子；Ter :終止子；gus 3—半乳糖醛酸酶。圖3. ELISA檢測小鼠腸道洗液中的IgA圖4. ELISA檢測小鼠血清中的IgG
具體實施例方式I.修飾gGl和LTB基因序列 按花生密碼子偏好性修飾gGl和LTB基因序列，但不改變氨基酸的序列。修飾后的gGl基因序列如SEQ ID No. 12所示；gGl氨基酸序列沒有改變，如SEQID No. 13 所示。修飾后的LTB基因序列如SEQ ID No. I所示。LTB氨基酸序列沒有改變，如SEQ IDNo. 2所示。2.植物表達載體的構(gòu)建(I)植物表達載體pCAMBIAl301-gGl的構(gòu)建植物組成型啟動子CaMV35S基因、經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因、NOS終止子，以這些基因片段為模板，運用Oligo軟件設(shè)計引物，見表I。按下列反應(yīng)條件進行PCR擴增980C 5min ；98°C 10S,60°C 15S，72°C 60S，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 回收的擴增產(chǎn)物與提取載體PCAMBIA1301 (購自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司)DNA連接，得到植物表達載體pCAMBIA1301-gGl，見圖 I。表I植物表達載體pCAMBIAl301-gGl所用引物序列
引物名稱引物序列酶切位點
CaM￥35S Fl 5’ -CCGGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAMTAG-3’ ( SEQTDNo.3) 引入 EcoR I 酶切位點 Rl 5’ -TAGGATCCAGTCCCCCGTGTTCTCTCC-3’ ( SEQIDNo.4)引入 BamH I ft切位點
gGlF2 5’ -GAGGATCCATGTTGGTTCTTGTCGGTGTATCG-3’ ( SEQID No.5)引入 BamH I 酶切位點
R2 5’ -AACTGCAGTCATGGTCTCGGGGCGCGC-3' ( SEQIDNo.6)引入 Pst 1_切位點
l、u、F4 5’ -CGtXTGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCM-3' ( SEQIDNo. 10)引入 Pst I _切位點
R4 5’ -Cgcaagcttcccgatctagtaacatag-S' ( seqidno.ii) 引入 Him丨 in S每切位點(2)植物表達載體 pCAMBIAl301-gGl-LTB 的構(gòu)建植物組成型啟動子CaMV35S基因、經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因、經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因、NOS終止子，以這些基因片段為模板，運用Oligo軟件設(shè)計引物，見表2。按下列反應(yīng)條件進行PCR擴增98°C 5min ；98°C I OS，60。。15S，72°C 60S，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin0回收的擴增產(chǎn)物與提取載體pCAMBIA1301 (購自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司)DNA連接，得到植物表達載體pCAMBIA1301-gGl-LTB，見圖2。表2植物表達載體pCAMBIAl301-gGl-LTB所用引物序列
權(quán)利要求
1.一種植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB，是將植物組成型啟動子CaMV35S基因、經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因、經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因、NOS終止子，分別通過EcoR I/BamH I, BamH I/Sph I，Sph I/Pst I, Pst I/ Hind III 酶切位點插入到載體pCAMBIA1301中而得到；其中所述經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gGl基因序列如SEQ ID No. 12所示，所述經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因序列如SEQ ID No. I所示。
2.權(quán)利要求I所述植物表達載體pCAMBIA1301-Ggl-LTB在制備高免疫原性單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。
3.一種高免疫原性單純皰疹病毒gGl轉(zhuǎn)基因花生的制備方法，是用上述植物表達載體pCAMBIAl301-Ggl-LTB轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后篩選獲得陽性農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)基因花生轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物學領(lǐng)域，具體涉及一種植物表達載體及高免疫原性單純皰疹病毒gG1轉(zhuǎn)基因花生的制備方法。所述植物表達載體pCAMBIA1301-Gg1-LTB，是將植物組成型啟動子CaMV35S基因、經(jīng)修飾的單純皰疹病毒gG1基因、經(jīng)修飾的大腸桿菌LTB基因、NOS終止子，分別插入到載體pCAMBIA1301中而得到。本發(fā)明進一步提供了pCAMBIA1301-Gg1-LTB在制備高免疫原性單純皰疹病毒gG1轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。通過本發(fā)明方法提高了gG1和LTB基因在花生中的表達量；運用LTB基因，其基因產(chǎn)物具有粘膜免疫佐劑作用，機體服用后能提高單純皰疹病毒gG1蛋白的免疫原性。
文檔編號A01H5/00GK102676580SQ201210175988
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者嚴華, 嚴慧深, 紀劍峰 申請人:揚州大學