專利名稱：一種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法
技術領域：
本發(fā)明屬于海水動物增殖放流領域,具體地涉及ー種可實現(xiàn)對放流中國對蝦個體精確追溯的放流方法。
背景技術：
中國對奸(Fenneropenaeus chinensis)是我國特有的一年生大型經濟奸類,主要分布在黃渤海沿岸海區(qū)，經濟效益顯著。二十世紀八十年代以來，由于捕撈強度的不斷加大、生態(tài)變遷、水域污染、病害頻發(fā)以及人工養(yǎng)殖業(yè)對野生中國對蝦的盲目需求等綜合因素的影響，中國對蝦野生資源量急劇萎縮。為保護、恢復中國對蝦種群和漁業(yè)資源，我國于1984年開始在特定海區(qū)進行中國對蝦移殖/増殖放流，毎年放流約30億尾仔蝦。經過連續(xù)多年的大規(guī)模種苗放流，中國對蝦資源量得到了一定的恢復。不過由于無法準確區(qū)分回捕群體中放流個體和野生個體及數量，因而無法科學評估放流群體對野生資源的補充水平， 分析野生資源的動態(tài)變化并制定科學的放流規(guī)劃，這是中國對蝦放流迫切需要解決的重大問題。衡量和評估放流效果的重要指標之ー是放流回捕率估算，這是制定科學的放流規(guī)劃、有效促進野生中國對蝦種群資源恢復的重要指標。但是現(xiàn)有的檢測方法由于存在各種缺陷而無法提供精確的回捕率，主要存在以下幾個原因1)回捕樣品中無法準確區(qū)分放流和野生對蝦個體；2)放流個體的物理標記過程操作繁瑣、無法大規(guī)模進行，一般只對部分放流個體進行標記；3)物理標記對個體規(guī)格要求苛刻、標記后個體死亡率大，影響回捕率準確估算。因此，目前迫切需要ー種技術對放流群體進行大批量標志，以此為中國對蝦放流提供精確的回捕率數據。并且該技術應該具備以下特征1)放流個體攜帯特有的標識系統(tǒng)，該系統(tǒng)可精確區(qū)分野生和人工放流個體；2)攜帯該標識系統(tǒng)的個體可以大批量培育并維系個體一生，不會對標識個體具有任何內在或物理傷害；3)該標識個體可被迅速鑒別并與其它個體區(qū)分開來；4)標識個體放流不會破壞或影響野生中國對蝦群體資源結構。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法，精確評估中國對蝦放流效果和放流回捕率，推算野生群體資源量，制定科學的放流規(guī)劃、有效促進野生中國對蝦種群資源恢復。本發(fā)明所采用的放流效果評估方法符合背景技術中所列出的放流檢測所要具備的5個條件1)具有確定遺傳背景、不攜帶特定病原的中國對蝦大規(guī)模多家系苗種培育；2)中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體/家系高效精確識別；3)攜帯特定DNA分子指紋圖譜放流個體的標志放流；4)攜帶特定DNA分子指紋圖譜放流個體的大規(guī)模檢出；5)放流和野生資源及回捕率的精確計算。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法，包括以下步驟選擇確定遺傳背景、不攜帶特定病原的中國對蝦多個親本，將雌雄親本ー對一定向交尾，交尾成功的雌蝦在眼柄套上標記環(huán)后越冬培育，雄蝦眼柄標記后放置在-70°C備用，交尾雌蝦翌年進行苗種培育，放流季節(jié)對所培育的中國對蝦幼苗進行放流；秋季，在各放流洄游點進行放流個體的捕撈取樣，樣品回捕后通過中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術檢測放流個體及數量，最終確定中國對蝦的放流效果；其中所述的中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術，微衛(wèi)星引物組合及序列如下EN0033 正向序列為5 ' -CCTTGACACGGCATTGATTGG-3 '，反向序列為5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'；RS0622 正向序列為5 ' -TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3 '，反向序列為5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'；FCKR002 正向序列為5 ' -CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3 '，反向序列為5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'； FCKRO13 正向序列為5 ' -GCACATATAAGCACAAACGCTC-3 '，反向序列為5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'；PCR反應體系為25μ I反應體系，其中包括2. 5μ I 10XPCR緩沖液、四種熒光標記引物的濃度均為 ο μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13正反引物每條各為O. 5 μ I ;100ng基因組 DNA,250 μ mol/L dNTPs、2. OmmoI/L Mg2+、I 單位 Taq DNA 聚合酶；擴增程序為94°C變性4min后進行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火lmin，之后每個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)5次；隨后進行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin,72°C延伸lmin,共循環(huán)8次；再進行循環(huán)3 :94°C變性40s,64°C退火lmin,之后每個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次；進行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸5min，4°C保存并結束程序。進ー步，放流效果的確定是按如下公式計算的放流回捕率=放流個體數量/樣品總數。本發(fā)明進行個體準確追溯的原理是利用中國對蝦同一家系內個體具備相同分子指紋圖譜，在父母本已知的情況下，同一家系個體可被精確識別的特點，結合中國對蝦大規(guī)模多家系育苗，生產放流群體。秋汛回捕時，利用精確高效分子指紋圖譜分析識別，從回捕樣品中識別放流個體，計算放流個體數量和野生個體數量，從而達到精確評估放流回捕率。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果本發(fā)明對放流群體親本精心選擇，ー對一定向交尾,標記并保存好放流群體親本，為放流后回捕個體的精確追溯奠定了基礎。本發(fā)明用于回捕個體的檢測方法是中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術，利用分子指紋圖譜分析，從回捕樣品中識別放流個體，該標記為個體遺傳物質，對于放流的任意規(guī)格中國對蝦個體都能起到標識作用，且可以維系一生，不會對標記個體造成任何內在或物理損傷。并且在整個放流過程中，放流個體具備與其它個體相同的生活生態(tài)習性行、相同的洄游路線，不會比其它個體具備更明顯的生存/死亡優(yōu)勢；放流標識個體通過微衛(wèi)星四重PCR技術可被迅速鑒別并與其它個體區(qū)分開來，可以用來對回捕樣品中放流、野生群體數量及回捕率進行精確計算；且標識個體放流不會破壞或影響野生中國對蝦群體資源結構。因此本發(fā)明的方法可以準確評估中國對蝦的放流效果。
具體實施例方式實施例I :標記放流種群及方法的確立一、具有特定分子指紋圖譜中國對蝦家系個體的追溯每對父母繁育的后代都有一致的DNA分子指紋，該分子指紋為個體/家象特有而區(qū)別于其它家系和個體且維系一生。利用這種特異性的分子指紋圖譜，參照親本基因型，即可從混合群體中準確識別出特定的個體/家系。中國對蝦微衛(wèi)星在基因組中分布廣泛，遺傳變異水平豐富，具遺傳選擇中性特點。微衛(wèi)星分子標記不同基因型組合而形成的分子指紋圖譜是進行個體/家系識別的理想工具。以實驗室自主開發(fā)的中國對蝦微衛(wèi)星位點為例，大多數位點的等位基因數量在7-13個不等。在雙親已知的情況下，利用四個互不連鎖的微衛(wèi)星分子標記，每個位點的等位基因數目為10個，則理論上此四個微衛(wèi)星組成的分子指紋圖譜識別體系可以達到家系/個體排除率99. 9999%的水平。也就是說，同一家系內的 個體間其分子指紋圖譜是一致的，而區(qū)別于其它個體的分子指紋圖譜。ニ、多家系放流種群的獲得頭年秋季從海捕對蝦中挑選未交尾的雄蝦和雌蝦個體若干，一対一放置在3m3玻璃鋼桶中定向交尾。交尾成功的雌蝦眼柄標記后(即在對蝦眼柄上套上帶有標記信息的塑料環(huán))越冬培育，雄蝦眼標后放置在-70°C備用。交尾雌蝦翌年進行苗種培育，放流季節(jié)對所培育的中國對蝦幼苗進行放流。三、回捕、以及放流效果評估秋季，在各放流洄游點進行放流個體的捕撈，每個放流地點采樣數量為5000尾。每個樣品取游泳附肢采用常規(guī)酚/氯仿抽提方法進行DNA提取。然后進行熒光標記微衛(wèi)星四重PCR檢測分析。PCR反應體系為25μ I反應體系，其中包括2. 5μ I 10XPCR緩沖液、四種熒光標記引物(引物組合及序列見表I)的濃度均為10μΜ，ΕΝ0033正反引物每條各為O. 25μ 1，RS0622正反引物每條各為O. 5μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5μ 1，F(xiàn)CKR013正反引物每條各為 O. 5μ I ;100ng 基因組 DNA、250ymol/L dNTPs、2. Ommol/L Mg2+、I 單位 TaqDNA聚合酶；擴增程序為94°C變性4min后進行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火lmin，之后每個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)5次；隨后進行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)8次；再進行循環(huán)3 :94°C變性40s，64°C退火lmin，之后每個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次；進行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸5min，4°C保存并結束程序。PCR產物檢測在ABI3130測序儀(美國Applied Biosystems公司)上進行，利用GeneMapper軟件進行峰值轉化及微衛(wèi)星位點等位基因判讀。采用同樣方法對多家系父母本進行四個微衛(wèi)星位點的基因型檢測。家系親本及樣品數據分別輸入Cervus 3. O軟件中進行親本及子代個體識別，檢測樣品中放流個體數量。放流回捕率=放流個體數量/樣品總量(％)。表I.中國對蝦個體/家系識別所用微衛(wèi)星引物組合及序列
權利要求
1.一種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特征在于包括以下步驟選擇確定遺傳背景、不攜帶特定病原的中國對蝦多個親本，將雌雄親本ー對一定向交尾，交尾成功的雌蝦在眼柄套上標記環(huán)后越冬培育，雄蝦眼柄標記后放置在-70°C備用，交尾雌蝦翌年進行苗種培育，放流季節(jié)對所培育的中國對蝦幼苗進行放流；秋季，在各放流洄游點進行放流個體的捕撈取樣，樣品回捕后通過中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術檢測放流個體及數量，最終確定中國對蝦的放流效果； 所述的中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術，微衛(wèi)星引物組合及序列如下 EN0033 正向序列為5 ' -CCTTGACACGGCATTGATTGG-3 '，反向序列為5' -TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3'； RS0622 正向序列為5 ' -TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3 '，反向序列為5' -CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3'； FCKR002 正向序列為5 ' -CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3 '，反向序列為5' -AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3'； FCKRO13 正向序列為5 ' -GCACATATAAGCACAAACGCTC-3 '，反向序列為5' -CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3'； PCR反應體系為25μ I反應體系，其中包括2. 5μ I 10XPCR緩沖液、四種熒光標記引物的濃度均為10 μ Μ，ΕΝ0033正反引物每條各為O. 25 μ 1，RS0622正反引物每條各為O.5 μ 1，F(xiàn)CKR002正反引物每條各為O. 5 μ 1，F(xiàn)CKRO13正反引物每條各為O. 5 μ I ;100ng基因組 DNA,250 μ mol/L dNTPs、2. OmmoI/L Mg2+、I 單位 Taq DNA 聚合酶； 擴增程序為94°C變性4min后進行循環(huán)I :94°C變性40s，70°C退火lmin，之后每個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)5次；隨后進行循環(huán)2 :94°C變性40s，65°C退火lmin,72°C延伸lmin,共循環(huán)8次；再進行循環(huán)3 :94°C變性40s,64°C退火lmin,之后姆個循環(huán)退火溫度降低1°C，72°C延伸lmin，共循環(huán)4次；進行循環(huán)4 :94°C變性40s，61°C退火lmin，72°C延伸lmin，共循環(huán)12次；最后72°C延伸5min，4°C保存并結束程序。
2.根據權利要求I所述的ー種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法，其特征在于所述的放流效果的確定是按如下公式計算的放流回捕率=放流個體數量/樣品總數。
全文摘要
一種可對放流中國對蝦實現(xiàn)精確追溯的放流方法，屬于海水動物增殖放流領域，包括以下步驟選擇中國對蝦多個親本，將雌雄親本一對一定向交尾，交尾成功的雌蝦在眼柄套上標記環(huán)后越冬培育，雄蝦眼柄標記后放置在-70℃?zhèn)溆茫晃泊莆r翌年進行苗種培育，放流季節(jié)對所培育的中國對蝦幼苗進行放流；秋季，在洄游點捕撈取樣，樣品回捕后通過中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術檢測放流個體及數量，最終確定中國對蝦的放流效果；本發(fā)明用于回捕個體的檢測方法是中國對蝦熒光標記微衛(wèi)星四重PCR個體識別技術，利用分子指紋圖譜分析，從回捕樣品中識別放流個體，該標記為個體遺傳物質，不會對標記個體造成任何內在或物理損傷，可以準確評估中國對蝦的放流效果。
文檔編號A01K61/00GK102687692SQ20121017960
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權日2012年6月4日
發(fā)明者孔杰, 王偉繼, 金顯仕 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所