專利名稱：一株防治煙草角斑病的生防菌株pa-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株生防菌株P(guān)A-2,該菌株為銅綠假單胞桿菌iPsmdomoimsaeruginosa),能夠防治煙草角斑病,屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草角斑病是由假單胞桿菌屬丁香假單胞菌煙草致病變種\_Pseudomonassyingae pv. tabaci (Wolf et Foster.)]侵染引起的,是危害嚴(yán)重的、具有毀滅性的煙草細(xì)菌性病害之一。目前煙草角斑病已遍布亞洲、非洲、歐洲及南北美洲各地的主產(chǎn)煙區(qū)，在環(huán)境條件有利于病害發(fā)生的情況下可造成煙草絕產(chǎn)。2003 2007年,我國(guó)煙草角斑病年發(fā)病面積約3. 33萬(wàn)hm2 ,每年造成的產(chǎn)值損失2643 5782萬(wàn)元。近年，北方煙區(qū)角斑病再度流行，并成為煙草的主要病害之一(李發(fā)新、胡玉梅等編寫的《濟(jì)源市王屋煙區(qū)煙草角斑病發(fā)生原因及防控對(duì)策》，中國(guó)植保導(dǎo)刊，2008，p31 32)。目前采用輪作等農(nóng)業(yè)技術(shù)預(yù)防煙草角斑病的發(fā)生有相當(dāng)?shù)碾y度；而長(zhǎng)期大量使用化學(xué)藥劑，病原菌已產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)對(duì)煙葉出口和卷煙安全性帶來(lái)不利影響；而且國(guó)內(nèi)外尚未培育出抗角斑病的品種。因此，為經(jīng)濟(jì)有效防治煙草角斑病，生物防治成為了最直接的途徑，而篩選穩(wěn)定而高效的有益微生物是保證生物防治獲得成功的條件之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來(lái)抑制病原菌的生存和活動(dòng)，使這一防治策略發(fā)展迅速，其中生防細(xì)菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用，無(wú)論是自然發(fā)生的生物防治現(xiàn)象還是人們用于生物防治的生物類型中，細(xì)菌的作用是非常明顯的。生防細(xì)菌用來(lái)防治植物病害其主要優(yōu)勢(shì)在于1)細(xì)菌的種類和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；2)細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、生防和寄生、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響；3)具有驚人的繁殖速度；4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生態(tài)比較適應(yīng)；5)細(xì)菌大多可以人工培養(yǎng),便于控制,在實(shí)踐中易于操作；6)有些細(xì)菌不僅能防治病害而且可以增加作物的產(chǎn)量(程亮、游春平等編寫的《生防細(xì)菌的研究進(jìn)展》，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，p732 737)。綜上所述，開(kāi)發(fā)新的、更為高效和安全的菌株控制煙草角斑病的發(fā)生是提高煙草生產(chǎn)總量的需要，同時(shí)更是農(nóng)業(yè)安全可持續(xù)發(fā)展的需要，符合社會(huì)發(fā)展需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有對(duì)煙草角斑病有較好的生防菌株的現(xiàn)狀，提供一株防治煙草角斑病的單一生防菌株。本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的應(yīng)用方法。 本發(fā)明所述的假單胞桿菌，其特征在于經(jīng)鑒定該菌株(PA-2)為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aerwgifliosa),菌株已于2012年3月27日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC No. 5937。所述的生防菌PA-2(保藏號(hào)為CGMCC No. 5937)菌液，通過(guò)如下方法制備將權(quán)利要求I所述的菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5937的生防菌株P(guān)A-2在優(yōu)化培養(yǎng)液中28°C 180r/min振蕩培養(yǎng)24h，然后用無(wú)菌水進(jìn)行6倍稀釋，配成濃度約為I X IO9-I X 1010CFU/mL的菌液。上述生防菌液防治煙草角斑病的方法為PA_2菌液在煙草團(tuán)棵期噴施于煙草葉片上，每隔5d噴施一次,共噴施三次。有益效果
本發(fā)明是專門針對(duì)煙草角斑病開(kāi)發(fā)的生防菌。由于是生防菌，完全沒(méi)有因?yàn)榛瘜W(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因此有利于煙草業(yè)的無(wú)公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，減少了農(nóng)民的開(kāi)支。大田實(shí)驗(yàn)表明該菌液能顯著降低煙草角斑病的發(fā)生。培養(yǎng)24h的該菌液可以稀釋6倍后在煙草團(tuán)棵期進(jìn)行噴施處理，每隔5d噴施一次，共噴施三次。不遇暴風(fēng)雨天氣的情況下防效可以達(dá)到58. 03%，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后防效可以達(dá)到69. 77%。生物材料保藏信息
防治煙草角斑病的生防菌株P(guān)A-2,為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aeruginosa)，子2012年3月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCJi址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5937。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I能夠防治煙草角斑病的生防細(xì)菌-銅綠假單胞桿菌iPseudomonasaeruginosa) PA-2 的篩選
具體步驟如下
稗草中細(xì)菌的分離從稗草植株上用滅菌剪刀剪下約2 g放置于滅過(guò)菌的研缽中，加ImL無(wú)菌水研磨成勻漿，將勻漿10倍系列稀釋至10_ 7倍，將10_4至10_ 7稀釋液各吸取100UL涂于NA平板上，每濃度設(shè)3次重復(fù)，28°C培養(yǎng)疒3 d。挑取不同類型的菌落，在NA平板上劃線純化培養(yǎng)后，挑取單個(gè)菌落移入PDA斜面編號(hào)保存?zhèn)溆?；也可編?hào)保存于40%甘油中置-80°C冰箱中保存。細(xì)菌發(fā)酵液的制備分別挑取煙草角斑病菌和從稗草中分離到的細(xì)菌培養(yǎng)物分別放入裝50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，將三角瓶放置到恒溫振蕩培養(yǎng)箱中28°C下180r/min震蕩培養(yǎng)24h，并用無(wú)菌水配制成濃度為3 X IO8 cfu/mL的菌懸液備用。生防細(xì)菌的篩選取5 mL病原菌發(fā)酵液，加入到冷卻至55°C的100 mL滅菌NA培養(yǎng)基中，混勻，倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻成平板。用移液槍吸取70 UL待測(cè)細(xì)菌菌懸液在冷卻好的平板上劃線，以未接菌的等量NB培養(yǎng)液為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。28°C培養(yǎng)2 3d后觀察，具有一定抑菌帶寬度的即為所需要的菌株。經(jīng)篩選，得到抑菌直徑最大的菌株P(guān)A-2，抑菌帶寬為15.3 _，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞桿菌iPseudomonas aeruginosa)。該菌株已于2012年3月27日保藏在“中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC No. 5937。
菌株P(guān)A-2 (保藏號(hào)CGMCC No. 5937)的形態(tài)特征是在NA培養(yǎng)基上菌株生長(zhǎng)良好，單菌落形態(tài)為圓形或近圓形，扁平狀且周圍不規(guī)則，中等大小，表面光滑，半透明，產(chǎn)生藍(lán)綠色色素，周圍產(chǎn)生藍(lán)綠色暈圈，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的藍(lán)綠色變深，菌落表面呈現(xiàn)黏稠狀。革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀，不產(chǎn)生芽孢。經(jīng)NB培養(yǎng)液震蕩培養(yǎng)，菌液呈綠色。菌株P(guān)A-2 (保藏號(hào)CGMCC No. 5937)部分生理生化特征是革蘭氏染色為陰性，最適生長(zhǎng)溫度28°C，在4°C下不能生長(zhǎng)，41°C生長(zhǎng)良好。能夠利用葡萄糖、檸檬酸鹽，不能利用蔗糖，能夠產(chǎn)生膿青素，具有運(yùn)動(dòng)性。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表I.
權(quán)利要求
1.一株用于防治煙草角斑病的生防菌株P(guān)A-2,為銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa),該菌株已于2012年3月27日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCC No. 5937。
2.權(quán)利要求I所述的菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 5937的生防菌株P(guān)A-2在制備防治煙草角斑病的生防菌液中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生防菌液，其特征在于通過(guò)如下方法制備將權(quán)利要求I所述的菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 5937的生防菌株P(guān)A-2在優(yōu)化后的NB培養(yǎng)液和最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，然后用無(wú)菌水進(jìn)行6倍稀釋，配成濃度約為I X IO9-I X 1010CFU/mL的菌液。
4.權(quán)利要求3所述的優(yōu)化后的NB培養(yǎng)液組分為氮源1%(牛肉膏蛋白胨=3:5)，葡萄糖0. 3%, NaCl 0. 5%, KNO3 0. 3% ;最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度28°C，培養(yǎng)基pH 7. 0 7. 5，接種量4%，裝液量為250 mL三角瓶中裝液50 mL, 180 r/min震蕩培養(yǎng)24h。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一株防治煙草角斑病的生防菌株P(guān)A-2，為銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，菌株已于2012年3月27日保藏在“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”，保藏號(hào)為CGMCCNo.5937。用所述的生防菌株P(guān)A-2制備的生防菌液總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。所述的生防菌液可在防治煙草角斑病方面應(yīng)用，是一株極具研究開(kāi)發(fā)價(jià)值的菌株。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102703353SQ20121018552
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者孫劍萍, 文景芝, 楊曉敏 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)