專利名稱：一種同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多倍體水稻的誘導(dǎo)方法，特別涉及一種同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，屬于遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水稻是重要的糧食作物。雜交水稻的培育成功是水稻育種上的一項(xiàng)重大突破，對(duì)解決我國和世界糧食問題做出了巨大的貢獻(xiàn)。但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人口增加，土地面積減少以及環(huán)境的惡化，使糧食問題顯得十分突出。另據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織分析預(yù)測(cè)，到2025年世界人口將達(dá)到85億人，糧食缺口將達(dá)到8億噸。因此，要徹底解決全球糧食危機(jī)，特別是中國等發(fā)展中國家的糧食問題，雜交水稻的產(chǎn)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還必須培育出產(chǎn)量更高的優(yōu)質(zhì)新品種或新組合。
自然界廣泛存在植物多倍體現(xiàn)象，多倍體具有繁茂性、碩大性、適應(yīng)力強(qiáng)、生物產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，一直是育種家長期追求的目標(biāo)。關(guān)于水稻染色體組多倍化所導(dǎo)致的優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象的研究目前仍然處于探索性階段，其潛在的研究意義和利用價(jià)值近年來已經(jīng)引起了一些研究者的關(guān)注。在同源四倍體水稻的育種研究中，傳統(tǒng)技術(shù)主要包括物理法(冷熱刺激)、化學(xué)法(化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo))和生物法(自然變異)。其中，利用秋水仙素對(duì)種芽進(jìn)行誘導(dǎo)的方法(種芽誘導(dǎo)法)是獲得同源四倍體水稻種質(zhì)比較好的傳統(tǒng)方法。然而，在過去六十多年的研究中，同源四倍體水稻研究的技術(shù)性難題之一仍然是染色體組多倍化的誘導(dǎo)頻率太低(通常低于萬分之一)，以至于同源四倍體水稻的種質(zhì)資源相當(dāng)有限(目前全世界的同源四倍體水稻的種質(zhì)資源少于3000份，而二倍體水稻的種質(zhì)資源已經(jīng)超過200000份)。同源四倍體水稻的誘導(dǎo)頻率太低的主要原因應(yīng)該歸咎于傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)技術(shù)和稻谷種胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)。利用種芽誘導(dǎo)法獲得同源四倍體水稻的頻率低的原因主要?dú)w結(jié)于以下三方面其一，從種芽誘導(dǎo)法的技術(shù)路線來看，當(dāng)利用秋水仙素水溶液對(duì)稻谷的種芽進(jìn)行處理時(shí)，種芽的生長點(diǎn)外圍還包裹著其它的組織(如胚芽鞘、不完全葉、第一片真葉、第二片真葉等等)，這對(duì)于秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點(diǎn)并對(duì)其細(xì)胞產(chǎn)生染色體組多倍化的誘導(dǎo)作用會(huì)有很大的限制(即秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點(diǎn)細(xì)胞位置的難度加大)。其二，在種芽內(nèi)的生長點(diǎn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其中包括外圍的兩層形成層細(xì)胞和由其包圍的一群形態(tài)不規(guī)則的分生細(xì)胞。當(dāng)秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點(diǎn)細(xì)胞區(qū)域時(shí)，由于各個(gè)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)度不一致，由此導(dǎo)致某些分生細(xì)胞被誘導(dǎo)為多倍體細(xì)胞而另一些分生細(xì)胞并沒有被誘導(dǎo)為多倍體細(xì)胞。其三，在種芽內(nèi)具有不同染色體組倍性的生長點(diǎn)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)度不一致，即二倍體分生細(xì)胞在生長發(fā)育上比多倍體分生細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)，結(jié)果使二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞限制了多倍體分生細(xì)胞及其子細(xì)胞的生長發(fā)育速度，最后只能由大部分二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞完成植株的形態(tài)建成，在誘導(dǎo)當(dāng)代植株的稻穗中出現(xiàn)膨大穎花的機(jī)率很低(從種芽開始生長發(fā)育到幼穗分化，再到孕穗始穗這一段生長發(fā)育期，二倍體分生細(xì)胞比多倍體分生細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長勢(shì))。由于以上三方面原因，導(dǎo)致利用傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)法獲得同源四倍體水稻的頻率通常很低(誘導(dǎo)頻率低于0.01% )，因此通過研究尋找一種提高同源四倍體水稻的誘導(dǎo)頻率的方法，顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中同源四倍體水稻誘導(dǎo)頻率太低的問題，本發(fā)明采用種芽誘導(dǎo)和無性系技術(shù)相結(jié)合，由此建立一種多倍體水稻的誘導(dǎo)方法，尤其提供一種同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法。該方法可以顯著提高同源四倍體水稻的誘導(dǎo)頻率，以便在最短的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)制出更多的同源四倍體水稻新種質(zhì)，由此促進(jìn)水稻染色體組多倍化的研究進(jìn)程。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
在本發(fā)明所提出的誘導(dǎo)同源四倍體水稻的方法中，采用二倍體水稻種子作為外植體，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導(dǎo)愈傷組織；d.再生苗誘導(dǎo)并獲得實(shí)生苗。所述浸種催芽的過程為以二倍體水稻種子為材料，在30°C條件下浸泡48小時(shí)，每12小時(shí)清洗I次，清洗后將種子放在濕紙上催芽，直至種子露出白色芽點(diǎn)為止。所述秋水仙素水溶液處理的過程為將露出白色芽點(diǎn)的種子浸泡在0. 1%的秋水仙素水溶液中48小時(shí)，每隔12小時(shí)清洗I次，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時(shí)。所述無性系誘導(dǎo)愈傷組織的過程為將經(jīng)過消毒的帶有膨大芽的水稻種子接種在N6培養(yǎng)基上，在溫度為30°C的黑暗條件下培養(yǎng)30 35天，由此誘導(dǎo)出愈傷組織。所述再生苗誘導(dǎo)并獲得實(shí)生苗的過程為將帶有愈傷組織的培養(yǎng)瓶移至光照培養(yǎng)室，在N6培養(yǎng)基上再培養(yǎng)60 80天，待再生苗長至10 15cm時(shí)進(jìn)行實(shí)生苗煉苗處理。在試驗(yàn)中分別以IR28、IR36和新稻10號(hào)種子為外植體進(jìn)行同源四倍體水稻的誘導(dǎo)，均獲得了比較好的試驗(yàn)效果和一大批同源四倍體水稻新種質(zhì)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明涉及的同源四倍體水稻誘導(dǎo)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步(I)在傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)法中，秋水仙素水溶液滲透到種芽的生長點(diǎn)細(xì)胞位置的難度比較大，而在本發(fā)明所提出的方法中首先利用秋水仙素水溶液直接處理種芽細(xì)胞，進(jìn)而使種芽細(xì)胞很容易接觸到秋水仙素水溶液，這有助于秋水仙素對(duì)種芽細(xì)胞的誘導(dǎo)。(2)在傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)法中，種芽內(nèi)的生長點(diǎn)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，由此導(dǎo)致某些分生細(xì)胞有可能被誘導(dǎo)為多倍體細(xì)胞，而另一些分生細(xì)胞并沒有可能被誘導(dǎo)為多倍體細(xì)胞。在本發(fā)明所提出的方法中所有與秋水仙素水溶液直接接觸的種芽細(xì)胞都有可能被誘導(dǎo)為多倍體或非整倍體，進(jìn)而使得無性系接種材料中多倍體或非整倍體細(xì)胞的比例大大增力口，而二倍性細(xì)胞的比例相對(duì)減少，這有助于增加具有染色體組多倍性的愈傷組織。(3)在傳統(tǒng)的種芽誘導(dǎo)法中，種芽內(nèi)具有不同染色體組倍性的生長點(diǎn)細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)度不一致，二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞限制了多倍體分生細(xì)胞及其子細(xì)胞的生長發(fā)育速度，最后只能由大部分二倍體分生細(xì)胞所產(chǎn)生的一大批子細(xì)胞完成植株的形態(tài)建成。在本發(fā)明所提出的方法中，所有被秋水仙素水溶液誘導(dǎo)的種芽細(xì)胞在培養(yǎng)基上均具有被誘導(dǎo)為愈傷組織的可能性，一旦被脫分化為無性系則有可能分化為實(shí)生苗，這有助于提高多倍體實(shí)生苗的誘導(dǎo)頻率。由于以上三方面的技術(shù)改進(jìn)和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致利用本發(fā)明的誘導(dǎo)法獲得同源四倍體水稻的頻率通常比較高(誘導(dǎo)頻率高于3. 0% )。


圖為同源四倍體水稻無性系誘導(dǎo)法的技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例形式對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I以二倍體粳稻品種“新稻10號(hào)”為材料所進(jìn)行的同源四倍體誘導(dǎo)試驗(yàn)，技術(shù)路線如圖I所示。在這一技術(shù)體系中，首先將“新稻10號(hào)”種子置于燒杯中在30°C條件下用無菌水浸種48小時(shí)，每隔12小時(shí)用無菌水清洗I次。清洗后將種子放在濕紙上催芽48小時(shí)左右，直至種子露出白色芽點(diǎn)為止。隨后，利用0. I %的秋水仙素水溶液對(duì)試驗(yàn)材料的萌動(dòng)種芽進(jìn)行浸泡48小時(shí)(浸泡24小時(shí)后清洗I次并加入新鮮的秋水仙素水溶液)，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時(shí)，由此對(duì)種芽細(xì)胞進(jìn)行染色體組多倍化誘導(dǎo)。接著，以彭大的種芽為試驗(yàn)材料將其接種在N6培養(yǎng)基上，在溫度為30°C的黑暗條件下培養(yǎng)30 35天。由此在無性系條件下誘導(dǎo)出愈傷組織(即脫分化處理)。在這樣的愈傷組織內(nèi)包括二倍體細(xì)胞和多倍體細(xì)胞以及非整倍體細(xì)胞，它們?cè)跓o性系條件下被再分化為實(shí)生苗的機(jī)率在理論上幾乎相等。然后，經(jīng)過繼代接種后在N6培養(yǎng)基上促使愈傷組織再分化出實(shí)生苗，即將帶有愈傷組織的培養(yǎng)瓶移至光照培養(yǎng)室，在N6培養(yǎng)基上再培養(yǎng)60 80天，待再生苗長至10 15cm時(shí)進(jìn)行實(shí)生苗煉苗處理。在這些實(shí)生苗中包括二倍體和多倍體(同源三倍體和同源四倍體)以及非整倍體等，同源四倍體出現(xiàn)的頻率大大提高。經(jīng)過煉苗后將實(shí)生苗移植到田間栽種，并根據(jù)同源四倍體水稻的形態(tài)特征(植株粗壯、大穎殼、穎殼頂端長芒和結(jié)實(shí)率低等)對(duì)其進(jìn)行鑒定篩選。結(jié)果是同源四倍體水稻誘導(dǎo)頻率高于3.0%。本發(fā)明所述的N6培養(yǎng)基，其配方如下1.無機(jī)物單位mg/L 硝酸鉀2800
硫酸銨463
磷酸二氫鉀400
硫酸鎂(MgS04 7H20)185
氯化鈣(CaC12 2H20)165
乙二胺四乙酸二鈉37.3 硫酸亞鐵(FeS04 7H20)27.8
硫酸錳(MnS04 H20)4.4
硫酸鋅(ZnS04 7H20)1.5
硼酸1.6
碘化鉀0.8
2.有機(jī)物單位mg/L 維生素BI(鹽酸硫胺素)1.0 維生素B6(鹽酸吡哆醇)O.5 煙酸0.5 甘氨酸2.0 蔗糖20000
pH 值 5.8250C
用法稱取本品24. lg，加熱攪拌溶解于IOOOml蒸餾水中，分裝三角瓶115°C高壓滅菌20分鐘備用。
權(quán)利要求
1.一種同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，采用二倍體水稻種子作為外植體，其特征在于，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導(dǎo)愈傷組織；d.再生苗誘導(dǎo)并獲得實(shí)生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述浸種催芽的過程為以二倍體水稻種子為材料，在30°C條件下浸泡48小時(shí)，每12小時(shí)清洗I次，清洗后將種子放在濕紙上催芽，直至種子露出白色芽點(diǎn)為止。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述秋水仙素水溶液處理的過程為將露出白色芽點(diǎn)的種子浸泡在0. 1%的秋水仙素水溶液中48小時(shí),每隔12小時(shí)清洗I次，隨后用無菌水清洗3次后再次在濕紙上催芽24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述無性系誘導(dǎo)愈傷組織的過程為將經(jīng)過消毒的帶有膨大芽的水稻種子接種在N6培養(yǎng)基上，在溫度為 30°C的黑暗條件下培養(yǎng)30 35天，由此誘導(dǎo)出愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述再生苗誘導(dǎo)并獲得實(shí)生苗的過程為將帶有愈傷組織的培養(yǎng)瓶移至光照培養(yǎng)室，在N6培養(yǎng)基上再培養(yǎng)60 80天，待再生苗長至10 15cm時(shí)進(jìn)行實(shí)生苗煉苗處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述二倍體水稻種子為IR28、IR36或新稻10號(hào)種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同源四倍體水稻的誘導(dǎo)方法，該方法采用二倍體水稻種子作為外植體，包括以下步驟a.浸種催芽；b.秋水仙素水溶液處理；c.無性系誘導(dǎo)愈傷組織；d.再生苗誘導(dǎo)并獲得實(shí)生苗。本發(fā)明方法可以顯著提高同源四倍體水稻的誘導(dǎo)頻率，以便在最短的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)制出更多的同源四倍體水稻新種質(zhì)，由此促進(jìn)水稻染色體組多倍化的研究進(jìn)程。
文檔編號(hào)A01H1/08GK102726289SQ20121019135
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者張世萍, 黃群策 申請(qǐng)人:張世萍, 黃群策